CN108239612B - 涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)菌株X35及其应用 - Google Patents

涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)菌株X35及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株新分离的涅斯捷连科氏菌属菌株X35及其在食品、环保、制药、发酵工业、农业生产等方面的应用。本发明的菌株X35耐盐、耐碱，且能够产生稳定的酶活高的木聚糖酶。

Description

涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)菌株X35及其应用
技术领域
本发明涉及一株新分离的涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)菌株X35及其在食品、环保、制药、发酵工业、农业生产等方面中的应用。
背景技术
1997年Stackebrandt等[4]提出具有普通细菌形态的高G+C含量的革兰氏阳性球菌和杆菌与传统的放线菌一起同属于放线细菌纲(Actinobacteria classis)这一新的分类体系。随着现代实验技术的不断提高，放线菌尤其是具普通细菌形态的放线细菌的研究高速发展，每年都有多个新的种、属被发现。到2003年止，在Actinobacteria classis已发现的近160余个属中，有近一半是具有普通细菌形态的。
在盐湖、盐碱地等高盐高碱条件下生长的微生物，由于有极为特殊的生理结构、代谢机制和遗传基因，能产生多种具独特生物活性的物质，可应用于生物环保、食品、制药、发酵工业、农业生产等方面，因而引起人们的广泛关注[5]，现已成为国际、国内研究的热门领域，而高盐碱环境中的放线细菌不但是研究生物进化和系统发育的极好材料，而且是一类极具开发前景的微生物资源。
嗜盐微生物是指在高盐条件下生长的细菌，它主要生长在盐湖、死海、盐场等浓缩海水中，以及腌鱼、盐兽皮等盐制品上。嗜盐微生物作为一类新型的、极具应用前景的微生物资源，近年来受到人们的广泛关注。理论研究方面，由于该类生物长期生活在高盐环境下，形成了具有极为特殊的细胞结构和生理机能[6]，故其嗜盐机制、细胞结构和特殊的生理机能是研究者们感兴趣的话题。实际应用方面，嗜盐菌在盐田中的应用，有利于提高原盐产量[7]；在高盐度废水处理和生物降解石油烃、有机磷和重金属等污染物中也具有广阔的应用前景[8，9]。
已知涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)是放线杆菌纲、微球菌亚目、微球菌科中的一个属，该属菌株被描述为专性好氧的中度嗜盐菌，多为球状或短杆状，偶尔可见分支[2,3]。该属已有2个有效发表种: 喜盐涅斯捷连科氏菌(N.halobia)和回音湖涅斯捷连科氏菌(N.lacusekhoensis)[1]。但目前国内外对涅斯捷连科氏菌属的微生物的相关报道相对较少，该属的其他菌株及其生物学特性还有待发现和研究。
发明内容
本发明提供了一株新分离的涅斯捷连科氏菌属菌株X35。
本发明还提供了本发明的涅斯捷连科氏菌属菌株X35在食品、环保、制药、发酵工业、农业生产等方面的应用。
本发明的涅斯捷连科氏菌属菌株X35耐盐、耐碱，且能够产生稳定的酶活高的木聚糖酶。
附图说明
图1示出了对32株菌株所产生的木聚糖酶酶活测定的结果。
图2示出了对12株菌株所产生的木聚糖酶、纤维素酶和细胞壁酶酶活测定的结果。
图3是菌株X35的产木聚糖酶的曲线图。
图4示出了菌株X35在20℃下于RM培养基中培养7天后观察到的(图4-1)以及经革兰氏染色后观察到的(图4-2)形态特征。
图5示出了盐浓度对菌株X35的生长(图5-1)和产木聚糖酶(图5-2)的影响，以及pH对菌株X35的生长(图5-3)和产木聚糖酶(图5-4)的影响。
