CN118086150B - 一株耐盐的pbat降解菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株耐盐的PBAT降解菌及其应用。本发明从滨海盐土中分离得到一株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)S6966‑3菌株,该菌株已于2024年03月20日保存于广东省微生物菌种保藏中心,保藏号为GDMCC No:64439。S6966‑3菌株属于聚对苯二甲酸‑己二酸丁二醇酯(PBAT)的高效降解菌,可以利用PBAT地膜作为唯一碳源进行生长,对PBAT地膜具有较好的降解效果;并且S6966‑3菌株具有较好的耐盐性,在较高的盐浓度范围内仍然能够正常生长,同时在高盐浓度下也能够很好地降解PBAT,丰富了PBAT降解菌的菌种资源,对改善滨海盐土的土壤质量、降解塑料污染物具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于微生物降解技术领域。更具体地,涉及一株耐盐的PBAT降解菌及其应用。
背景技术
随着新材料新技术的研究,利用沸石、覆盖地膜等措施改良盐碱地也广泛被应用。在淡水资源匮乏,排水设施不完善的情况下,采用地面覆膜是减少土壤盐分积聚最重要的手段。地膜覆盖实际上是为了保水保墒,减少水分蒸发,从而阻止盐分在土壤表层和植物根系的积累,防止土壤返盐的一种措施。有研究表明,地膜覆盖可以有效的保持地表和根系层土壤水分,减少盐分积累,并缓解水盐运动剧烈变化,能够极大的提高农业的产量和效益。
然而,大量农业地膜的使用使农田中残留了大量的塑料,给土壤和环境造成了严重的污染。传统塑料主要是以石油为原料,具有较好的抗变形能力和稳定性,由于这些塑料不易降解,废弃塑料造成的“白色污染”日益加剧。塑料“白色污染”问题亟待解决,环境友好型可降解塑料已被公认为是解决该问题的重要途径之一,引起科研人员的广泛关注。长期覆盖传统地膜的土壤中残留塑料越积越多,这些残留的地膜会阻碍土壤毛管水和自然水的渗透,影响土壤吸湿性,降低土壤的通透性,影响微生物活动和土壤肥力水平,还可能导致地下水难以下渗,造成土壤次生盐碱化,最终影响土壤质量和作物产量。
生物降解地膜被认为是传统塑料地膜的一种有前景的替代品,因为它对作物生长发育及作物品质有类似的积极影响,同时可以在土壤中降解为二氧化碳、水和矿物质。聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯(poly(butylene adipate terephthalate),简称PBAT)作为可替代传统塑料的可生物降解塑料,PBAT地膜因在环境中具有良好的降解性能,有望成为地膜生产中的主要成分。尽管生物降解地膜相比于传统地膜,存留时间较短,但也会产生微塑料,仍然会造成土壤污染。
而通过微生物的作用,高分子聚合物可以逐渐降解为较小的分子,减轻其对生态系统的不良影响,如现有技术公开的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、极小单孢菌(Pusillimonassp.)、斯氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等微生物菌株能降解PBAT地膜,但目前用于PBAT的降解菌株还较少,对PBAT的降解率较低,在10%左右,其降解效率还有待提升;更何况是在高盐环境中,能用于滨海盐土中降解PBAT的微生物菌株还鲜有报道。因此,还需研发出更多的、能够高效降解PBAT的微生物菌株,能用于滨海盐土中,有助于改善土壤质量,提高土地利用效率,对于农田土壤和生态环境具有重要经济价值和现实意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有PBAT降解菌的不足,提供一株耐盐的PBAT降解菌及其应用。
本发明的目的是提供一株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)S6966-3菌株。
本发明另一目的是提供蜡样芽孢杆菌S6966-3菌株的应用。
本发明又一目的是提供一种聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯的降解剂。
本发明再一目的是提供一种降解含聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯的塑料制品的方法。
本发明还一目的是提供一种改善海滨盐土中聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯塑料污染的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明提供一株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)S6966-3菌株,该菌株已于2024年03月20日保存于广东省微生物菌种保藏中心,保藏号为GDMCC No:64439,保藏地址为广州市先烈中路100大院59号楼5楼;蜡样芽孢杆菌S6966-3菌株从滨海盐土中分离得到,该菌株为革兰氏阳性芽胞杆菌,其菌落为灰白色,不透明,表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状,边缘常呈扩展状,直径为4 mm~10 mm;S6966-3菌株在厌氧条件下能发酵葡萄糖菌株,不发酵甘露醇和木糖;与接触酶、水解酶和过氧化氢酶反应呈阳性,但VP试验呈阳性、甲基红试验呈阴性;S6966-3菌株具有较好的耐盐性,在较高的盐浓度范围内仍然能够正常生长。
本发明研究显示S6966-3菌株属于聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯(PBAT)高效降解菌,可以利用PBAT地膜作为唯一碳源进行生长,对PBAT地膜具有较好的降解效果;同时,S6966-3菌株在高盐浓度下也能够很好地降解PBAT,能用于滨海盐土中塑料污染物的降解,对改善滨海盐土的土壤质量、降解塑料污染物具有重要的意义。
本发明提供蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)S6966-3菌株其菌液的以下应用:
