KR101509326B1 - 유기물 및 엔도설판 분해능이 우수한 미생물 제제 및 그 제조방법 - Google Patents

유기물 및 엔도설판 분해능이 우수한 미생물 제제 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis), 또는 이들의 혼합미생물을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제에 관한 것이다. 본 발명의 미생물 제제 제조시 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis), 또는 이들의 혼합미생물을 이용함으로써 제조시간을 단축시키고, 고분자 유기물 및 엔도설판을 분해하는 분해능이 향상된 미생물 제제를 효율적으로 제조할 수 있게 된다. 또한 상기 미생물 제제는 미생물의 활성이 떨어지는 환경에서도 고분자 유기물을 분해하는 활성이 나타내므로 다양한 환경의 연안습지 복원 및 임해매립지 토양개량에 효율적으로 사용될 수 있으며, 나아가 환경복원 산업에 적용할 수 있다.

Description

유기물 및 엔도설판 분해능이 우수한 미생물 제제 및 그 제조방법{Microbial agent having degradation of organic compounds and endosulfan and method for preparation thereof}
본 발명은 유기물 및 엔도설판 분해능이 우수한 미생물 제제 및 그 제조방법에 관한 것이다.
연안습지(wetland, 연안갯벌)는 하천 유속의 감소와 조석의 간만의 차이가 크고 해안경사가 완만한 곳에서 육지로부터 운반되어온 모래, 진흙이 침전되어 생성된 지반으로, 산소가 풍부하고 유기물이 많기 때문에 어류, 게류, 새우류, 조개류, 저서생물, 염생식물 등의 다양한 생물이 서식하고 있다. 상기 생물들의 섭생, 습지의 조성 등은 오염물질을 자연 정화하는 기능, 태풍 및 홍수 등의 기후조절 기능을 하고, 농경지에 비해 약 3배에서 20배의 생산성을 가지고 있어 경제적 가치가 크며, 낚시나 휴식 및 관광 등을 제공하는 레저공간으로도 사용되고 있다.
최근 경제발전에 따라 소요되는 새로운 공업단지, 주택단지, 항만 및 공항조성 등의 용지(用地, site)가 필요하나 인구에 비하여 땅이 좁은 우리나라의 실정으로는 상기와 같은 용지를 공급하기 어려운 실정이므로 연안습지를 매립하여 이들 용지를 공급하는 국토개발사업의 일환으로 임해매립지를 조성하고 있다.
그러나 일반적으로 임해매립지 조성은 샌드펌프(sand pump)로 빨아올린 해저의 모래나 해감, 배후지역의 산비탈을 깍은 흙, 각종 건설공사에서 생겨난 굴삭잔토 및 쓰레기 등을 매립재료로 사용하여 매립하기 때문에 매립가스, 침출수에 포함된 고농도의 유기물로 인하여 갯벌의 다양한 생물들의 서식지를 파괴할 뿐만 아니라 임해매립지 주변 환경의 오염을 발생시키고, 열악한 토양의 성질로 인해 정상적인 수목생장을 기대하기 어려운 실정이므로 임해매립지를 복원하는 사업이 진행되고 있다.
임해매립지의 복원방법은 준설 및 해저 경운 등의 물리적 방법, 황토, 모래, 수산화마그네슘, 제강 슬래그, 생석회 및 굴 폐각 살포 등의 화학적 방법 및 해조류, 미생물 등의 생물학적 방법이 있다. 그러나 물리·화학적 방법은 토양정화에 많은 효과가 없거나 이로 인한 해양생태계에 2차적인 오염을 야기시키기 때문에 국·내외적으로 미생물, 염생식물 등 생물학적 방법을 이용한 갯벌복원이 이루어지고 있다.
이와 관련된 기술로, 대한민국 공개특허 제2010-0045621호는 유기물, 단백질, 지질 분해능이 우수한 산림 부식토양 및 생활하수에서 분리 동정된 신규 바실러스속 HSB801 및 바실러스속 HSB803 균주에 대하여 개시하고 있고, 대한민국 등록특허 제10-0817708호는 유기물 분해능이 우수한 갯벌에서 분리된 신규 내염성 할로모나스 속 균주, 이를 함유하는 임해매립지 토양 개량제 및 이를 이용한 식물의 생장촉진 방법에 대하여 개시하고 있으며, 대한민국 공개특허 제1998-014276호는 바실러스 섭틸리스, 니트로조모나스 유로파, 니트로박터 아길리스, 슈도모나스 아에로지노사, 슈도모나스 아에로지노사 및 셀룰로모나스 스페시스의 균주가 혼합되어 이루어진 유기성 부산물 분해능 및 악취 제거능이 우수한 부숙촉진 미생물제 및 그 제조방법에 대하여 개시하고 있다. 그러나 상기 특허문헌의 미생물들을 이용한 미생물제제는 미생물을 배양하는 시간이 오래 걸리고, 많은 미생물제제가 필요하다는 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 다양한 환경 또는 갯지렁이의 서식지로부터 분리된 미생물을 이용하여 저렴한 비용으로 간단하고 효율적으로 제조하면서, 고독성 물질인 엔도설판을 분해시킴과 동시에 다양한 고분자 유기물을 분해시키는 효능이 향상된 미생물 제제의 제조방법을 개발하고자 노력한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis), 또는 이들의 혼합미생물을 유효성분으로 포함하는 토양개량용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 미생물 제제에 적합한 배지조성물을 제공한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis), 또는 이들의 혼합미생물을 유효성분으로 포함하는 토양개량용 미생물 제제에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) 및 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis)는 연안 갯지렁이의 서식지 및 비서식지에서 생장하는 세균 중 하나이며, 다양한 고분자 유기물 및 엔도설판(endosulfan)을 분해하는 효소를 생성하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) 및 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis)는 인산염, 황산마그네슘, 황산암모늄 및 염을 기본으로 하고 유일한 탄소원으로 엔도설판(endosulfan)이 함유된 최소배지로부터 선별된 것을 특징으로 한다.