图6示出了菌株X35所产生的木聚糖酶粗酶液经凝胶过滤层析纯化后的洗脱图谱(图6-1)，以及其在上样前和洗脱后的Native-PAGE检测图谱(图6-2)。
图7示出了菌株X35所产生的木聚糖酶进一步经过DEAE弱阴离子交换层析后的洗脱图谱(图7-1)，以及洗脱液经SDS-PAGE检测的结果图(图7-2)。
图8示出了pH(图8-1)、温度(图8-2)以及金属离子(图8-3)对木聚糖酶活性的影响。
具体实施方式
如上所述，本发明提供了一株新分离的涅斯捷连科氏菌属菌株X35。所述菌株X35的菌落形态呈圆形、表面拱起湿润、橙黄色、不透明。所述菌株X35的16S rDNA的登录号为JX122587。
所述菌株X35在以秸秆粉为唯一碳源的发酵液进行培养时，可在pH7-12的条件下生长，最适生长pH是10；可生长的盐浓度是2％～7％(w/v)，最适生长盐浓度是6％(w/v)。
此外，所述菌株X35可产生酶活最高达124.578U/ml的木聚糖酶。所述菌株X35所产生的木聚糖酶在pH7-9之间稳定性好，最适反应pH为7，最适反应温度为50℃，在30℃以下稳定性好。所述菌株X35所产生的木聚糖酶的最适底物是木聚糖，对滤纸、燕麦秸秆和麸皮的特异性弱，对羟甲基纤维素、淀粉和果胶没有酶活性。所述菌株X35所产生的木聚糖酶可被K+、Na+、Mn2+、Zn2+、Co2+或Ca2+激活，并且可被Hg+和Mg2+抑制。
所述菌株X35于2016年9月30日以登录号CGMCC13068保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)，其被分类命名为涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia sp.)。
本发明还提供了本发明的涅斯捷连科氏菌属菌株X35在食品、环保、制药、发酵工业、农业生产中的应用。
具体地，本发明的菌株X35可用于制备猪饲料、鸡饲料和奶牛饲料。含有本发明菌株X35的饲料可以使细胞内养分释放、降低食糜黏度、减少肠道微生物发酵、提高养分利用率以及提高动物健康水平。
本发明的菌株X35还可用于降解石油烃、芳香烃衍生物和有机磷等污染物，处理高盐度废水。利用本发明的菌株X35降解环境中的污染物具有成本低、效率高、以及不易造成二次污染等优点。
本发明的菌株X35还可用于可降解生物材料的开发，从而应用于医学领域，例如外科手术、病人碳源外充。
此外，本发明的菌株X35还可以用于制备食品添加剂和乳化剂等，从而应用于食品和制药工业。
以下通过具体实施例来说明本发明的内容。应理解，所述具体实施例仅为说明目的，并不意味着本发明的内容仅限于具体实施例。
实施例1：菌株的分离纯化
1.1样品涂布
将采自青海湖的入湖口---黑马河及其两个子湖---尕海与耳海的土样与泥样的三个平行样品分别混匀后，各称取10g，制成含菌悬浊液，吸取0.2ml含菌悬浊液，按10-2～10-6梯度进行稀释，涂布至NaCl浓度分别为1.5﹪、10﹪和30﹪的培养基上。取采自尕海与耳海的水样200μL，采自黑马河的水样100μL，直接涂布至上述培养基上。每个样品做三个平行。
1.2菌落的计数
将涂布后的平板置于GXZ型智能光照培养箱(宁波东南仪器有限公司)中，10℃下连续培养20d。待菌落生长稳定后，选取菌落数在30～300之间的平板对分离的菌落进行计数(参照国家计数标准)。
1.3菌株的保存
挑取单个菌落至一新平板，使用实验室常规方法平板划线法，进行多次分离，在分离纯化的各菌株中加入灭菌的液体石蜡于-20℃下保存。
1.4菌株的筛选
在不同的盐浓度、温度和pH条件下，对上述得到的菌株进行进一步筛选。
1.4.1不同盐浓度条件下的筛选
按照m/v比例分别配置2.5％、5％、10％、15％和20％五个盐浓度梯的RM培养基(成分：柠檬酸钠0.3％、KCl 0.2％、CaCl2 0.02％、蛋白胨1％、MgSO4·7H2O 2％、琼脂1.8％、pH9.0)，将分离得到的各菌株分别培养于所述不同盐浓度的RM培养基上，每个菌株做三个平行，置于10℃环境下恒温培养，观察其长势，得出各菌株的最适生长盐浓度及可生长的盐浓度范围，并进行统计分析。
