CN111826294B - 一种可降解青霉素v钾的假苍白杆菌菌株、细胞级分及组合物 - Google Patents

一种可降解青霉素v钾的假苍白杆菌菌株、细胞级分及组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可降解青霉素V钾的假苍白杆菌，该假苍白杆菌以保藏编号CGMCC No.15259保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的可降解青霉素V钾的假苍白杆菌菌株，可以利用青霉素V钾为唯一碳源生长，该菌株对含量为0.6g/L青霉素V钾的降解能力在3小时以内可达到100%。可将该菌株用于青霉素V钾工业生产中发酵菌渣的无害化处理，该处理方法高效，绿色环保，节约资源，处理成本低，消除了青霉素V钾废菌丝对环境的不利影响。

Description

一种可降解青霉素V钾的假苍白杆菌菌株、细胞级分及组合物
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种可降解青霉素V钾的假苍白杆菌菌株，以及涉及这种菌株的培养方法、突变体、细胞级分及组合物。
背景技术
青霉素V钾属于β-内酰胺类抗生素，抗菌谱与青霉素G相似,能够破坏细菌细胞壁,具有杀菌作用；也是一种重要的原料药和医药前体,国内外广泛应用于口服制剂加工、半合成青霉素和头孢菌素的生产。
目前工业上生产青霉素V钾主要是用豆饼粉、玉米浆、淀粉等为培养基，经发酵、萃取、纯化而成。在生产过程中会产生大量菌渣，菌渣中含有剩余的培养基、抗生素产生菌发酵过程的代谢物、培养基的降解物等。根据2012年3月环保部公布的《制药工业污染防治技术政策》要求，菌丝废渣被列为危险废物，须焚烧或者安全填埋。填埋处理菌渣，其残留的抗生素会造成环境耐药性，焚烧方式不仅成本高，且燃烧产生的碳氧化物、氮氧化物、硫氧化物将引发空气污染，如雾霾和酸雨等环境问题。
因此，寻求高效、经济、安全、无害的资源化处理和应用菌渣的方法具有重要的意义。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种可降解青霉素V钾的假苍白杆菌菌株，其具有高效降解青霉素V钾的能力，可对青霉素V钾的发酵菌株进行无害化处理，具有绿色环保，节约能源，成本低的优点。
为解决上述技术问题，本发明提供一种可降解青霉素V钾的假苍白杆菌菌株(Pseudochrobactrum sp.)，该假苍白杆菌菌株以保藏编号CGMCC No.15259，命名为假苍白杆菌X-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
优选地、所述假苍白杆菌菌株在富集培养基上形成的菌落特征为：圆形，菌落黄色，表面湿润，不透明，边缘整齐；
菌体特征为：革兰氏阴性，菌体呈杆状，大小为0.3-0.4μm×0.6-2.8μm，单个或多个排列。
优选地、所述假苍白杆菌菌株的酪氨酸芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶、α-葡糖苷酶为阳性；脂肪酶、尿素酶、鸟氨酸脱羧酶、甘氨酸芳胺酶为阴性；D-甘露醇、葡萄糖发酵为阴性。
本发明提供的可降解青霉素V钾的假苍白杆菌菌株的培养方法，
该培养方法包括下面的步骤：
步骤一：采集污泥，接种到含有青霉素V钾的无机盐培养基中，经过多次转接过程，每次转接均转接到更高浓度的青霉素V钾的培养基中；
步骤二：取步骤一中含有细菌的富集培养液涂布到青霉素V钾的固体培养基上，培养得到一株生长速度最快的菌株，将该菌株编号为X-1；
或者，该培养方法包括下面的步骤：
步骤一：采集污泥，加入青霉素V钾溶液中进行培养，经过多次转接过程，转接时接种到新鲜的青霉素V钾溶液驯化培养基中，多次转接中逐步提高青霉素V钾的含量，检测青霉素V钾的降解率，挑选出降解率最好的一组分离菌株；
步骤二：将步骤一的分离菌株的菌悬液接入到含有青霉素V钾的自来水中，培养一定时间，菌株将青霉素V钾完全降解，得到菌株编号为X-1。
优选地、所述假苍白杆菌菌株以青霉素V钾为唯一碳源生长。
本发明提供的可降解青霉素V钾的假苍白杆菌菌株作为降解青霉素V钾的用途。
优选地、所述的假苍白杆菌菌株的16S rDNA的全部碱基序列如SEQUENCE LISTING所示。