하나의 구체적 예로서, 10ppm의 엔도설판 및 3%의 염이 첨가된 BM배지에 갯지렁이가 서식하는 연안습지의 토양시료를 접종하여 배양하여 우수한 성장을 보이는 미생물을 선별하고, 상기 선별된 미생물을 고농도의 유기물 합성폐수에 접종한 결과, 우수한 생장과 유기물 및 엔도설판 분해효소를 가진 미생물을 최종 선별하였다.
하나의 구체적 양태로서, 상기 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber)는 바람직하게 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1 균주이며, 상기 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis)는 바람직하게 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3 균주이다. 이들 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1 및 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3은 한국생명공학연구원 생물자원센터에 7월 18일자로 각각 기탁번호 "KCTC 12447BP" 및 "KCTC 12448BP"로 기탁된 미생물이다.
본 발명에 있어서, 상기 토양은 염분을 포함하는 토양으로, 이의 예로는 연안습지 및 임해매립지가 있다. 또한, 상기 토양은 염분 이외에 탄소, 질소, 인, 지질 등의 다양한 유기물 또는 엔도설판을 포함할 수 있다.
또한, 상기 토양에 함유된 염분은 6.5% 이하의 염분도, 바람직하게는 0.001 내지 6%의 염분도를 가지는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물 제제는 다양한 고분자 유기물 및 고독성 물질인 엔도설판을 분해하는 활성을 가진 미생물로 이루어진 제제를 말하며, 구체적으로 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis), 또는 이들의 혼합미생물을 정제수 1,000중량부에 대하여 펩톤 1 내지 10중량부, 효모 추출물 0.01 내지 2중량부, 염화나트륨 15 내지 25중량부, 염화칼슘 0.01 내지 3중량부, 황산마그네슘 1 내지 5중량부 및 염화칼륨 0.01 내지 1중량부의 함량으로 혼합한 후, pH를 5.5 내지 9.5, 바람직하게는 pH 6.0 내지 8.0으로 조절한 배지에서 배양되어 제조되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구체적 실시에서, 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1, 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3, 또는 이들의 혼합미생물을 다양한 조성 및 함량의 배지에 접종하여 생장변화, 생균수 및 효소활성을 확인한 결과, 본 발명의 조성 및 함량을 포함하고 pH 7.0으로 조절된 배지에서 가장 빠른 시간 내에 상기 미생물의 생장이 최대로 이루어지는 것을 확인되었다.
선택적으로, 상기 배지는 탄소원이 포함될 수 있다. 탄소원은 미생물의 에너지원으로서, 미생물의 생장을 촉진시키는 물질을 말하며, 포도당(glucose), 과당(fructose), 자당(sucrose), 맥아당(maltose), 젖당(lactose), 만니톨(mannitol), 전분(starch) 및 소비톨(sobitol)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 2종 이상의 혼합물, 바람직하게는 포도당(glucose), 과당(fructose) 및 자당(sucrose)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 2종 이상의 혼합물인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis), 또는 이들의 혼합미생물의 배양은 30 내지 40℃의 온도에서 24 내지 120시간 동안 200 내지 400rpm의 교반속도로 이루어지는 것이 좋다. 상기 범위 이외의 온도, 교반속도 및 시간에서는 본 발명의 미생물 제제에 적합한 미생물이 생장되지 않아 유기물 및 엔도설판을 분해하는 활성이 크게 떨어져 최종 제조되는 미생물 제제가 제조되지 않는 문제점이 있다.
본 발명에 따른 미생물 제제는 다양한 고분자 유기물 및 엔도설판을 70 내지 95%, 바람직하게는 75 내지 85% 분해하는 효능을 가지며, 일반적인 미생물의 활성이 최적일 때의 온도보다 최소 10℃이상의 낮은 온도에서도 동일하거나 적어도 10% 이상의 유기물 및 엔도설판을 분해하는 활성을 가지는 것을 특징으로 한다.
하나의 구체적 실시에서, 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1, 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3, 또는 이들의 혼합미생물을 10,000ppm의 엔도설판이 첨가된 배양배지(펩톤 5g, 효모 추출물 1.0g, 염화나트륨 19.45g, 염화칼슘 0.55g, 황산마그네슘 3.24g 및 염화칼륨 0.6g)에 접종하여 실온 및 30 내지 40℃의 온도, pH 7.0 및 300rpm의 교반속도로 72시간 동안 배양한 미생물을 합성폐수에 첨가하여 유기물 및 엔도설판을 분해능을 측정한 결과, 유기물 및 엔도설판은 30℃ 및 37℃에서 약 80% 이상 분해하는 것을 확인하였다.
또한, 상기 배양배지에서 배양한 미생물을 5 내지 30℃의 100ppm 및 1,000ppm의 엔도설판이 첨가된 합성폐수에 첨가하여 유기물 및 엔도설판을 분해능을 측정한 결과, 20℃ 이상의 온도에서 유기물 및 엔도설판의 분해가 효율적으로 이루어지고 있을 뿐만 아니라 미생물의 활성이 떨어지는 온도인 5℃의 온도에서도 유기물 및 엔도설판의 분해가 이루어지는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 미생물 제제는 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis), 또는 이들의 혼합미생물 이외에 미생물 제제에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비타민 C, 항산화제, 황토, 포도당, 재강슬래그, 해조류 등의 부형제 및 효소안정제가 포함될 수 있다. 상기 부형제 및 효소안정제는 본 발명의 목적을 해치지 않는 범위내에서 당업자에 의해 적절한 비율로 배합될 수 있다.