1.4.2不同温度条件下的筛选
设置5℃、10℃、25℃和37℃四个温度梯度，将分离得到的各菌株分别接种于RM培养基上，每个菌株做三个平行，置于所述不同的温度环境下培养，观察其长势，得出各菌株的最适生长温度及可生长的温度范围，并进行统计分析。
1.4.3不同pH条件下的筛选
通过使用精密酸度计调节RM培养基的pH分别配置了9.5、10、10.5、11、11.5和12这六个pH梯度的RM培养基(成分：柠檬酸钠0.3％、KCl 0.2％、CaCl2 0.02％、蛋白胨1％、MgSO4·7H2O 2％、琼脂1.8％、pH9.0)。将分离得到的各菌株，分别接种于所述不同pH的RM培养基上，每个菌株做三个平行，置于10℃恒温培养箱中恒温培养，观察其长势，得出各菌株的最适生长pH及可生长的pH范围，并进行统计分析。
经过上述筛选，最终获得32株菌株，将其保存-80℃用于后续实验。
实施例2.对32株菌株的木聚糖酶活性的测定
将于-80℃保存的实施例1中所述的32株菌株于21℃在HYG-A全温药瓶柜(太仓市实验设备厂)进行发酵培养，发酵培养基的唯一碳源是燕麦秸秆粉。培养2天后，使用DNS法对所述32株菌株进行木聚糖酶酶活的测定，步骤如下：
2.1葡萄糖标准曲线的制作
(1)DNS试剂的配制[10]
A液：苯酚0.2％，氢氧化钠1％，无水亚硫酸钠0.05％，3,5-二硝基水杨酸1％，贮于棕色瓶中，于4℃冰箱中保存；
B液：5mol/L氢氧化钾
使用时将A液与B液按1:1体积混合均匀即可。
(2)葡萄糖标准溶液的配制
准确称取0.125g葡萄糖，溶解并定容至200mL。
(3)葡萄糖标准曲线的绘制
分别量取0、50、75、100、125、150、175、200μL葡萄糖标准溶液，置于2ml离心管中，标号0-7，分别用蒸馏水补齐至800μL，再加入0.4ml DNS试剂，沸水浴10min，冰水浴冷却后混匀。在分光光度计上进行比色，用0号管为对照调零，于540nm波长处分别测出1～7号管的光密度值。以葡萄糖含量(ug)为横坐标，光密度值为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线。
根据标准曲线，得到酶活力的计算公式为：酶活力(U/ml)＝(OD540-0.004)×N/0.5789×t×V×M(式中：N—稀释倍数；t—反应时间；V—酶液体积(ml)；M—葡萄糖的相对分子质量。)
2.2木聚糖酶活力的测定：
0.5％的木聚糖底物的配制：准确称取0.5g木聚糖加入蒸馏水中，混匀，直到溶液呈木聚糖完全溶解，最后定容至100ml。
对照管：分别取培养基上清液0.4ml先加入0.4ml DNS使酶液失活，混匀后再加入0.4ml 0.5％底物，混匀后沸水浴10min，放置冷水中冷却。
测定管(三个平行)：分别取所述32株菌株的各培养基上清液0.4ml加入到0.4ml的0.5％木聚糖底物溶液中，40℃水浴10min后立即加入0.4ml DNS终止反应，沸水浴10min显色后放置冰水中冷却。用对照管调零，测出每管的光吸收值。再根据上述酶活力计算公式计算出各个菌株的木聚糖酶酶活(酶活定义:在测定条件下，将每分钟水解木聚糖产生1umol还原糖(以木糖计)所需的酶量定义为一个酶活力单位(IU)。U与国际单位IU的换算关系：1U＝1/150IU(μmol糖/ml(g).min)，150:木糖的分子量)。
酶活测定结果如图1所示，从图1中可以看出编号为32的菌株产生的木聚糖酶活性最高。接着，从所述32株菌株挑选出12株木聚糖酶活性相对较高的菌株，进一步对它们的木聚糖酶活性进行测定。
实施例3.对12株菌株的木聚糖酶活性的测定
