CN116121099B - 红树林杆菌及其应用和秸秆纤维素降解方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种红树林杆菌，所述红树林杆菌的菌种保藏编号为CGMCC NO.23765，所述红树林杆菌的16s rDNA的基因序列如序列表SEQ ID No.1所示。该红树林杆菌应用于对秸秆的纤维素的降解。降解方法为：将红树林杆菌菌株涂布至LB固体平板中，培养2d；用无菌水将培养后的红树林杆菌菌株制成菌悬液；分别取5 mL的所述菌悬液接种于含有秸秆的培养基中，并于28℃、120 rpm环境下振荡培养；10 d后通过过滤的方法将残余秸秆取出，用蒸馏水和稀盐酸溶液冲洗去除无机盐以及秸秆上附着的菌体和CaCO3沉淀；80℃烘干至恒重，以失重法计算秸秆降解率。本发明的红树林杆菌具有高耐热能力、诱导产酶速度快和降解能力强等优点，对用于开发农业秸秆降解菌剂具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种红树林杆菌及其应用和秸秆纤维素降解方法。
背景技术
纤维素是地球上最丰富的可再生资源，经微生物代谢处理后，可以转化为能源、饲料及化工原料，也是生态系统碳循环的重要环节之一。自然界中存在很多能够降解纤维素的真菌和细菌，它们能够分泌多种纤维素酶类，如β-葡聚糖苷酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、过氧化物酶和酯酶等，并已经在食品、饲料、医药、纺织、洗涤剂和造纸工业等诸多领域开展工业应用。
另外，农业种植产生了大量秸秆废弃物。随着禁止秸秆焚烧政策的实施，需要新的环境友好型的方法来处理这些秸秆废弃物。相对于化学手段，基于纤维素酶或纤维素降解菌的生物处理手段对环境造成污染更低，但因微生物法通常用酶量大、成本高，目前尚难以广泛应用与秸秆废弃物的处理。因此，仍需从特殊生态环境中筛选产量高、分解能力强、适应范围广的纤维素降解菌，进而降低工业应用的成本。
红树林是热带、亚热带陆海交汇的海湾河口潮间带特有的木本植物群落。由于红树林区域土壤中含有大量纤维素、木质素和几丁质等大分子有机物，因此红树林土壤中的许多微生物，特别是真菌和放线菌，均可以产生各种纤维素降解酶。因此，红树林生态环境是重要的微生物菌种资源库，从红树林生态环境中筛选高效纤维素降解菌，具有较高的研究和工业应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用红树林杆菌降解秸秆纤维素的方法，以解决现有技术中的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明具体提供下述技术方案：
一种红树林杆菌，所述红树林杆菌的菌种保藏编号为CGMCC NO.23765，所述红树林杆菌的16s rDNA的基因序列如序列表SEQ ID No.1所示。
作为本发明一种优选的方案，所述红树林杆菌在培养基上培养48 h后，H17菌落呈圆形，乳白色隆起、边缘整齐光滑，革兰氏染色呈阴性。
作为本发明一种优选的方案，所述红树林杆菌在纤维素培养基上培养两天后，经刚果红染色显示水解圈直径（D）和菌落直径（d）分别为13.70 ± 2.33 mm，4.30 ± 0.67mm；D/d值为3.19。
本发明还提供了一种红树林杆菌的应用，应用于对秸秆的纤维素的降解。
作为本发明一种优选的方案，所述秸秆包括小麦秸秆、玉米秸秆、油菜秸秆和水稻秸秆。
本发明还提供了一种利用上述红树林杆菌降的秸秆纤维素降解方法，包括如下步骤：
步骤100、将红树林杆菌菌株涂布至LB固体平板上或者接种至LB液体培养基中，培养2d；
步骤200、用无菌水将培养后的红树林杆菌菌株制成菌悬液；
步骤300、分别取5 mL的所述菌悬液接种于含有秸秆的液体培养基中，并于28 ℃、120 rpm环境下振荡培养；