본 발명의 미생물 제제는 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis), 또는 이들의 혼합미생물을 배양한 상태의 액상형태, 또는 동결건조, 열풍건조, 감압건조 등을 이용하여 건조된 건조분말형태의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis), 또는 이들의 혼합미생물은 미생물 제제의 총 조성물 중량 대비 1 내지 5중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 3중량%이다. 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis), 또는 이들의 혼합 미생물이 1중량% 미만일 경우 최종 제조되는 미생물 제제의 효능이 미약하고, 5중량%를 초과하는 경우에는 함량 증가에 따른 효과의 증가가 미약하여 비효율적이다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 미생물 제제의 제조를 위한 배지 조성물에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명의 미생물 제제는 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis), 또는 이들의 혼합미생물을 정제수 1,000중량부에 대하여 펩톤 1 내지 10중량부, 효모 추출물 0.01 내지 2중량부, 염화나트륨 15 내지 25중량부, 염화칼슘 0.01 내지 3중량부, 황산마그네슘 1 내지 5중량부 및 염화칼륨 0.01 내지 1중량부의 함량으로 혼합한 후, pH를 5.5 내지 9.5, 바람직하게는 pH 6.0 내지 8.0으로 조절한 배지에서 배양되는 것을 특징으로 한다.
선택적으로, 상기 배지는 탄소원이 포함될 수 있다. 상기 탄소원은 포도당(glucose), 과당(fructose), 자당(sucrose), 맥아당(maltose), 젖당(lactose), 만니톨(mannitol), 전분(starch) 및 소비톨(sobitol)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 2종 이상의 혼합물, 바람직하게는 포도당(glucose), 과당(fructose) 및 자당(sucrose)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 2종 이상의 혼합물인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis), 또는 이들의 혼합미생물의 배양은 30 내지 40℃의 온도에서 24 내지 120시간 동안 200 내지 400rpm의 교반속도로 이루어지는 것이 좋다. 상기 범위 이외의 온도, 교반속도 및 시간에서는 본 발명의 미생물 제제에 적합한 미생물이 생장되지 않아 유기물 및 엔도설판을 분해하는 활성이 크게 떨어져 최종 제조되는 미생물 제제가 제조되지 않는 문제점이 있다.
본 발명의 상기 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis), 또는 이들의 혼합미생물의 생장변화, 생균수 및 활성 등에 관한 내용은 상술한 바와 같으므로 이하 생략한다.
본 발명의 미생물 제제 제조시 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis), 또는 이들의 혼합미생물을 이용함으로써 제조시간을 단축시키고, 고분자 유기물 및 엔도설판을 분해하는 분해능이 향상된 미생물 제제를 효율적으로 제조할 수 있게 된다. 또한 상기 미생물 제제는 미생물의 활성이 떨어지는 환경에서도 고분자 유기물을 분해하는 활성이 나타내므로 다양한 환경의 연안습지 복원 및 임해매립지 토양개량에 효율적으로 사용될 수 있으며, 나아가 환경복원 산업에 적용될 수 있다.
도 1은 연안습지로부터 분리된 미생물인 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1, 슈도모나스 컴포스티(Pseudomonas composti) Ebht2, 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3 및 슈도모나스 컴포스티(Pseudomonas composti) Ebht4의 카제인, CM-셀룰로오스, 전분, 계면활성제 및 DNA의 가수분해효소 활성을 나타내는 콜로니를 관찰한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1의 16S rDNA 유전자 서열을 이용한 계통분리학적 분석을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 슈도모나스 컴포스티(Pseudomonas composti) Ebht2의 16S rDNA 유전자 서열을 이용한 계통분리학적 분석을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3의 16S rDNA 유전자 서열을 이용한 계통분리학적 분석을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 슈도모나스 컴포스티(Pseudomonas composti) Ebht4의 16S rDNA 유전자 서열을 이용한 계통분리학적 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 배양배지 조성물에 따른 본 발명의 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1, 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3, 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1과 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3의 혼합미생물, 및 갯벌시료에 포함되어 있는 미생물의 생장률을 측정한 결과이다.
도 7은 배양배지 조성물에 따른 본 발명의 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1, 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3, 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1과 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3의 혼합미생물, 및 갯벌시료에 포함되어 있는 미생물의 다당류, 만난 및 단백질 가수분해 효소의 활성을 측정한 결과이다.
도 8은 탄소원의 종류 및 농도에 따른 본 발명의 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1, 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3, 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1과 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3의 혼합미생물, 및 갯벌시료에 포함되어 있는 미생물의 생장률을 측정한 결과이다.
도 9는 탄소원의 종류 및 농도에 따른 본 발명의 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1, 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3, 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1과 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3의 혼합미생물, 및 갯벌시료에 포함되어 있는 미생물의 다당류, 만난 및 단백질 가수분해 효소의 활성을 측정한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1, 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3, 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1과 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3의 혼합미생물, 및 갯벌시료의 상대적 고분자 유기물 및 엔도설판의 분해능을 측정한 결과이다.
도 11은 pH에 따른 본 발명의 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1과 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3의 혼합미생물의 상대적 고분자 유기물 및 엔도설판의 분해능을 측정한 결과이다.
도 12는 온도에 따른 본 발명의 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1과 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3의 혼합미생물의 상대적 고분자 유기물 및 엔도설판의 분해능을 측정한 결과이다.
도 13은 합성폐수의 농도 및 온도에 따른 본 발명의 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1과 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3의 혼합미생물을 이용한 미생물 제제의 상대적 고분자 유기물 및 엔도설판의 분해능을 측정한 결과이다.
도 14는 온도에 따른 본 발명의 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1과 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3의 혼합미생물을 이용한 미생물 제제의 상대적 고분자 유기물 및 엔도설판의 분해능을 측정한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 미생물 제제를 위한 후보 미생물 선별
연안 갯지렁이 서식지의 갯벌시료 5g을 채취하여 10ppm의 엔도설판(endosulfan)이 함유된 BM 배지(Bacteria mineral water; 1M phosphate buffer 10mL, MgSO4·7H2O 0.25g, CaCl2·2H2O 0.02g, FeSO4·7H2O 0.02g, (NH4)2SO4 2.38g, sea salt 30g in dH2O 990ml, pH 7.0) 25ml에 접종한 후 15℃의 온도에서 일주일 동안 배양하였다. 그 다음 상기 배양액의 상층액 1ml을 새로운 BM 배지에 넣은 후 상기와 같은 방법으로 일주일 간격으로 3회에 거쳐 추가 배양을 하였다.