将于-80℃保存的实施例2中所得的12株菌株在RM液体活化培养基(成分：柠檬酸钠0.3％、KCl 0.2％、CaCl2 0.02％、蛋白胨1％、MgSO4·7H2O 2％、pH9.0)中进行活化，当OD600达到1.5左右时，以2％的接种量接种在250mL三角瓶的液体发酵培养基(成分：燕麦秸秆粉0.5％、KCl 0.2％、CaCl2 0.02％、蛋白胨1％、MgSO4·7H2O2％、pH9.0)中。在21℃下以150rpm培养7d后，使用DNS法对所述12株菌株的纤维素酶、木聚糖酶和细胞壁酶活力进行测定，每株菌设3个重复。
3.1木聚糖酶酶活的测定：
依据2.2相同的步骤测定所述12株菌株的木聚糖酶酶活。
3.2纤维素酶酶活的测定：
依据2.2相同的步骤测定所述12株菌株的纤维素酶酶活，其中反应时间是30min，底物是0.5％的羧甲基纤维素钠(CMC)。
3.3细胞壁酶酶活力的测定：
依据2.2相同的步骤测定所述12株菌株的细胞壁酶酶活，其中反应时间是30min，底物是0.5％的秸秆粉。
酶活测定结果如图2所示，从图2中可以看出，在所测试的12株菌株中，编号为32的菌株的木聚糖酶活(121.735U/ml)显著比其他菌株的木聚糖酶活高(约为其20-50倍)。而且，该菌株的木聚糖酶活力也远比纤维素酶活和细胞壁酶活高很多(约为后两者的20倍)。由此筛选得到了本发明的菌株，并将其命名为X35。接着对其生物学特性进行了进一步的研究。此外，将本发明的菌株X35于2016年9月30日以登录号CGMCC13068保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)。
实施例4：菌株X35的16S rDNA分子生物学鉴定
4.1菌株X35的基因组DNA的提取
将实施例3中筛选得到的菌株X35转接至RM液体培养基(成分：柠檬酸钠0.3％、KCl0.2％、CaCl2 0.02％、蛋白胨1％、MgSO4·7H2O2％、pH9.0)中，10℃下培养4～5d后用TRANS试剂盒EasyPureTMGenomic DNA Kit和TaKaRa试剂盒Bacterial Genomic DNAExtractionKit Ver.2.0进行各菌株的DNA提取。
4.2菌株X35的16S rDNA序列的PCR扩增
PCR反应所选用的上游引物：27F(5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，下游引物：15R(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。
PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃1min，61℃(根据不同引物有调整)30s，72℃1min 45s，共32个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳进行分析，PCR反应体系见表1。
表1：PCR反应体系
Figure BDA0001193510890000081
4.3菌株X35的PCR扩增产物的测序
将PCR扩增得到的菌株X35的16S rDNA产物送往上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，将得到的有效测序序列与GenBank数据库比对分析，最终获得的菌株信息如表2所示。
表2：菌株X35的分类和GenBank登录号
Figure BDA0001193510890000082
Figure BDA0001193510890000091
实施例5：菌株X35的产木聚糖酶的曲线图
将于-80℃保藏的实施例4中所得的菌株X35在RM液体活化培养基(成分：柠檬酸钠0.3％、KCl 0.2％、CaCl2 0.02％、蛋白胨1％、MgSO4·7H2O 2％、pH9.0)活化，当OD600达到1.523时，以2％的接种量接种到三个完全相同的250mL三角瓶的液体发酵培养基(成分：燕麦秸秆粉0.5％、KCl 0.2％、CaCl2 0.02％、蛋白胨1％、MgSO4·7H2O2％、pH9.0)中。在21℃下以150rpm进行培养。从第1.5d开始测木聚糖酶活力，以后每间隔12h测定一次木聚糖酶活力，测定方法如实施例2中所述。结果如图3所示，从图3中可以看出，菌株X35在发酵培养24-32小时后的木聚糖酶活显著增加，之后开始缓慢增加。在第5-14天，木聚糖酶活力基本保持在最高值处，最高酶活可达124.578U/ml。
