CN112574918A - 一种氨氮降解菌、微生物菌剂及其应用 - Google Patents

一种氨氮降解菌、微生物菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氨氮降解菌、菌剂及其在水产养殖中的应用，属于环境微生物和水产养殖技术领域。所述氨氮降解菌为芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC‑30B，其于2020年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21133。该菌具有良好的氨氮降解能力，在28℃条件下36小时氨氮清除率为96％，在18℃条件下48小时氨氮清除率为78％。同时，该菌具有较高的纤维素酶和蛋白酶活性，可用于清除养殖池塘中的有机废物。该菌可用于养殖水体氨氮及有机废物的清除，同时该菌可制成微生物菌剂。

Description

一种氨氮降解菌、微生物菌剂及其应用
技术领域
本发明属于环境微生物和水产养殖技术领域，具体涉及一种氨氮降解菌、微生物菌剂及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
近年来，我国水产养殖业发展迅速，养殖规模逐年扩大，养殖种类不断增加，在满足人们的物质需求的同时带来了巨大的经济和社会效益。随着水产养殖业的不断发展，集约化养殖逐渐成为主要的养殖模式，而集约化养殖产生的自身污染也日益显现，不仅在一定程度上危害到养殖水域自身的生态环境，还对周边的水环境和生态系统构成一定威胁。
水产养殖水体不同程度污染的污染源主要来自投放的饵料、水生动物排出的粪便、投放的肥料、各种添加剂与药剂以及底质释放，对水体的污染主要表现为水域氮、磷等含量升高。其中氨氮含量过高严重危害动物的健康，是高密度养殖，特别是池塘养殖过程中最常见同时危害性最大的问题。
养殖水体氨氮控制主要包括化学法、物理法和微生物法。其中微生物法成本低、作用温和、对养殖动物无伤害，因此逐渐成为养殖水体氨氮降解的最主要方法。因此，筛选安全高效的水体氨氮降解微生物，并应用于水产养殖具有重要的应用前景。
发明内容
针对上述现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种氨氮降解菌、菌剂及其在水产养殖中的应用。
为了解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种氨氮降解菌，所述氨氮降解菌为芽孢杆菌(Bacillussp.)SC-30B，其于2020年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21133。
第二方面，本发明提供一种微生物菌剂，包括所述氨氮降解菌。
第三方面，本发明提供所述氨氮降解菌、氨氮降解菌的代谢物和/或微生物菌剂在水产养殖水体氨氮降解、污水氨氮降解和/或制备污水氨氮降解产品中的应用。
与现有技术相比，本发明的以上一个或多个实施例的有益效果为：
1、菌株筛选于海参养殖水体，经扩大培养或制成菌剂应用于养殖水体对动物和水体潜在危害风险更小。
2、该菌株可在高温下快速降解氨氮，同时在低温下具有较高氨氮降解活性，应用范围更广。
3、该菌株同时具备较高的蛋白酶活性可用于养殖环境有机废物的清除，作用功能广泛。
4、该菌具有良好的氨氮降解能力，在28℃条件下36小时氨氮清除率为96％，在18℃条件下48小时氨氮清除率为78％。同时，该菌具有较高的纤维素酶和蛋白酶活性，可用于清除养殖池塘中的有机废物。该菌可用于养殖水体氨氮及有机废物的清除，同时该菌可制成微生物菌剂。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实施例的菌株SC-30B菌落形态；
图2是本发明实施例的菌株SC-30B菌体形态；
图3是本发明实施例的菌株SC-30B进化树图；
图4是本发明实施例的菌株SC-30B在不同温度下氨氮降解曲线；
图5是本发明实施例的菌株SC-30B蛋白酶和淀粉酶活性，其中，A为蛋白酶活性检测，B为淀粉酶活性检测。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
第一方面，本发明提供一种氨氮降解菌，所述氨氮降解菌为芽孢杆菌(Bacillussp.)SC-30B，其于2020年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.21133。
在一些实施例中，所述氨氮降解菌从海参养殖池水体中分离。
第二方面，本发明提供一种微生物菌剂，包括所述氨氮降解菌。
在一些实施例中，所述微生物菌剂还可以包括其他微生物。
进一步的，所述微生物为光合细菌、亚硝酸盐降解菌和/或丁香假单胞菌。
在一些实施例中，所述微生物菌剂中，除含活性成分外，还含有载体。所述载体可为微生物制剂领域常用的且在生物学上是惰性的载体。
所述载体可为固体载体或液体载体；
所述固体载体可为矿物材料、植物材料和/或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、麦饭石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉、稻壳粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇或/和聚二醇；
所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷或/和十二烷。
在一些实施例中，所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂；优选为粉剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
在一些实施例中，所述微生物菌剂采用液体培养基发酵制备。
在一些实施例中，所述氨氮降解菌采用LB培养基培养。
第三方面，本发明提供所述氨氮降解菌、氨氮降解菌的代谢物和/或微生物菌剂在水产养殖水体氨氮降解、污水氨氮降解和/或制备污水氨氮降解产品中的应用。
实施例1
一株氨氮降解菌株Bacillus SC-30B的筛选和鉴定
1.1样品采集：
水体样品采集于山东滨州地区海参养殖池塘，用无菌样品瓶采集底层水体，4℃运回待用。
1.2培养基：
1.2.1富集培养基1：葡萄糖10.0g，氯化铵0.5g，氯化亚铁0.1g，无水氯化钙0.1g，氯化钠1.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁1.0g，水1000ml。