그 다음 10,000ppm의 엔도설판이 함유된 합성폐수(Bactopeptone 4g, glucose 0.5g, salt 7.5g in dH2O 250ml)에 상기 배양된 미생물을 접종하여 15℃의 온도에서 180rpm으로 10일 동안 세포밀도(O.D600)가 1.8이 될 때까지 배양하였다. 그 다음 총 유기탄소(Total Organic carbon, TOC) 측정기(Costech model 4010)를 이용하여 유기물 분해능을 측정하여 유기물 및 엔도설판 분해능이 우수한 4개의 미생물을 선별한 후 각각 Ebht1, Ebht2, Ebht3 및 Ebht4라 명명하였다.
실시예 2 : 미생물 제제를 위한 후보 미생물의 생장 조건 확립
2-1. 배지의 종류 따른 미생물 제제를 위한 후보 미생물의 생장
상기 실시예 1에서 선별된 후보 미생물인 Ebht1, Ebht2, Ebht3 및 Ebht4를 MA 배지(Marine agar medium, marine agar 2216, pH 7.6, Difco), LB 배지(Luria bertani medium, pH 7.0, Difco), TSA 배지(Tryptic soy agar medium, pH 7.3, Difco), NA 배지(Nutrient agar medium, pH 6.8, Difco) 및 R2A 배지(R2A agar medium, pH 7.2, Difco)에 접종하여 30℃의 온도에서 3일 동안 배양한 후 생장 효율을 확인하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
균주 배지
MA LB TSA NA R2A
Ebht1 + + + + +
Ebht2 + + + + +
Ebht3 + + + + +
Ebht4 + + + + +
실험 결과, 상기 표 1에서 보는 바와 같이 모든 배지에서 상기 미생물 제제를 위한 후보 미생물들의 생장이 잘 이루어지는 것을 확인하였다.
2-2. 배양 온도에 따른 후보 미생물의 생장
상기 실시예 1에서 선별된 후보 미생물인 Ebht1, Ebht2, Ebht3 및 Ebht4를 MA 배지에 접종하여 4, 10, 20, 25, 30, 37, 42 및 45℃의 온도에서 3일 동안 배양한 후 생장 효율을 확인하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
균주 배양 온도(℃)
4 10 20 25 30 37 42 45
Ebht1 - + + + + + + -
Ebht2 - + + + + + - -
Ebht3 - + + + + + - -
Ebht4 - + + + + + - -
실험 결과, 상기 표 2에서 보는 바와 같이 Ebht1은 10 내지 42℃의 온도에서 생장하였고, Ebht2, Ebht3 및 Ebht4는 10 내지 37℃의 온도에서 생장하는 것을 확인하였다.
2-3. 배지의 pH에 따른 미생물 제제를 위한 후보 미생물의 생장
상기 실시예 1에서 선별된 후보 미생물인 Ebht1, Ebht2, Ebht3 및 Ebht4를 pH3.0 내지 pH11의 pH를 가지는 MA 배지에 접종하여 30℃의 온도에서 3일 동안 배양한 후 생장 효율을 확인하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
균주 pH
3.0 3.5 4.0 4.5 5.5 6.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10 10.5 11
Ebht1 - - - - + + + + + + - - -
Ebht2 - - - + + + + + + + + - -
Ebht3 - + + + + + + + + + - - -
Ebht4 - - + + + + + + + + + + -
실험 결과, 상기 표 3에서 보는 바와 같이 Ebht3은 pH 3.5 내지 pH 9.5 조건의 배지에서 생장하였고, Ebht1, Ebht2 및 Ebht4는 미생물에 따라 약간의 차이가 있었으나 모두 pH 5.5 내지 pH 9.5 조건의 배지에서 생장하는 것을 확인하였다.
2-4. 염분도에 따른 미생물 제제를 위한 후보 균주의 생장
상기 실시예 1에서 선별된 미생물 제제를 위한 후보 균주인 Ebht1, Ebht2, Ebht3 및 Ebht4를 0 내지 9%의 염분도를 포함하는 LB 배지에 접종하여 30℃의 온도에서 3일 동안 배양한 후 생장 효율을 확인하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
균주 염분도(%)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Ebht1 + + + + + + + + + + -
Ebht2 + + + + + + + - - - -
Ebht3 + + + + + + + - - - -
Ebht4 + + + + + + + + - - -
실험 결과, 상기 표 4에서 보는 바와 같이 Ebht1는 0 내지 9%의 염분을 포함하는 배지에서 생장하였고, Ebht2, Ebht3 및 Ebht4는 균주에 따라 약간의 차이가 있었으나 모두 0 내지 6%의 염분을 포함하는 배지에서 생장하는 것을 확인하였다.
실시예 3 : 미생물 제제를 위한 후보 미생물의 다양한 유기물 분해 활성 측정
카제인(Casein, Difco), CM-셀룰로오스(CM-cellulose, Sigma-Aldrich), 전분(Starch, Sigma-Aldrich) 및 계면활성제(Tween 20, 40, 60 및 80, Sigma-Aldrich)가 1%의 농도로 포함된 MA 고체배지에 상기 실시예 1에서 분리한 Ebht1, Ebht2, Ebht3 및 Ebht4를 접종한 후 30℃의 온도에서 배양한 후 효소활성을 조사하였다. 또한, DNA가 함유된 고체배지에 상기와 같은 조건으로 배양한 후 효소활성을 조사하였다.
구체적으로, 카제인 및 계면활성제가 포함된 LB 고체배지에 상기 실시예 1에서 분리한 균주를 접종한 후 30℃의 온도에서 각각 2일, 3일 동안 배양한 후 투명환의 형성을 관찰하였다. 또한, CM-셀룰로오스 및 전분이 포함된 MA 고체배지에 상기 실시예 1에서 분리한 미생물 균주를 접종한 후 30℃의 온도에서 3일 동안 배양한 후 각각 콩고레드(Congo red) 및 아이오딘(iodine)으로 30분 동안 염색한 후 1M NaCl을 5분 동안 처리하여 형성된 투명환의 형성을 관찰하였다. 그 결과를 도 1 및 표 5에 나타내었다.