实施例6：对菌株X35的形态学特征及生理生化特征的鉴定
6.1菌株X35的形态学特征
根据细菌形态特征判定标准[11]，观察分离到菌落的形态大小、颜色、形状、边缘、透明度等，并将其制成装片，显微镜检查菌体的形状、大小、革兰氏染色反应等。在20℃下于RM固体培养基(成分：柠檬酸钠0.3％、KCl 0.2％、CaCl2 0.02％、蛋白胨1％、MgSO4·7H2O2％、琼脂1.8％、pH9.0)中培养7天后观察到的以及经过革兰氏染色后观察到的菌株的形态特征分别如图4-1和图4-2所示，从图4-1中可知，菌株X35的形态学特征为：菌落形态呈圆形，干湿程度是较湿，菌落高度是拱起，菌落的透明程度是不透明，菌落的颜色是橘黄色(在图中示为白色)。从图4-2中可看出，菌株X35是G-球菌(染色后的红色以黑色示出)，直径为2.5-3.5μm。
6.2盐浓度和pH对菌株X35的生长和产木聚糖酶的影响
(1)盐浓度对菌株X35的生长和产木聚糖酶的影响
按照m/v比例分别配置1％、2％、3％、4％、5％、6％和7％七个盐浓度梯度的液体发酵培养基(成分：燕麦秸秆粉0.5％、KCl 0.2％、CaCl2 0.02％、蛋白胨1％、MgSO4·7H2O2％、pH9.0)，将所得菌株X35分别培养于所述不同盐浓度的液体培养基上，每个梯度做三个平行，置于21℃下恒温培养。通过测定OD600，观察其长势，得到菌株生长的最适盐浓度。同时，通过DNS法(如实施例2所述)测定木聚糖酶活来得到菌株的产酶最适盐浓度。对测试结果进行统计分析，结果分别如图5-1和5-2所示。从图5-1和5-2中可以看出，菌株X35在以燕麦秸秆粉为唯一碳源的发酵液进行培养时，可生长盐浓度是2％～7％(w/v)；最适生长盐浓度是6％(w/v)；可产木聚糖酶的盐浓度是1％-8％(w/v)，最适产木聚糖酶的盐浓度是5％-7％(w/v)。
(2)pH对菌株X35的生长和产木聚糖酶的影响
通过使用精密酸度计调节RM液体发酵培养基pH分别配置了7、8、9、10和11这个五个pH梯度的液体发酵培养基。将所得菌株X35接种于所述各液体培养基中，每个梯度做三个平行。置于21℃的恒温培养箱中恒温培养，通过测定10ml菌体的干重，观察其长势，得出菌株生长的最适pH。同时，通过DNS法(如实施例2所述)测定木聚糖酶活来得到菌株的产酶最适pH。对测试结果进行统计分析，结果分别如图5-3和5-4所示。从图5-3和5-4中可以看出，菌株X35在以燕麦秸秆粉为唯一碳源的发酵液进行培养时，可生长PH是7-12，最适生长PH是10；可产木聚糖酶的PH是6-12，最适产木聚糖酶的PH是8-11。
实施例7：木聚糖酶的分离纯化
7.1粗酶液的提取
将菌株X35接种到RM固体培养基(成分：柠檬酸钠0.3％、KCl0.2％、CaCl2 0.02％、蛋白胨1％、MgSO4·7H2O 2％、琼脂1.8％、pH9.0)中，置于21℃的恒温培养箱中培养7天至培养皿出现明显的菌落，从已活化的培养皿中挑取菌体接种到液体活化培养基(成分：柠檬酸钠0.3％、KCl 0.2％、CaCl2 0.02％、蛋白胨1％、MgSO4·7H2O2％、pH9.0)中，置于21℃的恒温摇床中(150rpm/min)，培养3天后，在OD600＝1.5时以2％的接种量接种至液体发酵培养基(成分：燕麦秸秆粉0.5％、KCl 0.2％、CaCl2 0.02％、蛋白胨1％、MgSO4·7H2O2％、琼脂1.8％、pH9.0)。
菌株X35所分泌的木聚糖酶为胞外酶，因此可以直接从发酵液中获得所需的粗酶液。首先使用多层纱布过滤的方法去除发酵液中的麸皮，再以5000rpm离心10min以去除菌体，保持粗酶提取过程在低温下进行。
7.2粗酶液的提纯浓缩[10]
