CN114410521B - 一种具有降解聚乙烯功能的戈登氏菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种具有降解聚乙烯功能的戈登氏菌，该戈登氏菌的分类命名为食异戊二烯戈登氏菌(Gordonia Polyisoprenivorans)，所述戈登氏菌的保藏编号为CGMCC No.23920。该菌种具有降解聚乙烯的能力。

Description

一种具有降解聚乙烯功能的戈登氏菌及其应用

技术领域

本公开涉及微生物领域，具体地，涉及一种具有降解聚乙烯功能的戈登氏菌及其应用。

背景技术

聚乙烯(PE)是一种以乙烯为原材料的石油基高分子聚合物，化学结构中仅含有惰性的C-C和C-H键，具有成本低、韧性好等特点。目前，每年以聚乙烯为原材料制成的塑料产品可占所有塑料制品的64％。随着塑料制品生产速率的提高和使用量的增大，不易回收和难以降解的特性使其在环境中不断积累，其中一半以上被丢弃在环境中。以聚乙烯为主要成分的薄膜广泛应用于农业生产中，使用这种薄膜作为地膜可以保温保墒，防治病虫害进而提高农产品质量和产量。然而，由于收集和回收地膜十分困难，导致大量地膜碎片残留在耕地土壤中，更严重的是地膜碎片的积累使土壤孔隙度降低、空气循环减少、土壤肥力降低并导致土壤微生物群落发生变化，这些问题会影响种子萌发和幼苗生长，最终导致农作物减产以及产品质量下降等问题。

为了解决这一问题，建立绿色高效的废弃塑料资源回收利用技术，从源头解决塑料污染，成为发展可持续循环、绿色农业的关键。利用生物技术如微生物或酶将聚乙烯降解为寡聚体或单体，不仅不会产生二次污染物而且可将寡聚物或单体再进一步转化为高经济价值的产品，这或许可以成为废弃物污染治理和资源化利用的新途径。

现今研究中，已有报道了大量微生物可降解长链烷烃聚合物。目前，已有二十多个属的细菌被验证具有降解不同种类型聚乙烯的能力，包括芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、红球菌属(Rhodococcus)、窄养单胞菌属(Stenotrophomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和链球菌属(Streptococcus)等。然而，目前已发现的具有降解聚乙烯能力的微生物种类较少且存在降解效率低的问题。

发明内容

本公开的目的是提供一种戈登氏菌，该戈登氏菌具有降解聚乙烯功能。

为了实现上述目的，本公开第一方面提供一种具有降解聚乙烯功能的戈登氏菌，该戈登氏菌的分类命名为食异戊二烯戈登氏菌(Gordonia Polyisoprenivorans)，所述戈登氏菌的保藏编号为CGMCC No.23920。

可选地，所述戈登氏菌的16S rRNA基因的编码序列如SEQ ID NO：1所示。

本公开第二方面提供一种第一方面所述的戈登氏菌在降解聚乙烯中的应用。

本公开第三方面提供一种降解聚乙烯的方法，所述方法包括将第一方面所述的戈登氏菌与含有聚乙烯的物料混合并进行培养。

可选地，相对于所述含有聚乙烯的物料中每克的聚乙烯，所述戈登氏菌的使用量为1.5-2.0×10⁸CFU。

可选地，培养的温度为25-28℃，时间为20-30天。

通过上述技术方案，本公开所述的戈登氏菌具有降解聚乙烯的能力。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物材料保藏信息

本公开的戈登氏菌保藏编号为CGMCC No.23920，保藏日期为2021年11月16日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为食异戊二烯戈登氏菌(Gordonia Polyisoprenivorans)。

序列信息

SEQ ID NO.1：戈登氏菌(Gordonia Polyisoprenivorans)的16S rRNA基因的编码序列。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是以十六烷为唯一碳源进行筛选和富集后微生物群落门水平变化，其中，soil代表土壤样品，2-5HB1代表经培养一年富集物，2-5HB2代表经培养两年富集物，2-5HBS代表处理PE膜后悬浮于培养基中微生物，2-5HBPE代表附着于PE膜上的微生物。

图2是以十六烷为唯一碳源进行筛选和富集后微生物群落丰度前十的属水平变化。

图3是戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans B251以十六烷为碳源的生长情况。

图4是戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans B251以PE粉末为碳源的生长情况。

图5是2-5HB处理PE膜后红外结果。

图6是戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans B251处理PE膜后红外结果。

图7经戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans B251处理后的PE膜扫描电镜(SEM)结果。