미생물 균주 카제인 CM-셀룰로오스 전분 DNA 분해효소 계면활성제
20 40 60 80
Ebht1 - + + + - + + +
Ebht2 - + + + + + + +
Ebht3 - + + + + + + +
Ebht4 - + + + + + + +
+ : 미생물 균주 생장, - : 미생물 균주 생장하지 않음
실험 결과, 도 1 및 표 5에서 보는 바와 같이 실시예 1에서 분리한 Ebht1, Ebht2, Ebht3 및 Ebht4는 셀룰로오스, 전분, DNA 분해효소 및 계면활성제가 첨가된 LB 고체배지에서 생장하는 것으로 확인되었다. 이는 섬유소 분해효소(Cellulase), 탄수화물 분해효소(Amylase), DNA 분해효소(DNase) 및 지질분해효소(Lipase) 등을 생성하여 다양한 유기물을 분해할 수 있는 효소 활성을 가지는 것으로 확인되었다.
실시예 4 : 유기물 분해능이 우수한 균주의 유전학적 특성 분석
상기 실시예 1에서 선별된 유기물 분해능이 우수한 균주를 50ml 튜브에 담고 세포용해용액(500mM EDTA, pH 9.4) 75㎕를 첨가하여 1분 동안 액체 질소에 담근 후 바로 60℃의 온도에서 녹이는 과정을 4번 반복하였다. 그 다음 페놀/클로로포름(phenol/chloroform) 용출기법을 이용하여 총 게놈성 DNA(genomic DNA)를 분리하였다. 상기 분리한 총 게놈성 DNA(genomic DNA, 50ng)를 주형으로 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') 프라이머와 1522R(5'-AAG GAG GTG ATC CAR CGC A-3') 프라이머를 사용하여 95℃의 온도에서 5분 동안 변성시킨 후, 95℃의 온도에서 1분, 55℃의 온도에서 1분 및 72℃의 온도에서 1분 주기로 33회 수행하고 마지막에는 72℃의 온도에서 10분 동안 반응시키는 조건으로 중합효소연쇄반응(Polymerrase chain reaction, PCR)을 통해 16S rRNA를 증폭시켰다. 그 다음 상기 증폭된 16S rRNA를 pGEM-T 벡터에 삽입한 후 JM109 E.coli에 형질전환한 후 형질전환된 클론을 선별하였다. 그다음 T7 promoter 프라이머와 SP6 promoter 프라이머를 이용하여 16S rRNA 염기서열을 분석을 하였다. 그 결과를 도 2, 도 3, 도 4 및 도 5에 나타내었다.
실험 결과, 유기물 분해능이 우수한 Ebht1는 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) 16S rRNA의 염기서열과 99.3% 일치, Ebht2는 슈모모나스 컴포스티(Pseudomonas composti) 16S rRNA의 염기서열과 98.0% 일치, Ebht3는 슈도모나스 타이완에시스(Pseudomonas taiwanensis) 16S rRNA의 염기서열과 98.8% 일치, Ebht4는 슈모모나스 컴포스티(Pseudomonas composti) 16S rRNA의 염기서열과 98.3% 일치하는 것으로 확인되었다.
실시예 5 : 유기물 분해능이 우수한 균주의 생화학적 특성 분석
상기 실시예 1에서 선별된 Ebht1, Ebht2, Ebht3 및 Ebht4를 LBSS 고체배지에 접종하여 25℃의 온도에서 3일 동안 배양하였다. 그 다음 상기 배양된 미생물들을 3% 해염(sea salt)에 현탁하여 API 20 NE kit(BioMerieux) 및 API ZYM Kit(BioMerieux)를 이용하여 효소의 특징 및 기질 동화능력을 조사하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.
효소의 특성 Ebht1 Ebht2 Ebht3 Ebht4
질산염 환원 - + + +
인돌 생산 - - + +
글루코오스 산성화 - - - -
아르기닌 수해효소 - - - -
우레아제 - - - -
에스큘린 가수분해 - + + -
젤라틴 가수분해 - - + +
β-갈락토시다아제 - + + -
글루코오스 - + + -
아라비노오스 - - + -
만노오스 - - + -
마니톨 + - + +
N-아세틸-글루코사민 - - + -
말토오스 - + + -
글루코네이트 + - + -
카프르산염 - - - -
아디페이트 - - - -
말레이트 + - + -
시트르산염 + - + -
페닐-아세테이트 - - + -
알칼라인 포스퍼테이트 - + + +
에스테라아제(C4) + + + +
에스테라아제 리파아제(C8) + + + +
리파아제(C14) - - - -
류신 아릴아미다제 + + + +
발린 아릴아미다제 - - - -
시스테인 아릴아미다제 - - + -
트립신 - - - -
α-키모트립신 - - - -
애시드포스퍼테아제 + + + +
나프톨-AS-Bi-포스포하이드롤라아제 + + + +
α-갈락토시다아제 - - + -
β-갈락토시다아제 - - + -
β-글루쿠로니다아제 - - - -
α-글루코시다아제 - - + -
β-글루코시다아제 - - + -
N-아세틸-베타-글루코사미니다아제 - + + -
α-만노시다아제 - - + -
실험 결과, 상기 표 6에서 보는 바와 같이 Ebht1 및 Ebht3은 Ebht2 및 Ebht4에 비하여 보다 다양한 탄소원에 대한 활성을 나타내고, Ebht2, Ebht3 및 Ebht4는 질산염 환원에 대하여 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서 Ebht2 및 Ebht4는 유기물 분해를 위한 미생물제제를 위한 균주로서 기능에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타나 Ebht1, Ebht3 및 Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물을 미생물 제제를 위한 미생물로 최종 선별하였다. 또한, 이들 Ebht1 및 Ebht3은 신규 미생물이므로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2013년 07월 18일자로 기탁번호 KCTC 12447BP 및 KCTC 12448BP으로 기탁하였다.