粗酶液的提纯浓缩使用硫酸铵分级沉淀的方法进行：
7.2.1将600ml的粗酶液使用20-80％的硫酸铵进行分级分离，首先加入硫酸铵至浓度为20％，4℃静置6小时后离心；
7.2.2收集上清，测量体积后，继续加入硫酸铵至浓度为80％，4℃静置6小时后离心。
7.2.3保留沉淀，使用30ml pH7.5 20mM Tris-HCl缓冲液溶解沉淀，最终得到含目的蛋白的浓缩粗酶液，且所得蛋白含量为36.02mg(蛋白的回收率为45％)，将其于4℃保存备用。
7.3凝胶过滤层析纯化
将硫酸铵分级沉淀后得到的含目的蛋白的粗酶液上样到预先用pH7.5 20mMTris-HCl缓冲液平衡好的Sephacryl S-100(Pharmacia)凝胶过滤层析柱(26×700mm)，再用相同缓冲液进行洗脱，速度为0.5ml/min，每6min收集1管洗脱液。测定各管洗脱液的OD595值；用DNS法(如实施例2所述)测木聚糖酶活性，记录各管洗脱液的OD540值，结果如图6-1所示。从图6-1中可以看出，第二个洗脱峰中含有木聚糖酶。图6-2示出了对上样前的粗酶液(①和②)以及经过凝胶过滤层析后的木聚糖酶活性最高的洗脱液(③和④)进行Native-PAGE检测的结果图。从图6-2中可以看出，X35菌株发酵产生木聚糖酶的过程中产生三条分子量较接近的蛋白条带；并且经过Sephacryl S-100凝胶层析后这三条蛋白条带并没有被分开。收集具有高木聚糖酶活性的洗脱液并置于4℃保存用于进一步分离纯化。
7.4 DEAE弱阴离子交换层析纯化
将凝胶过滤层析后收集得到具木聚糖酶活性的洗脱液浓缩后上样到预先用pH7.520mM Tris-HCl缓冲液平衡好的DEAE弱阴离子交换层析柱上，再用2倍柱床体积的相同缓冲液洗去除未结合的蛋白。最后用含0-2mol/L NaCl的相同缓冲液进行梯度洗脱，整个过程中流速为0.7ml/min，每4min收集1管洗脱液。测定各管洗脱液的OD595值。用DNS法(如实施例2所述)测木聚糖酶活性，记录各管洗脱液的OD540值，结果如图7-1所示。从图7-1中可以看出，存在两个蛋白洗脱峰，但是只有第一个洗脱峰的洗脱液具有木聚糖酶酶活，且活力较高。
将收集的第一个洗脱峰的洗脱液浓缩后进行SDS-PAGE检测，结果如图7-2所示。从7-2中可以看出，所得样品为单一组分蛋白，将其定义为木聚糖酶A。
以标准蛋白质样品迁移率为纵坐标，标准蛋白质分子量的自然对数值为横坐标作图，即可得到一条标准曲线y＝-0.1023x+8.7211(R2＝0.976)。根据电泳分析结果估算木聚糖酶A的相对分子质量为58.86kDa。表3总结出了对木聚糖酶分离纯化的各个步骤所得结果。
表3：木聚糖酶A的分离纯化结果
Figure BDA0001193510890000121
从表3中可知，Sephacry S-100葡聚糖凝胶层析后的木聚糖酶的比酶活是92.45％，将酶活性较高的洗脱液收集后进行DEAE弱阴离子交换层析得到的木聚糖酶的比酶活是10.77％。
收集具有木聚糖酶活性的洗脱液并置于4℃保存备用。
实施例8：对木聚糖酶的酶学性质的研究
8.1 pH对木聚糖酶活性的影响
8.1.1最适反应pH
(1)用50mmol/L不同缓冲体系的不同pH值的缓冲液配制底物(0.5％的木聚糖)，设定pH值的范围是3.0-12.0，pH梯度值为1，所采用的缓冲液分别为：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH3.0－5.0)；磷酸二氢钠-氢氧化钠缓冲液(pH6.0－8.0)；Tris-HCl缓冲液(pH8.0－9.0)；碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液(pH10.0－11.0)；
(2)参照实施例2中所述的DNS法，于40℃测定不同pH条件下测定木聚糖酶酶活；
(3)以最高酶活为100％，计算各pH下的相对酶活，制作pH-相对酶活曲线。
8.1.2 pH稳定性