本发明提供的可降解青霉素V钾的假苍白杆菌菌株突变体，通过对前体物诱变或遗传转化得到可降解青霉素V钾的假苍白杆菌菌株突变体，所述前体物以保藏编号CGMCCNo.15259，命名为假苍白杆菌X-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明提供的一种可降解青霉素V钾的细胞级分，该细胞级分为DNA制备物，或细菌壁制备物，或培养液、或上清液，且该细胞级分包括假苍白杆菌菌株，该假苍白杆菌菌株以保藏编号CGMCC No.15259保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明提供的组合物，其包含假苍白杆菌菌株，或假苍白杆菌菌株突变体，或细胞级分。
本发明的有益效果为：
本发明的可降解青霉素V钾的假苍白杆菌株，其可以利用青霉素V钾为唯一碳源生长，该菌株对0.6g/L青霉素V钾的降解能力在3小时以内可达到100％。可将该菌株用于青霉素V钾工业生产中发酵菌渣的无害化处理和相关高浓度废水处理，该处理方法高效、绿色环保，节约资源，处理成本低，消除了青霉素V钾废菌丝对环境的不利影响。
附图说明
图1为本发明的可降解青霉素V钾的假苍白杆菌X-1菌株的菌体形态图。
具体实施方式
本发明的假苍白杆菌(Pseudochrobactrum sp.)，其为可高效降解青霉素V钾的降解菌，该菌株编号为X-1，该菌株于2018年01月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.15259，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明的假苍白杆菌(Pseudochrobactrum sp.)菌株X-1，具有高效降解青霉素V钾的能力，能够对发酵工业产生的菌丝体中的青霉素V钾进行有效降解，以消除青霉素V钾废菌丝中抗生素残留，可用于青霉素V钾工业生产中发酵菌渣的无害化处理和相关高浓度废水，为菌丝的无害化处理及环境保护提供了有效的途径。
其中，假苍白杆菌菌株通过诱变或遗传转化筛选得到的降解青霉素V钾突变菌株，该突变菌株至少保留了降解青霉素V钾的特性，其包括通过假苍白杆菌菌株的插入突变、整合突变等得到的突变体。其次，本发明通过假苍白杆菌菌株或者诱变、遗传转化的得到的可降解青霉素V钾的假苍白杆菌菌株的突变菌株得到的细胞级分。该细胞级分包括从上述菌株的培养物中得到的DNA制备物或者细菌壁制备物、上述菌株的得到的培养液，这些培养液的上清液以及该上清液的级分。该细胞级分具有降解青霉素V钾的作用。以及组合物包括假苍白杆菌菌株，可降解青霉素V钾的假苍白杆菌菌株的突变菌株以及它们的细胞分级的培养液。
下面通过具体实施例，进一步说明本发明实现的详细过程。
实施例1假苍白杆菌菌株的筛选。
步骤一：取从河北石家庄市区周边采集污泥10g，接种到含有20mg青霉素V钾的100mL无机盐培养基中，于30℃，160rpm摇床震荡培养。培养开始后每3天转接一次，转接时以10％(V/V)的接种量转接到更高浓度的含青霉素V钾的培养基中，青霉素V钾的含药浓度依次为30mg/L、60mg/L、90mg/L、120mg/L、150mg/L依次类推，至900mg/L，得到不同浓度的含有菌体的富集培养液。
其中，本实施例中的无机盐培养基的组成及配比为(g/L)：K2HPO4 1.6g，KH2PO40.4g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.025g，FeCl3·6H2O 0.0023，NH4NO3 0.5g，琼脂20.0g，用1mol/L HCL或NaOH调节pH值至7.0，121℃高压灭菌30min。
本实施例中的富集培养基的组成及配比为(g/L)：K2HPO4 1.6g，KH2PO4 0.4g，MgSO4·7H2O 0.2g，CaCl2·2H2O 0.025g，FeCl3·6H2O 0.0023，NH4NO3 0.5g，酵母浸膏0.5g，葡萄糖1g，蛋白胨1g，琼脂20.0g，用1mol/L HCL或NaOH调节pH值至7.0，121℃高压灭菌30min。
步骤二：取0.1mL步骤一中含有细菌的富集培养液涂布到含有20mg青霉素V钾的固体培养基上，30℃，培养72小时。得到一株生长速度最快的菌株，将该菌株编号为X-1。
配合参阅图1所示，该编号为X-1菌株的主要生物学特性为：该菌株在富集培养基上形成的菌落为圆形，黄色，表面光滑，不透明，边缘整齐；
该菌株的菌体特征为：革兰氏阴性，菌体呈杆状，0.3-0.4μm×0.6-2.8μm，单个或多个排列。