图8是经戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans B251处理后的菌体周围PE表面扫描电镜结果。

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开第一方面提供一种具有降解聚乙烯功能的戈登氏菌，该戈登氏菌是发明人以十六烷为唯一碳源从土壤中筛选分离并富集得到的一种新的具有降解聚乙烯效果的纯系菌株，经鉴定该菌属于放线菌门戈登氏菌(Gordonia)属，被命名为食异戊二烯戈登氏菌(Gordonia Polyisoprenivorans)。该菌种已经在国家知识产权局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2021年11月16日，保藏编号为CGMCC No.23920。

本公开中，以十六烷为模式底物，首先筛选可以利用短链烷烃的微生物，降低微生物利用碳源的难度，其次微生物适应环境的能力强，变异能力强，长期的驯化可以使其适应并利用长链烷烃为碳源进行生长，为降解PE做准备。

根据本公开，所述戈登氏菌的16S rRNA基因的编码序列如SEQ ID NO：1所示。

本公开第二方面提供一种第一方面所述的戈登氏菌在降解聚乙烯中的应用。

本公开第三方面提供一种降解聚乙烯的方法，所述方法包括将第一方面所述的戈登氏菌与含有聚乙烯的物料混合并进行培养。

本公开中，经过戈登氏菌处理的PE膜表面产生了包括醚键(-C-O-C-)、羰基(-C＝O)、羟基(-OH)在内的含氧化合物，说明本公开所述的戈登氏菌具有使PE膜表面产生含氧官能团的能力，具有降解PE的潜力。本公开中降解PE膜不需要对PE膜进行氧化预处理。

根据本公开，相对于所述含有聚乙烯的物料中每克的聚乙烯，所述戈登氏菌的使用量为1.5-2.0×10⁸CFU。

根据本公开，培养的温度为25-28℃，时间为20-30天。

下面通过实施例来进一步举例说明本公开，但是本公开并不因此而受到任何限制。

实施例中所使用到的培养基：

(1)无机盐基础液体培养基(LM)：磷酸二氢钾0.7g/L，磷酸氢二钾0.7g/L，七水合硫酸镁0.7g/L，硝酸铵1.0g/L，硝酸钠1.0g/L，氯化钠0.005g/L，七水合硫酸亚铁0.002g/L，七水合硫酸锌0.002g/L；一水合硫酸锰0.001g/L。

(2)含有十六烷的液体培养基(LHM)：每100ml LM培养基中加入已过0.22μm无菌滤膜的十六烷1ml，作为该培养基中唯一碳源。

(3)含PE粉末的液体培养基(LPEM)：每100ml LM培养基中加入0.5g PE粉末，作为该培养基中唯一碳源。

(4)富营养培养基(LB)：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，1mol/L NaOH调pH至7.4。

上述培养基使用前均进行121℃，20min高温灭菌。

实施例1

本实施例用于说明以十六烷为碳源筛选富集过程中微生物群落的变化情况

实验方法：(1)从1克土壤样品的悬浊液中取1ml接种到100ml LHM培养基中，于28℃(150r/min)摇床中振荡，此后每隔一个月，取1ml培养物转接至新鲜100ml LHM培养基中。(2)两年后，将培养物离心收集处理PE膜，每100ml LM中放入3张2×2cm经过2％十二烷基硫酸钠水溶液(SDS)、75％酒精溶液、无菌水冲洗的PE膜，28℃(150r/min)摇床中振荡，处理一个月后收集悬浮液中的菌体，以及附着于PE膜上的生物膜。(3)将土壤，经一年筛选后的培养物，经两年筛选后的培养物，悬浮液中的菌体，PE膜上的生物膜五种样品分别取三个平行测16S rRNA微生物群落多样性。

实验结果如图1和图2所示。

结果表明：从门水平来看(图1)，放线菌门经过十六烷的筛选逐渐成为优势菌门。从丰度前十的属水平来看(图2)，属于放线菌门的戈登氏菌属(Gordonia)经过十六烷的筛选逐渐成为优势菌群。

经过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心鉴定，该菌株属于戈登氏菌(Gordonia)属；被命名为食异戊二烯戈登氏菌(Gordonia Polyisoprenivorans)。