(1)用50mmol/L不同缓冲体系的不同pH值的缓冲液，设定pH值的范围是3.0-10.0，pH梯度值为1，所采用的缓冲液如上8.1.1；
(2)将缓冲液与木糖酶液以1:1的比例混合，在室温条件下处理木聚糖酶酶液30min；
(2)参照实施例2中所述的DNS法测定木聚糖酶处理后的残余酶活；
(3)以未经处理的酶活为100％，制作pH-相对酶活曲线。
结果如图8-1所示，从图中可以看出，木聚糖酶的最适反应pH为7，在pH7-11之间都有较高的酶活；并且在pH7-9之间具有较好的稳定性。
8.2温度对木聚糖酶活性的影响
8.2.1最适反应温度
(1)将木聚糖酶液与底物(0.5％的木聚糖)混合后，在20-70℃的温度范围内分别以每10℃为一梯度设定反应温度；
(2)参照实施例2中所述的DNS法测定木聚糖酶酶活；
(3)以最高酶活为100％，计算各温度下的相对酶活，制作温度-相对酶活曲线。
8.2.2温度稳定性
(1)将木聚糖酶液分别在20-70℃的温度范围内分别以每10℃为一梯度条件下保温1h后冰水浴；
(2)参照实施例2中所述的DNS法测定木聚糖酶处理后的残余酶活；
(3)以未处理的酶活为100％，制作温度-相对酶活曲线。
结果如图8-2所示，从图中可以看出，木聚糖酶A的最适反应温度为50℃，在30-50℃的温度范围内具有较高的酶活力，温度过低或过高对木聚糖酶的酶活都有不利的影响；并且木聚糖酶A在30℃以下稳定性较好，依然保持较高的酶活，超过30℃酶活呈现大幅度的下降趋势。
8.3木聚糖酶的底物特异性
(1)分别以0.5％的桦木木聚糖、羧甲基纤维素、滤纸、麸皮、燕麦秸秆、淀粉和果胶作为底物；
(2)将纯化的木聚糖酶分别与不同的底物在pH7.0、40℃下反应30min；
(3)按照如实施例2所述的酶活测定方法测定酶活；
(4)以最高酶活为100％，计算对不同底物的相对酶活。
结果如下表4所示：
Figure BDA0001193510890000141
Figure BDA0001193510890000151
从表4中可看出，木聚糖酶A的最适底物为木聚糖，对滤纸、燕麦秸秆和麸皮特异性较弱，对羧甲基纤维素、淀粉和果胶没有酶活性。
8.4金属离子对木聚糖酶活性的影响
(1)分别在木聚糖酶液中加入各种金属离子化合物：CoCl2、NaCl、KCl、Zn Cl2、CuCl2、FeCl2、MgCl2、MnCl2、CaCl2，CoCl2分别对应Na+、K+、Zn2+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+；
(2)各种金属离子在反应体系中的终浓度达到4mmol/L；
(3)40℃下处理30min后测定残余木聚糖酶活力。
结果如图8-3所示(以未加金属离子的酶活力100％)，从图中可看出，金属离子对木聚糖酶A活力的影响如图8-3所示，K+、Na+、Mn2+、Zn2+、Co2+和Ca2+对酶活有不同程度的激活作用，Hg+和Mg2+对酶活有不同等程度的抑制作用。
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Claims (4)

1.涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)菌株X35，其以登录号CGMCC No.13068保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
2.权利要求1的菌株X35用于产生木聚糖酶的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述木聚糖酶的最高酶活达到124.578U/ml。
4.根据权利要求2所述的用途，其中所述木聚糖酶的最适反应pH为7，最适反应温度为50℃；并且在pH7.0-9.0范围内稳定性好，在30℃以下稳定性好。
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