经过试验测定，该编号为X-1菌株的酪氨酸芳胺酶、L-脯氨酸芳胺酶、α-葡糖苷酶阳性；脂肪酶、尿素酶、鸟氨酸脱羧酶、甘氨酸芳胺酶阴性；D-甘露醇、葡萄糖发酵阴性。
步骤三：通过液相色谱法测定在无菌自来水中，该菌株对青霉素V钾具有降解能力。培养液中菌体的含量为每毫升培养液中108个，吸取1mL培养液加入到100mL含有青霉素V钾30mg的自来水中，于30℃，160rpm摇床震荡培养2h，经测定，青霉素V钾的降解率为100％。同时，该菌株与发酵菌渣共培养一天，采用液相色谱法测定，该菌株对青霉素V钾的降解率可达到100％。实验证明，降解溶液体系为自来水，X-1；菌株在pH 7.0-8.0，温度30至35℃生长良好，能以青霉素V钾为唯一碳源生长，是一株很有潜力的降解菌。
测定该菌株的16S rDNA的序列，将该测定的16S rDNA序列与Genebank登录号为AM180484的16S rDNA的基因序列进行同源性分析。首先，采用DNA小量提取方法提取X-1菌株的总DNA。采用16S rRNA通用引物27F-1492R扩增其16S rRNA基因序列，将扩增得到的PCR产物直接进行测序(测序结果见序列表中SEQUENCE LISTING)，将获得的16S rRNA基因序列输入GeneBank，通过Blastn程序对数据库中的所有序列进行比较分析。本发明菌株的X-1的16S rRNA基因序列与假苍白杆菌属的已有模式菌株具有较高的相似性。其中与Pseudochrobactrum saccharolyticum CCUG 33852T的序列相似性为100％。该菌株属于Pseudochrobactrum sp.，同时结合其生理生化特征，鉴定该菌株为Pseudochrobactrumsp.，即假苍白杆菌菌株。
实施例2本实施例的假苍白杆菌菌株(Pseudochrobactrum sp.)的筛选及对青霉素V钾的降解作用。
步骤一：取10g污泥盛于灭菌的250mL锥形瓶中，加入100mL浓度为0.3g/L的青霉素V钾溶液中，于30℃转速为160r/min摇床培养。培养开始后，每3天转接一次，转接时以10％(V/V)的接种量接种到新鲜的青霉素V钾溶液驯化培养基中，并逐步提高青霉素V钾的含量。检测青霉素V钾的降解率，挑选出最好的一组以便分离菌株所用。
步骤二：将1mL上述菌株的菌悬液(1×108个/mL)接入到100mL含50mg青霉素的自来水中，取三次平行，并以不接种细菌但含相同浓度的青霉素的自来水为对照。30℃，160rpm摇床培养，分别培养0、1、2小时，液相色谱法检测青霉素V钾的含量，实验结果见表一。培养2小时，菌株可将青霉素V钾几乎完全降解。将得到的菌株编号为X-1。
表一 假苍白杆菌X-1在自来水中对青霉素的降解率
Figure GDA0003456195680000061
步骤三：测定编号为X-1的菌株的16S rDNA的序列，将测定的16S rDNA序列与Genebank登录号为AM180484的16S rDNA的基因序列进行同源性分析，认为X-1菌株属于Pseudochrobactrum sp.，同时结合其生理生化特征，鉴定该菌株为Pseudochrobactrumsp，即假苍白杆菌。
由上可知，本发明的假苍白杆菌菌株是一株能够高效降解青霉素V钾的菌株，其可以利用青霉素V钾为唯一碳源生长，该菌株对0.6g/L的青霉素V钾的降解能力在3小时以内可达到100％。本发明利用假苍白杆菌菌株用于青霉素V钾工业生产中发酵菌渣的无害化处理，该处理方法高效、绿色环保，节约资源能源，成本低，本发明的假苍白杆菌菌株消除了青霉素V钾废菌丝对环境不利影响。同时，本发明的假苍白杆菌菌株与降解相关的基因及关键酶在生物修复和净化及工业和生物医药领域具有广泛的作用。
以上仅为本发明的较佳实施例，不得以此限定本发明实施的保护范围，因此凡参考本发明的说明书内容所作的简单等效变化与修饰，仍属本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北科技大学
<120> 一种可降解青霉素的副球菌
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1339
<212> DNA
<213> Pseudochrobactrum sp
<400> 1
TGCAGTCGAA CGGTCTCTTC GGAGGCAGTG GCAGACGGGT GAGTAATGCA TGGGAATCTA 60