步骤400、10 d后将残余秸秆过滤出来，用蒸馏水和稀盐酸溶液冲洗去除无机盐以及秸秆上附着的菌体和CaCO3沉淀；
步骤500、80 ℃烘干至恒重，以失重法计算秸秆降解率。
作为本发明一种优选的方案，所述秸秆降解率的计算公式为：
秸秆降解率%=(W0-Wt)/W0×100%；
其中，W0代表初始秸秆干重；Wt代表培养t天后秸秆干重。
作为本发明一种优选的方案，所述秸秆降解培养基的组成为：1.0 g/L KH2PO4，0.1g/L NaCl，0.3 g/L MgSO4·7H2O，2.5 g/L NaNO3，0.1 g/L CaCl2，0.01 g/L FeCl3，蒸馏水定容至 1000 mL。
本发明与现有技术相比较具有如下有益效果：
本发明的红树林杆菌具有高耐热能力、诱导产酶速度快和降解能力强等优点，绿色环保，对环境友好，该菌株展现出良好的作物秸秆降解能力，对用于开发农业秸秆降解菌剂具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明红树林杆菌的菌落形态（a）和革兰氏染色结果（b）；
图2为本发明红树林杆菌的刚果红染色结果；
图3为本发明红树林杆菌的16srDNA序列系统发育树。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，保藏编号为CGMCC NO.23765的红树林杆菌主要采集于红树林环境样本，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年11月10日，分类命名为Mangrovibacter plantisponsor，红树林杆菌的16s rDNA的基因序列如序列表SEQ ID No.1所示。
红树林杆菌在培养基上培养48 h后的特点如下：
H17菌落呈圆形，乳白色隆起、边缘整齐光滑，革兰氏染色呈阴性。红树林杆菌经过刚果红染色后（如图2所示），水解圈直径（D）和菌落直径（d）分别为13.70 ± 2.33 mm，4.30± 0.67 mm；D/d值为3.19。
本发明还提供了一种红树林杆菌的应用，应用于对秸秆的纤维素的降解。
作为本发明一种优选的方案，所述秸秆包括小麦秸秆、玉米秸秆、油菜秸秆和水稻秸秆。
本发明还提供了一种利用上述红树林杆菌降的秸秆纤维素降解方法，包括如下步骤：
步骤100、将红树林杆菌菌株涂布至LB固体平板上或接种至液体培养基上，培养2d；
步骤200、用无菌水将培养后的红树林杆菌菌株制成菌悬液；
步骤300、分别取5 mL的所述菌悬液接种于含有秸秆的降解培养基中，并于28 ℃、120 rpm环境下振荡培养；
步骤400、10 d后将过滤秸秆取出，用蒸馏水和稀盐酸溶液冲洗去除无机盐以及秸秆上附着的菌体和CaCO3沉淀；
步骤500、80 ℃烘干至恒重，以失重法计算秸秆降解率。
作为本发明一种优选的方案，所述秸秆降解培养基的组成为：1.0 g/L KH2PO4，0.1g/L NaCl，0.3 g/L MgSO4·7H2O，2.5 g/L NaNO3，0.1 g/L CaCl2，0.01 g/L FeCl3，蒸馏水定容至 1000 mL。
下面，通过实施例对本发明进行更加详细的说明，但是不作为对本发明的限制。
实施例1 ：纤维素降解菌株筛选
（1）2021年4月28日采集佛山市滨江湿地公园的红树林环境样本。每处采集地表10cm内土壤5-10 g，共计采集5个样点，装入无菌袋，冰袋保存。
（2）取土壤样品10 g于250 mL三角瓶，在无菌条件下加入90 mL无菌水，于200rpm，28℃条件下振荡2 h。
取10 mL作为样品原液，采用稀释平板涂布法以10倍梯度将原液稀释至10-6，每个梯度分别取100 µL均匀涂布于固体培养基平板上，静置后，转移到28 ℃恒温培养箱中倒置培养。
菌落长出后，加入适量1 g/L刚果红染色液染色（如图2所示）1 h，然后用1 mol/L生理盐水进行冲洗，挑选菌落周围有明显透明圈的单个菌落，采用连续划线法在CMC固体培养基上反复划线纯化培养，直至得到纯菌落，对纯化后的菌株进行编号和保藏。