实施例2

本实施例用于说明对戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans扩增得到的16S rRNA基因进行测序

将实施例1分离得到的戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans B251基因组使用OMEGA公司的细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取。戈登氏菌GordoniaPolyisoprenivorans的16S rRNA基因的编码序列扩增所用的通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。扩增所用的试剂盒购买于天根生化科技(北京)有限公司。

正向引物

27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，SEQ ID NO：2)

反向引物

1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，SEQ ID NO：3)

表1为PCR扩增体系：

表1

表2为PCR反应程序：

表2

将扩增得到的PCR产物序列，连接于天根生化科技(北京)有限公司的T4载体上，对插入序列进行测序。测序得到的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例3

本实施例用于说明戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans分别以十六烷、PE粉末为碳源时的生长情况

实验方法：戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans B251和Enterobactersp.D1，Enterobacter sp.D1是一株已被报道具有聚乙烯降解功能的菌，用于比较(Ren,L.,Men,L.,Zhang,Z.,Guan,F.,Tian,J.,Wang,B.,Wang,J.,Zhang,Y.,Zhang,W.,2019.Biodegradation of polyethylene by Enterobacter sp.D1 from the guts ofwax moth Galleria mellonella.International Journal ofEnvironmental Researchand Public Health 16.)。经LB培养基28℃，120rpm活化培养后，在4℃下，进行冷冻离心收集菌体，8000g，5min，随后使用LM培养基冲洗两遍菌体以洗去营养物质。最后一遍重悬菌体取1ml加入100ml LPEM培养基中，每日使用紫外分光光度计测量OD600处吸光度值以确定微生物生长情况。

实验结果如图3和图4所示。

结果表明：经十六烷驯化培养后的戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans B251相比对D1利用PE粉末生长更快，且未经驯化的D1在十六烷中不生长。

从图3中可以看出，D1在十六烷中不生长，而戈登氏菌GordoniaPolyisoprenivorans B251在培养至两天时进入对数生长期，第三天进入平台期后OD600值开始下降，可能原因是D1虽然已被证明具有聚乙烯降解效果，但是未经过十六烷的驯化培养，因此无法利用十六烷进行生长，而戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans B251在后期OD值下降可能是因为菌体附着于十六烷液滴上进而导致菌体量减少。从图4中可以看出，戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans B251和D1均能利用PE粉末进行生长，但戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans B251相对于D1生长更快，更早进入平台期。以PE粉末为碳源时，B251在第三天进入对数生长期，在第八天进入平台期。

实施例4

本实施例用于说明经两年驯化后的培养物2-5HB及单菌戈登氏菌GordoniaPolyisoprenivorans处理PE膜后傅里叶红外(FTIR)检测结果

实验方法：将PE膜经过2％十二烷基硫酸钠水溶液(SDS)、75％酒精溶液、无菌水冲洗后，用培养物在28℃、120r/min的条件下摇床振荡处理PE膜；然后每100ml LM中放入3张2×2cm经过2％十二烷基硫酸钠水溶液(SDS)、75％酒精溶液、无菌水冲洗的PE膜，28℃(150r/min)摇床中振荡，处理一个月后，将PE膜捞出，经2％SDS过夜震荡清洗后，用无菌水进行清洗取出PE膜后放置于超净台中风干，之后上机检测。单菌除去营养物质收集菌体后做同样处理。

实验结果如图5和图6所示。

结果表明：从图5中可以看出，与对照(control)相比，经过2-5HB处理的PE膜表面产生了包括醚键(-C-O-C-)、羰基(-C＝O)、羟基(-OH)在内的含氧化合物，从2-5HB中分离得到的单菌戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans B251处理PE膜也得到了同样的结果。说明戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans B251具有使PE膜表面产生含氧官能团的能力，具有降解PE的能力。

经过戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans B251处理后的PE膜扫描电镜结果如图7所示。

图7中a、b、c为空白对照，观测电镜倍数分别为×500、×5.00k、×20.0k。对应d、e、f为经B251处理后的PE膜表面。

结果表明：从图7中可以看出，与对照相比，尽管对PE膜进行了强有力的清洗，仍有紧紧附着于膜表面的生物膜，类似于“嵌入”膜的表面，降低PE膜表面的疏水性，使其更易于利用菌本身的生长。从图e、f可明显看出生物膜周围，PE表面产生裂纹，这可能是由于菌附着于膜的表面产生了一定的表面张力，进而导致PE膜表面产生裂纹。