1.2.2富集培养基2：葡萄糖10.0g，氯化铵1.0g，氯化亚铁0.1g，无水氯化钙0.1g，氯化钠1.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁1.0g，水1000ml。
1.2.3分离培养基：葡萄糖5.0g，氯化铵0.5g，氯化亚铁0.1g，无水氯化钙0.1g，氯化钠1.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁1.0g，琼脂粉20g，水1000ml。
1.2.4基础培养基LB：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，水1000ml。
1.2.5氨氮降解检测培养基：葡萄糖5.0g，氯化铵0.4g，氯化亚铁0.1g，无水氯化钙0.1g，氯化钠1.0g，磷酸氢二钾1.0g，硫酸镁1.0g，水1000ml。
1.2.6蛋白酶活性测定培养基：干酪素8.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4 0.5g,NaCl5.0g，牛肉浸出粉3.0g，琼脂粉15g，0.4％溴麝香草酚蓝溶液12.5ml，水1000ml。
1.3菌株筛选：
1.3.1氨氮降解菌的富集：250ml三角瓶中加入50ml富集培养基1，接入5ml水体样品，28℃摇床培养3天。随后取5ml培养液加入到50ml富集培养基2中进行二次富集培养。
1.3.2将两次富集后菌液进行梯度稀释至10-3-10-5，分别取100μl稀释液涂布于分离培养基，28℃条件下培养5天。
1.3.3挑取菌落，每种典型菌落挑取3个在LB固体培养基中进行多次划线纯化，直至得到纯菌株。
1.3.4菌体降解氨氮能力测定：分别在28℃条件下采用LB液体培养基培养各菌株一天。按照5％的比例接种培养液到氨氮降解检测培养基中，28℃条件下培养48h。随后，采用氨氮试剂检测剩余培养基中氨氮含量。选取氨氮降解活性最高的菌株SC-30B作为目标菌株，观察菌株的形态并对菌株进行分类鉴定。
1.4菌株SC-30B的形态学观察：
采用划线法在LB固体培养基表面获得SC-30B菌株单菌落，观察菌落形态，结果如图1所示，菌体在培养基表面形成较大的圆形或椭圆形菌落，边缘不整齐，菌落呈白色或淡黄色，易于挑取。接种SC-30B菌体到LB液体培养基，培养到对数中期，取少量菌液涂布载玻片，并用结晶紫染色，观察菌体形态。结果如图2所示，菌体为的杆状，长短不一，长度在2-9μm。
1.5菌株鉴定:
采用土壤细菌基因组提取试剂盒提取菌株SC-30B的总DNA，采用细菌通用测序引物27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG(SEQ ID NO.1)和1492R:TACGGYTACCTTGTTACGACTT(SEQ IDNO.2)进行PCR扩增。反应体系为：H2O 25μL，Mix Buffer 22μL，Primer1 2μL，Primer2 2μL，DNA模板1μL，总体积50μL；反应条件：95℃预变性5min，35循环的95℃变性30sec，53℃退火30sec，72℃延伸1min，循环结束后72℃延伸10min。反应产物采用琼脂糖凝胶电泳检测纯度。随后进行序列测序，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.3所示。测序结果在Ezbiocloud网站与模式菌株进行16S rDNA基因序列比对。结果表明，该菌株与Bacillus altitudinis相似性最高达99.3％。菌株进化树图如图3所示。
实施例2
一株氨氮降解菌株Bacillus SC-30B的氨氮降解活性检测
采用LB液体培养基活化Bacillus SC-30B菌种，接种5％菌体发酵液到氨氮降解培养基中，在28℃、200rpm条件下培养菌体。分别在0、6、12、18、24、30、36、42、48h测定剩余氨氮含量。结果如图4所示，菌株Bacillus SC-30B在28℃条件下具有很强的氨氮降解活性，在初始浓度为123mg/ml时，在36h氨氮降解率为96％。
实施例3
一株氨氮降解菌株Bacillus SC-30B较低温度下的氨氮降解活性检测
采用LB液体培养基活化Bacillus SC-30B菌种，接种5％菌体发酵液到氨氮降解培养基中，在18℃、200rpm条件下培养菌体。分别在0、6、12、18、24、30、36、42、48h测定剩余氨氮含量。结果如图4所示，菌株Bacillus SC-30B在20℃条件下仍具有较强的氨氮降解活性，在初始浓度为123mg/ml时，在48h氨氮降解率为78％。
实施例4
一株氨氮降解菌株Bacillus SC-30B蛋白类有机物降解活性检测
采用固体平板法研究Bacillus SC-30B降解养殖水体中重要有机物污染物蛋白质和淀粉的能力。
蛋白酶活性验证培养基：干酪素8.0g，Na2HPO4 2.0g，MgSO4 0.5g，NaCl5.0g，牛肉浸出粉3.0g，琼脂粉15g，0.4％溴麝香草酚蓝溶液12.5ml，蒸馏水1000ml，pH值7.4。
淀粉酶活性验证培养基：淀粉20g，酵母浸出粉3.0g，胰酪蛋白胨5g，Na2HPO4 5g，MgSO4 0.1g，NaCl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值7.2。
培养24h后看是否有透明菌圈产生，产酶多少以透明圈直径比菌圈直径，即R/r(R表示透明圈，r表示菌圈)表征。结果如图所示5菌株Bacillus SC-30B具有较强蛋白酶(R/r＝1.6)和淀粉酶活性(R/r＝2.8)。
实施例5
以氨氮降解菌株Bacillus SC-30B为主体的微生物制剂的制备
采用LB液体培养基活化菌体至OD值为0.8得到种子液，接种5％菌种至新的LB液体培养基在28℃条件下进行液体发酵，培养36h即可得到菌体发酵液。发酵液可单独作为菌剂使用降解养殖水体中的氨氮和有机物。另外Bacillus SC-30B发酵液可结合光合细菌、亚硝酸盐降解菌、丁香假单胞菌等制成混合菌剂以达到更加全面的有害废物清除效果。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省科学院生物研究所
<120> 一种氨氮降解菌、微生物菌剂及其应用