用无菌牙签挑取平板上的单菌落接种到含1 g/L刚果红的CMC固体培养基上，待菌落长出后，观察平板上透明圈，并用游标卡尺测定菌落直径（d）和透明圈直径（D）。
计算透明圈直径与菌落直径的比值（D/d），根据该比值筛选出纤维素降解能力较强的菌株。
结论：发现H17菌株具有较强的纤维素降解能力，拟进一步研究。
实施例2： H17菌株的分子生物学鉴定
（1）将H17菌株接种至200 mL LB液体培养液中，180 rpm，37 ℃下振荡培养48 h。
取150 µL菌液，采用细菌基因组DNA提取试剂盒（杭州博日）提取基因组DNA。
以DNA为模板，采用细菌通用引物进行16S rDNA的PCR扩增，引物序列为：上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。
其中，PCR反应体系25 µL：模板DNA 2 µL，上、下游引物（10 µmol/L）各1 µL，Taqmix 12.5 µL，ddH2O 8.5 µL。
其中，PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。
对PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，并将检测合格的PCR产物送华大基因测序。
（2）H17菌株测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对分析。使用MEGA 7.0软件，以邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树（如图3所示）。16S rDNA测序结果显示H17菌株与护岸植物红树林杆菌（Mangrovibacter plantisponsor strain k182）亲缘关系最近，相似性为98.89%，菌落形态和革兰氏染色结果也与之一致，如图1所示。
因此，可确定H17菌株为红树林杆菌的一株。
实施例3：H17菌株酶活测定
（1）将H17菌株接种至LB液体培养基中，28 ℃振荡培养48 h。
然后从中取1 mL菌液接种至200 mL LB液体培养基中，分别于34，36，38，40和42℃进行振荡培养，并于0，4，8，12，16和20 h各取培养液4 mL，收集到的菌液于4 ℃下8000rpm离心10 min，所得上清液即为粗酶液。
（2）配制1 mg/mL葡萄糖母液，分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL于洁净的比色管中，并用超纯水补足2 mL，之后加入2.5 mL DNS溶液并摇匀，沸水浴5 min，快速冷却后用蒸馏水定容至10 mL，混匀。
取100 μL 使用酶标仪测定540 nm 波长下的OD值，以540 nm处测出的OD值为纵坐标，以葡萄糖含量（mg）为横坐标绘制标准曲线，得到线性方程y=0.7815x - 0.0006, R² =0.9982。
（3）取4支规格相同的洁净试管，1支作为空白，其余3支为待测试管。准确量取1.5mL的 1% CMC-Na 标准溶液，分别加入 4支试管中，向3 支待测管中分别加入0.5 mL粗酶液，摇匀后将 4 支试管置于 50 ℃水浴锅中反应 30 min。
取出后向空白管加入0.5 mL煮沸灭活的粗酶液，充分摇匀后，立即向各试管中加入1.5 mL DNS 试剂，沸水浴10 min，取出快速冷却至室温，并分别向各试管中加蒸馏水定容至10 mL，摇匀后静置。
于540 nm下测定OD值，根据葡萄糖标准曲线确定还原糖含量，进而计算羧甲基纤维素酶活力。
（4）在16 h时，各温度处理组相比，H17菌株酶活大小依次为36℃ > 38℃>40℃ >34℃ > 42℃。
实施例4：红树林杆菌H17菌株对秸秆降解能力的测定