실시예 6 : 미생물 제제의 제조를 위한 미생물의 배양배지 조건 확립
6-1. 미생물 제제의 제조를 위한 미생물의 배양배지 조건 확립
상기 실시예 5에서 선별한 Ebht1, Ebht3, Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물, 및 갯벌시료를 하기 표 7의 마린액체배지(Marine broth, pH 6.8~7.2) 성분 및 함량으로 37℃의 온도에서 300rpm으로 40시간 동안 배양하였다. 그 다음 4시간 마다 흡광도(O.D.600)를 측정하였고, 배양이 완전히 끝난 후 0.85% 염화나트륨 용액에 희석하여 MA 배지에 도말하여 37℃의 온도에서 48시간 동안 배양한 후 생균수를 측정하였다. 그 결과를 도 6, 표 7 및 표 8에 나타내었다.
조성 단위 : g/L
대조군 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
펩톤 5.0 5.0 5.0 5.0 - 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
효모 추출물 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
구연산 철 0.1 - - - - - - - - -
염화나트륨 19.45 19.45 5.0 19.45 5.0 5.0 5.0 5.0 19.45 -
염화마그네슘 5.9 - - - - - - - - -
황산마그네슘 3.24 3.24 3.24 6.48 - 0.2 0.02 0.2 3.24 3.24
황산마그네슘(Ⅱ) - 5.9 5.9 11.8 - - 0.025 0.1 - 5.9
염화칼슘 1.8 - - - - - - - - -
염화칼륨 0.55 - - - - 0.45 - - 0.55 -
탄산수소나트륨 0.16 - - - - - - - - -
브롬화칼륨 0.08 - - - - - - - - -
염화스트론튬 0.034 - - - - - - - - -
붕산 0.022 - - - - - - - - -
규산나트륨 0.0004 - - - - - - - - -
플루오린화나트륨 0.0024 - - - - - - - - -
질산암모늄 0.0016 - - - - - - - - -
인산나트륨 0.0008 - - - - - - - - -
염화철 - 0.55 - 0.55 - 0.005 - - - -
시험군 균수(CFU/ml)
Ebht1 Ebht3 Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물 갯벌시료
대조군 7.96 8.30 7.45 7.2
T1 7.78 7.69 7.83 7.45
T2 8.12 6.60 8.20 6.81
T3 7.81 7.95 7.26 7.12
T4 7.84 8.16 7.00 6.78
T5 8.02 8.33 8.41 7.47
T6 8.03 8.38 6.70 6.58
T7 7.85 8.37 8.30 7.36
T8 8.28 8.32 8.49 7.87
T9 7.84 6.79 6.78 6.23
실험 결과, 도 6에서 보는 바와 같이 흡광도는 염화철이 포함되어 있는 T1 및 T3에서 대조군 보다 높게 나타났으며, 나머지 시험군인 T2, T4, T5, T6, T7, T8 및 T9는 대조군보다 낮게 나타났으며, 각 균주의 생장속도는 단일 균주인 Ebht1와 Ebht3은 배양 20시간대에 가장 높은 생장율을 보였으며, Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물은 배양 15시간대에서 가장 높은 생장율을 보이는 것으로 확인되었다.
또한, 표 8에서 보는 바와 같이 배지 조성물에 따른 각 균주의 생균수는 T8에서 가장 높은 균수가 측정되었고, T1, T2 및 T3은 대조군보다 낮은 생균수가 측정되었다.
6-2. 배지조성에 따른 미생물의 효소 활성도 측정
상기 실시예 5에서 선별한 Ebht1, Ebht3, Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물, 및 갯벌시료를 상기 표 7의 조성 및 함량으로 구성된 배지에 접종하여 배양한 후 다당류 가수분해효소(amylase), 만난 가수분해효소(mannase) 및 단백질 가수분해효소(protease)의 활성을 측정하였다.
구체적으로, 먼저 다당류 가수분해효소의 활성은 상기 배양한 미생물에 1% 전분(Daejung, Korea) 500㎕, 0.5M 구연산나트륨(Shinyo, Japan) 100㎕를 혼합한 후 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 만난 가수분해효소의 활성은 상기 배양한 균주에 0.5% 로거스트빈검(locust bean gum) 용액 1ml과 0.2M 시트르산(citrate, pH 5.6) 용액 750㎕를 혼합한 후 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 단백질 가수분해효소의 활성은 상기 배양한 미생물에 5% 아조카제인(azocasein, sigma, USA) 50㎕와 0.5M 트리스용액(Tirs buffer) 20㎕를 혼합한 후 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 그 다음 상기 원심분리한 상층액 100㎕와 증류수 300㎕를 혼합한 후 50℃ 항온기에서 30분 동안 반응시켰다. 그 다음 상기 반응물에 3,5-디니트로살리실산(DNSm Alfaaesar, USA)용액 3ml과 0.1% 글루코오스 100㎕를 첨가하여 5분 동안 끓는 물에 중탕한 후 상온에서 식힌 다음 자외선 분광광계도(UV-Spectrophotometer, Biochrom, UK)를 이용하여 다당류 가수분해효소 및 만난 가수분해효소 활성은 540nm로, 단백질 가수분해효소 활성은 440nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
실험 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, 다당류, 만난 및 단백질 가수분해효소의 활성은 T5 및 T6를 제외한 나머지 시험군은 대조군보다 높은 효소활성을 가지며, 특히 T8의 조성물에서 배양된 Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물의 효소 활성도가 가장 높음을 확인하였다.