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tacggytacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1384
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌SC-30B 16S rDNA
<400> 3
aaggttacct caccgacttc gggtgttgca aactctcgtg gtgtgacggg cggtgtgtac 60
aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg attactagcg attccagctt 120
cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga actgagaaca gatttgtggg attggctaaa 180
ccttgcggtc tcgcagccct ttgttctgtc cattgtagca cgtgtgtagc ccaggtcata 240
aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg gcagtcacct 300
tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa gatcaagggt tgcgctcgtt gcgggactta 360
acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac cacctgtcac tctgtccccg 420
aagggaaagc cctatctcta gggttgtcag aggatgtcaa gacctggtaa ggttcttcgc 480
gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca attcctttga 540
gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta atgcgttagc tgcagcacta 600
aggggcggaa accccctaac acttagcact catcgtttac ggcgtggact accagggtat 660
ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc agttacagac cagagagtcg 720
ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca ccgctacacg tggaattcca 780
ctctcctctt ctgcactcaa gtttcccagt ttccaatgac cctccccggt tgagccgggg 840
gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg cgagcccttt acgcccaata attccggaca 900
acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg gctttctggt 960
taggtaccgt caaggtgcaa gcagttactc ttgcacttgt tcttccctaa caacagagct 1020
ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg 1080
cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg 1140
gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgtcgccttg gtgagccgtt acctcaccaa 1200
ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa gtgacagccg aaaccgtctt tcatccttga 1260
accatgcggt tcaaggaact atccggtatt agctccggtt tcccggagtt atcccagtct 1320
tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc cgtccgccgc taacatccgg gagcaagctc 1380
cctc 1384

Claims (10)

1.一种氨氮降解菌，其特征在于，所述氨氮降解菌为芽孢杆菌(Bacillus sp.)SC-30B，其于2020年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21133。
2.一种微生物菌剂，其特征在于：包括所述氨氮降解菌。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂还包括微生物。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物为光合细菌、亚硝酸盐降解菌和/或丁香假单胞菌。
5.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂中，除含活性成分外，还含有载体。
6.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于：菌剂的剂型为液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂；优选为粉剂。
7.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂采用液体培养基发酵制备。
8.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于：所述氨氮降解菌采用LB培养基培养。
9.权利要求1或2所述的氨氮降解菌、氨氮降解菌的代谢物和/或权利要求3-9任一所述的微生物菌剂在水产养殖水体氨氮降解、污水氨氮降解和/或制备污水氨氮降解产品中的应用。
10.权利要求1或2所述的氨氮降解菌、氨氮降解菌的代谢物和/或权利要求3-9任一所述的微生物菌剂在纤维素降解、蛋白质降解、制备纤维素降解产品或/和制备蛋白质降解产品中的应用。
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