（1）将H17菌株涂布至LB固体平板上，培养2 d后，用无菌水制成菌悬液，分别取5mL菌悬液接种于含有秸秆的降解培养基中，28 ℃ 、120 rpm振荡培养。
其中，秸秆降解培养基组成为：1.0 g/L KH2PO4，0.1 g/L NaCl，0.3 g/L MgSO4·7H2O，2.5 g/L NaNO3，0.1 g/L CaCl2，0.01 g/L FeCl3，蒸馏水定容至 1000 mL。
所用秸秆分别来自小麦、玉米、油菜和水稻。
10 d后将过滤秸秆取出，用蒸馏水和稀盐酸溶液冲洗去除无机盐、秸秆上附着的菌体和CaCO3沉淀等，80 ℃烘干至恒重，以失重法计算秸秆降解率。
秸秆降解率%=(W0-Wt)/W0×100%；
其中，W0代表初始秸秆干重；Wt代表培养t天后秸秆干重。
（2）培养10天后，菌株H17对小麦、玉米、油菜和水稻4种秸秆均表现出一定的降解能力，10天的降解率分别为5.8%、13.5%、9.5%和12.4%。
综上，本发明的红树林杆菌具有高耐热能力、诱导产酶速度快和降解能力强等优点，绿色环保，对环境友好，该菌株展现出良好的作物秸秆降解能力，对用于开发农业秸秆降解菌剂具有重要意义。
以上实施例仅为本申请的示例性实施例，不用于限制本申请，本申请的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本申请的实质和保护范围内，对本申请做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本申请的保护范围内。
Claims (8)
1.一种红树林杆菌，其特征在于，所述红树林杆菌的菌种保藏编号为CGMCC NO.23765，所述红树林杆菌的16s rDNA的基因序列如序列表SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种红树林杆菌，其特征在于：所述红树林杆菌在培养基上培养48 h后，菌落呈圆形，乳白色隆起、边缘整齐光滑，革兰氏染色呈阴性。
3.根据权利要求1所述的一种红树林杆菌，其特征在于：所述红树林杆菌在纤维素培养基上培养两天后，经过刚果红染色显示水解圈直径D和菌落直径d分别为13.70 ± 2.33mm，4.30 ± 0.67 mm；D/d值为3.19。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的红树林杆菌的应用，其特征在于，应用于对秸秆的纤维素的降解。
5.根据权利要求4所述一种红树林杆菌的应用，其特征在于，所述秸秆包括小麦秸秆、玉米秸秆、油菜秸秆和水稻秸秆。
6.一种利用权利要求1-3任一项所述红树林杆菌的秸秆纤维素降解方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤100、将红树林杆菌菌株涂布至LB固体平板上或接种至LB液体培养液中，培养2d；
步骤200、用无菌水将培养后的红树林杆菌菌株制成菌悬液；
步骤300、分别取5 mL的所述菌悬液接种于含有秸秆的液体培养基中，并于28 ℃ 、120rpm环境下振荡培养；
步骤400、10 d后通过过滤的方法将残余秸秆取出，用蒸馏水和稀盐酸溶液冲洗去除无机盐以及秸秆上附着的菌体和CaCO3沉淀；
步骤500、80 ℃烘干至恒重，以失重法计算秸秆降解率。
7.根据权利要求6所述的一种秸秆纤维素降解方法，其特征在于，所述秸秆降解率的计算公式为：秸秆降解率%=(W0-Wt)/W0×100%；其中，W0代表初始秸秆干重；Wt代表培养t天后秸秆干重。
8.根据权利要求6所述的一种秸秆纤维素降解方法，其特征在于，秸秆降解培养基的组成为：1.0 g/L KH2PO4，0.1 g/L NaCl，0.3 g/L MgSO4·7H2O，2.5 g/L NaNO3，0.1 g/LCaCl2，0.01 g/L FeCl3，蒸馏水定容至 1000 mL。
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