실시예 7 : 탄소원 공급에 따른 미생물의 생장변화
7-1. 탄소원 공급에 따른 미생물의 생장 변화 측정
상기 표 7에서 T8의 조성 및 함량의 배지에 포도당(glucose, Daejung, Korea), 과당(fructose, Daejung, Korea), 자당(sucrose, Daejung, Korea)을 0, 1, 2 및 4%의 농도로 첨가한 후 상기 실시예 5에서 선별한 Ebht1, Ebht3, Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물, 및 갯벌시료를 접종하여 배양하여 미생물의 생장변화를 측정하였다. 대조군으로 탄소원을 첨가하지 않은 균주를 사용하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
실험 결과, 도 8에서 보는 바와 같이 Ebht1은 대조군과 자당을 2% 첨가하였을 때 배양 22시간대에서 가장 높은 생장 변화가 관찰되었고, Ebht3 및 Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물의 생장곡선은 과당을 1% 및 2% 첨가하였을 때 배양 10시간대에서 높은 생장변화가 관찰되었다. 또한 갯벌시료 배양의 결과, 과당을 2% 첨가하였을 때 8시간대에서 급격한 생장변화가 관찰되었다.
7-2. 과당 공급에 따른 미생물의 효소활성 측정
상기 실시예 5에서 선별한 Ebht1, Ebht3, Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물, 및 갯벌시료를 과당 2%가 첨가된 상기 표 7의 T8 배지에 접종하여 배양한 후 다당류 가수분해효소(amylase), 만난 가수분해효소(mannase) 및 단백질 가수분해효소(protease)의 활성을 상기 실시예 6-2와 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
실험 결과, 도 9에서 보는 바와 같이 배양 초기에 매우 높은 다당류 가수분해효소와 만난 가수분해효소의 농도가 확인되었으며, 시간의 경과에 따라 미생물이 증식함에 따라 효소의 활성이 감소하는 것을 확인하였다.
7-3. 과당 공급에 따른 미생물의 생균수 측정
상기 실시예 5에서 선별한 Ebht1, Ebht3, Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물, 및 갯벌시료를 과당 2%가 첨가된 상기 표 7의 T8 배지에 접종하여 배양한 후 0.85% 염화나트륨 용액에 희석하여 MA 배지에 도말하여 37℃의 온도에서 48시간 동안 배양한 후 생균수를 측정하였다. 대조군으로 상기 표 7의 대조군 배지 및 T8 배지에 접종하여 배양한 균주를 사용하였다. 그 결과를 표 9에 나타내었다.
시험군 균수(CFU/ml)
Ebht1 Ebht3 Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물 갯벌시료
대조군 7.96 8.30 7.45 7.2
T8 8.28 8.32 8.49 7.87
T8 + 2% 과당 8.03 7.84 8.38 7.07
실험 결과, 대조군과 대량생산용 배지인 T8의 생균수보다 2%의 과당을 첨가한 배지의 생균수가 향상되었음을 확인하였다.
실시예 8 : 본 발명에 따른 미생물의 유기물 및 엔도설판 분해능 측정
8-1. 본 발명에 따른 미생물의 유기물 및 엔도설판 분해능 측정
상기 실시예 5에서 선별한 Ebht1, Ebht3 및 Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물을 10,000ppm의 엔도설판이 첨가된 합성폐수(Bactopeptone 4g, glucose 1g, salt 7.5g in dH2O 250ml)에 상기 배양된 미생물을 접종하여 30℃의 온도에서 180rpm으로 120시간 동안 배양하였다. 그 다음 총 유기탄소(Total Organic carbon, TOC) 측정기(Costech model 4010)를 이용하여 유기물 및 엔도설판 분해능을 측정하였다. 대조군으로 갯벌시료를 사용하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
실험 결과, 선별한 Ebht1, Ebht3 및 Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물은 유기물 및 엔도설판을 효율적으로 분해하며, 단일 균주인 Ebht1 또는 Ebht3에 비하여 Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물의 유기물 및 엔도설판 분해능이 우수한 것을 확인하였다.
8-2. pH에 따른 Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물의 유기물 및 엔도설판 분해능 측정
상기 실시예 5에서 선별한 Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물을 pH 3.5, pH 7.0, pH 9.5를 띠는 10,000ppm의 엔도설판이 첨가된 합성폐수(Bactopeptone 4g, glucose 1g, salt 7.5g in dH2O 250ml)에 상기 배양된 미생물을 접종하여 실온(14~20℃), 30℃의 온도에서 180rpm으로 120시간 동안 배양하였다. 그 다음 총 유기탄소(Total Organic carbon, TOC) 측정기(Costech model 4010)를 이용하여 유기물 분해능을 측정하였다. 대조군으로 갯벌시료를 사용하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
실험 결과, pH 7.0일 때 비교적 높은 유기물 분해 효율을 나타내나, pH 3.5에서 유기물 분해 효율이 크게 떨어지는 것으로 확인되었다.
8-3. 온도에 따른 Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물의 유기물 분해능 측정
상기 실시예 5에서 선별한 Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물을 10,000ppm의 엔도설판이 첨가된 합성폐수(Bactopeptone 4g, glucose 1g, salt 7.5g in dH2O 250ml)에 상기 배양된 미생물을 접종하여 10℃, 30℃ 및 37℃의 온도에서 180rpm으로 120시간 동안 배양하였다. 그 다음 총 유기탄소(Total Organic carbon, TOC) 측정기(Costech model 4010)를 이용하여 유기물 분해능을 측정하였다. 대조군으로 갯벌시료를 사용하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
실험 결과, 30℃의 온도에서 가장 높은 유기물 분해 효율을 나타냈으나, 10℃의 온도에서 유기물 분해 효율이 크게 떨어지는 것으로 확인되었다.
실시예 9 : Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물을 이용한 미생물 제제의 유기물 분해능 측정
9-1. Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물을 이용한 미생물 제제 제조
하기 표 10의 조성 및 함량을 포함하는 대량생산용 배지 5ℓ를 121℃의 온도에서 15분 동안 멸균하여 배지로 사용하였다.
먼저, 상기 실시예 5에서 선별한 Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물 2%를 상기 대량생산용 배지에 접종하여 37℃, pH 7, 교반속도 300rpm 및 20%의 용존산소농도를 유지하여 48시간 동안 배양하여 미생물 제제를 제조하였다.