CCGTTCTCTA CGGAATAACT CAGGGAAACT TGTGCTAATA CCGTATACGC CCTTTTGGGG 120
AAAGATTTAT CGGAGAATAG TGAGCCCATG TTGGATTAGC TAGTTGGTAG GGTAAAGGCC 180
TACCAAGGCG ACGATCCATA GCTGGTCTGA GAGGATGATC AGCCACACTG GGACTGAGAC 240
ACGGCCCAGA CTCCTACGGG AGGCAGCAGT GGGGAATATT GGACAATGGG CGCAAGCCTG 300
ATCCAGCCAT GCCGCGTGAG TGATGAAGGC CCTAGGGTTG TAAAGCTCTT TCACCGGTGA 360
AGATAATGAC GGTAACCGGA GAAGAAGCCC CGGCTAACTT CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA 420
TACGAAGGGG GCTAGCGTTG TTCGGATTTA CTGGGCGTAA AGCGCACGTA GGCGGACTTT 480
TAAGTCAGGG GTGAAATCCC GGGGCTCAAC CCCGGAACTG CCTTTGATAC TGGAAGTCTT 540
GAGTATGGAA GAGGTAAGTG GAATTGCGAG TGTAGAGGTG AAATTCGTAG ATATTCGCAG 600
GAACACCAGT GGCGAAGGCG GCTTACTGGT CCATTACTGA CGCTGAGGTG CGAAAGCGTG 660
GGGAGCAAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGATGAA TGTTAGCCGT 720
CGGGGTGTTT ACACTTCGGT GGCGCAGCTA ACGCATTAAA CATTCCGCCT GGGGAGTACG 780
GTCGCAAGAT TAAAACTCAA AGGAATTGAC GGGGGCCCGC ACAAGCGGTG GAGCATGTGG 840
TTTAATTCGA AGCAACGCGC AGAACCTTAC CAGCTCTTGA CATGCCTATG AATGTTAGTG 900
GAGACACTTT CAGCCTTTCG GGGCGTAGGA CACAGGTGCT GCATGGCTGCT CGTCAGCTCG 960
TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA AGTCCCGCAA CGAGCGCAAC CCTCGCCTTT AGTTGCCATC 1020
ATTTAGTTGG GCACTCTAAA GGGACTGCCA GTGATAAGCT GGAGGAAGGT GGGGATGACG 1080
TCAAGTCCTC ATGGCCCTTA CGGGCTGGGC TACACACGTG CTACAATGGT GGTGACAGTG 1140
GGCAGCGAGA CCGCGAGGTC GAGCTAATCT CCAAAAGCCA TCTCAGTTCG GATTGCACTC 1200
TGCAACTCGA GTGCATGAAG TTGGAATCGC TAGTAATCGC GGATCAGAAT GCCGCGGTGA 1260
ATACGTTCCC GGGCCTTGTA CACACCGCCC GTCACACCAT GGAGTTGGT TTTACCCGAA 1320
GGCGCTGTGC TAACCGCAA 1339

Claims (4)

1.一种可降解青霉素V钾的假苍白杆菌菌株（Pseudochrobactrum sp.），其特征在于，
该假苍白杆菌菌株以保藏编号CGMCC No. 15259，命名为假苍白杆菌X-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的可降解青霉素V钾的假苍白杆菌菌株作为降解青霉素V钾的用途。
3.根据权利要求2所述的可降解青霉素V钾的假苍白杆菌菌株作为降解青霉素V钾的用途，其特征在于，利用所述假苍白杆菌菌株用于青霉素V钾工业生产中发酵菌渣的处理。
4.一种组合物，其包含：如权利要求1所述的假苍白杆菌菌株。
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