经过戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans B251处理后的菌体周围PE膜表面扫描电镜结果如图8所示。

图8中a、b、c、d的电镜放大倍数分别为：×20.0k、×30.0k、×50.0k、×50.0k。

结果表明：从图8中可以看出，在戈登氏菌Gordonia Polyisoprenivorans B251菌体周围，PE膜表面产生了明显的裂纹。

综上所述，本公开从常年被污染的垃圾填埋场土壤中经长链烷烃十六烷为碳源驯化土壤微生物得到最后的筛选富集培养物2-5HB，而后又从富集培养物中分离并鉴定物种，得到Gordonia Polyisoprenivorans B251，从其生长情况、处理PE膜后傅里叶红外结果、场发扫描电镜结果可以得出，该菌株具有利用PE进行生长的能力，并可以对PE产生降解效果。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所

<120> 一种具有降解聚乙烯功能的戈登氏菌及其应用

<130> 23744CAAS-E-HDF

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1435

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctacttgagc ggcgtgctta cacatgcaag tcgaacggaa aggccctgct tgcagggtgc 60

tcgagtggcg aacgggtgag taacacgtgg gtgatctgcc cctgactttg ggataagcct 120

gggaaactgg gtctaatacc ggatatgacc atgggatgca tgttctgtgg tggaaagctt 180

ttgcggttgg ggatgggccc gcggcctatc agcttgttgg tggggtaatg gcctaccaag 240

gcgacgacgg gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc 300

agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc 360

gacgccgcgt gagagatgac ggccttcggg ttgtaaacct ctttcagcag ggacgaagcg 420

cgagggacgg tacctgcaga agaagcaccg gccaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480

cgtagggtgc ggagcgttgt ccggaattac tgggcgtaaa gagctcgtag gcggtttgtc 540

gcgtcgtctg tgaaattctg cagcttaact gcaggcgtgc aggcgatacg ggcagacttg 600

agtactacag gggagactgg aattcctggt gtagcggtga aatgcgcaga tatcaggagg 660

aacaccggtg gcgaaggcgg gtctctgggt agtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg 720

gtagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacggtgggt actaggtgtg 780

ggttccattt cacgggatcc gtgccgtagc taacgcatta agtacccccc ctggggagta 840

cgcccgcaag gctaaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg cggaccatgt 900

ggattaattc gatgcaacgc gaagaacctt acctgggttt gacatacacc agacgccagc 960

agagatgttg gttcccttgt ggttggtgtc caggtggtgc atggctgtcg tcagttcgtg 1020

tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcctgta ttgccagcgg 1080

gttatgccgg ggacttgcag gagactcccg gggtcaattc ggaggaaggt ggggatgacg 1140

tcaagtcatc atgcccctta tgtccagggc ttcccccatg ttccaatggc cggtccagag 1200

ggctgcgatc ccgtgaggtg gagggaatcc cttaaacccg gtttcagttc ggatcggggt 1260

ctccaactcg cccccgtgaa gtcggagtcg ttagtaatcg cagatcagca acgctgcggt 1320

gaatacgttc ccggcccttg tcccccccgc ccgtcacgtc atgaaagtcg gtaccacccg 1380

aagccggtgc cctaccccct tgtgggaggg agctgtcgaa ggtgatcgca gtcct 1435

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (6)

1.一种具有降解聚乙烯功能的食异戊二烯戈登氏菌(GordoniaPolyisoprenivorans)，所述食异戊二烯戈登氏菌的保藏编号为CGMCC No.23920。

2.根据权利要求1所述的食异戊二烯戈登氏菌，其中，所述食异戊二烯戈登氏菌的16SrRNA基因的编码序列如SEQ ID NO：1所示。

3.权利要求1或2所述的食异戊二烯戈登氏菌在降解聚乙烯中的应用。

4.一种降解聚乙烯的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1或2所述的食异戊二烯戈登氏菌与含有聚乙烯的物料混合并进行培养。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，相对于所述含有聚乙烯的物料中每克的聚乙烯，所述食异戊二烯戈登氏菌的使用量为1.5-2.0×10⁸CFU。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，培养的温度为25-28℃，时间为20-30天。