펩톤 효모추출물 염화나트륨 황산마그네슘 염화칼륨 과당
단위(g/L) 5.0 1.0 19.45 3.24 0.55 0.2
9-2. 환경조건에 따른 미생물 제제의 유기물 분해능 측정
상기 실시예 9-1에서 제조된 미생물 제제를 100 및 1,000ppm의 엔도설판이 첨가된 합성폐수(Bactopeptone 4g, glucose 1g, salt 7.5g in dH2O 250ml)에 접종하여 5 내지 30℃의 온도에서 180rpm으로 14일 동안 반응시켰다. 그 다음 총 유기탄소(Total Organic carbon, TOC) 측정기(Costech model 4010)를 이용하여 2일 간격으로 유기물 및 엔도설판 분해능을 측정하였다. 그 결과를 도 13 및 표 11에 나타내었다.
합성폐수 농도(ppm)
100 1,000
5℃ 10℃ 15℃ 20℃ 25℃ 30℃ 5℃ 10℃ 15℃ 20℃ 25℃ 30℃
0일 187.8 191.2 204.6 194.0 194.0 194.0 531.8 528.7 579.8 499.1 499.1 499.1
2일 185.2 190.8 206.6 194.1 134.7 105.2 568.1 526.3 529.8 546.9 333.9 359.9
4일 185.4 185.4 172.5 184.3 88.9 56.8 550.2 515.8 513.5 359.0 199.7 267.3
6일 177.4 141.7 127.8 133.4 69.7 38.2 545.3 529.3 357.4 294.0 108.4 201.3
8일 151.9 126.3 85.3 121.2 46.3 23.8 543.0 472.8 321.6 216.0 82.7 172.6
10일 152.2 125.2 78.4 116.0 39.2 20.4 471.3 469.8 248.9 213.0 82.3 153.2
12일 135.5 123.6 51.8 98.9 33.2 17.9 472.7 438.0 222.8 180.4 71.1 124.8
14일 115.0 115.1 35.0 77.6 32.9 17.5 461.9 370.3 193.4 170.4 67.1 98.6
실험 결과, 100 ppm 농도의 엔도설판이 첨가된 합성폐수에 Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물을 이용하였을 때, 30℃의 온도에서 12일째 90% 이상의 유기물이 제거되었고, 25℃의 온도에서는 약 83%, 20℃의 온도에서는 약 50%, 15℃의 온도에서는 약 75%, 10℃의 온도에서는 약 35%, 그리고 5℃의 온도에서는 약 28%의 유기물이 제거되는 것으로 확인되었다.
또한, 1000 ppm 농도의 엔도설판이 첨가된 합성폐수에 Ebht1과 Ebht3의 혼합미생물을 이용하였을 때, 30℃의 온도에서 14일째 80% 이상의 유기물이 제거되었고, 25℃의 온도에서 약 87%, 20℃의 온도에서 약 66%, 15℃의 온도에서 약 60%, 10℃의 온도에서 약 17%, 그리고 5℃의 온도에서 약 13%의 유기물이 제거되는 것으로 확인되었다. 이러한 결과로 미루어보아 20℃ 이상의 온도에서 유기물 제거가 매우 효율적으로 이루어지고 있을 뿐만 아니라 대부분의 미생물의 활성이 떨어지는 5℃에서도 유기물 분해능이 이루어지는 것으로 확인되었다.
9-3. 미생물 제제의 유기물 및 엔도설판 분해능 측정
상기 실시예 9-1에서 제조된 미생물 제제를 10,000ppm의 엔도설판이 첨가된 합성폐수(Bactopeptone 4g, glucose 1g, salt 7.5g in dH2O 250ml)에 접종하여 실온(14~20℃), 30℃ 및 37℃의 온도에서 180rpm으로 14일 동안 배양하였다. 그 다음 총 유기탄소(Total Organic carbon, TOC) 측정기(Costech model 4010)를 이용하여 유기물 분해능을 측정하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.
실험 결과, 실온, 30℃ 및 37℃의 온도에서 배양하여 제조한 미생물 제제는 유기물 및 엔도설판을 제거하는 효능이 우수하고, 배양 12일째 약 78%의 유기물 및 엔도설판을 제거하는 것을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC12447BP 20130718 한국생명공학연구원 KCTC12448BP 20130718

Claims (13)

  1. 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1(KCTC 12447BP), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3(KCTC 12448BP), 또는 이들의 혼합미생물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 토양개량용 미생물 제제.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1(KCTC 12447BP) 및 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3(KCTC 12448BP)는 인산염, 황산마그네슘, 황산암모늄 및 염을 기본 배지로 하고, 엔도설판이 함유된 최소배지에서 선별된 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 토양은 6.5% 이하의 염분도를 포함하는 연안습지 및 임해매립지인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  6. 제1항에 있어서, 상기 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1(KCTC 12447BP), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3(KCTC 12448BP), 또는 이들의 혼합미생물은 정제수 1,000중량부에 대하여 펩톤 1 내지 10중량부, 효모 추출물 0.01 내지 2중량부, 염화나트륨 15 내지 25중량부, 염화칼슘 0.01 내지 3중량부, 황산마그네슘 1 내지 5중량부 및 염화칼륨 0.01 내지 1중량부의 함량으로 혼합한 후, pH를 5.5 내지 9.5로 조절한 배지에서 배양되는 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  7. 제6항에 있어서, 상기 배지는 포도당, 과당, 자당, 맥아당, 젖당, 만니톨, 전분 및 소비톨로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 2종 이상의 혼합물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  8. 제6항에 있어서, 상기 배양은 30 내지 40℃의 온도에서 24 내지 120시간 동안 200 내지 400rpm의 교반속도로 이루어지는 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  9. 제1항에 있어서, 상기 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1(KCTC 12447BP), 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3(KCTC 12448BP), 또는 이들의 혼합미생물은 미생물 제제의 총 중량 대비 1 내지 5중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 엔도설판 분해능을 갖는 로도코쿠스 루버(Rhodococcus ruber) Ebht1(기탁번호 KCTC 12447BP).
  13. 엔도설판 분해능을 갖는 슈도모나스 타이와네시스(Pseudomonas taiwanensis) Ebht3(기탁번호 KCTC 12448BP).
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