在生物降解聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯中的应用。
在降解含聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯的塑料制品中的应用。
在聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯塑料污染环境治理中的应用。
在高盐环境中降解聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯塑料污染中的应用。
进一步地,所述高盐环境指环境中的盐浓度为2~10%。
在改善海滨盐土的聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯塑料污染中的应用。
在制备聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯降解剂中的应用。
本发明提供一种聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯降解剂,含蜡样芽孢杆菌S6966-3菌株。
进一步地,所述降解剂含有S6966-3菌株的培养物、培养菌悬液或发酵液。
本发明提供一种降解含聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯的塑料制品的方法,采用上述降解剂进行处理。
本发明还提供一种改善海滨盐土中聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯塑料污染的方法,在海滨盐土中使用S6966-3菌株或其菌液,或采用上述降解剂对土壤进行处理。
优选地,所述菌液浓度不低于1×108cfu/mL。
本发明具有以下有益效果:
本发明公开了一株耐盐的PBAT降解菌及其应用,该降解菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)S6966-3菌株,S6966-3菌株可以利用PBAT地膜作为唯一碳源进行生长,作用于PBAT地膜上,能引发水解作用,导致分子链断裂,对PBAT地膜具有较好的降解效果;并且S6966-3菌株具有较好的耐盐性,在较高的盐浓度范围内仍然能够正常生长,同时在高盐浓度下也能够很好地降解PBAT,能用于高盐环境中降解PBAT的塑料污染,改善海滨盐土的土壤质量、塑料污染。本发明丰富了PBAT降解菌的菌种资源,对改善滨海盐土的土壤质量、降解塑料污染物具有重要的意义。
附图说明
图1是菌株S6966-3在改良的SM液体培养基中的生长曲线图。
图2是菌株S6966-3降解PBAT地膜的SEM对比图(A:CK;B:S6966-3处理)。
图3是菌株S6966-3降解PBAT地膜的傅里叶红外光谱对比图。
图4是菌株S6966-3在LB培养基上的菌落形态图。
图5是用MEGA 10.1构建的菌株S6966-3的系统进化树分析图。
图6是蜡样芽孢杆菌S6966-3在不同盐浓度下的生长曲线图。
图7是蜡样芽孢杆菌S6966-3在不同盐浓度下的PBAT降解效率柱状图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例中使用培养基如下:
改良的SM培养基(无碳源):NH4NO31.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、K2HPO41.0 g/L、CaCl2·2H2O 0.1 g/L、KCl 0.15 g/L、FeSO4·6H2O 0.001 g/L、ZnSO4·7H2O 0.001 g/L、MnSO40.001 g/L,pH调至7.4 ± 0.2,121℃灭菌20 min;固体改良的SM培养基在其基础上添加琼脂粉15~20 g/L。
LB培养基:酵母提取物5 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,水1000 mL,pH 7.4~7.6;LB固体培养基在其基础上添加琼脂粉:18~20 g。
实施例1 PBAT降解菌的筛选和分离
从湛江市徐闻县南山镇南山村附近采集滨海盐土土壤样品,土壤盐度为0.6%。准确称取土样样品1.0 g,风干研磨分散均匀,以1:10质量比溶入无菌水中,过滤取滤液作为10-1初始液,依次获得10-2和10-3土壤梯度稀释液。分别在固体改良的SM培养基上进行稀释涂布并覆盖PBAT地膜(购买于山东省高密市恒润塑料有限公司),28℃培养5~7 d,直至有单个菌落长出,挑取单菌落在LB培养基上纯化,至最终获得单一菌株,命名为S6966-3。
将PBAT地膜统一剪成2.0 cm×2.0 cm大小的膜片,用3% KCl溶液浸泡1 h,再用100%无水乙醇清洗3~4次,最后无菌水润洗,放入干燥无菌的培养皿中烘干后在紫外灯下照射灭菌4 h,放入改良的SM培养基(液体培养基)中,然后接种上述获得的单菌株S6966-3,每组3个重复,置于28℃震荡培养箱中培养,观察菌落长势,并反复筛选,选出具有PBAT地膜降解效果的菌株,菌株S6966-3的生长曲线图如图1所示。
PBAT地膜降解实验室模拟:在无菌操作台上,并将PBAT地膜统一剪成2.0 cm×2.0cm大小的膜片,称取其初始质量,记为M0。首先用3% KCl溶液浸泡1h,再用100%无水乙醇清洗3~4次,之后用无菌水润洗,再放入干燥无菌的培养皿中烘干后在紫外灯下照射灭菌4h。
将纯化后的菌株S6966-3于28℃下LB液体培养18 h后,于12000 rpm转速下离心10min获得菌体,加等体积PBS液体重悬并离心2次后,将获得的菌体用PBS配制成1×108cfu/mL的S6966-3菌液。
将灭菌后的PBAT地膜和S6966-3菌液加入到100 mL改良的SM培养基(液体培养基)中,并设置只加入空白对照组(CK),分别在第10 d、20 d、30 d和40 d记录菌液的OD600nm,于第40 d取出PBAT膜片,烘干后称取PBAT地膜的剩余质量M1,采用失重法计算PBAT地膜降解效率ŋ,通过扫描电镜观察PBAT地膜降解情况,并利用傅里叶红外光谱测定PBAT地膜的化学官能团变化。
失重法计算公式如下:
降解效率ŋ=(M0−M1)/M0×100%
经扫描电镜观察,对比CK和S6966-3处理40 d的PBAT膜片SEM图,结果如图2所示,对照组CK,PBAT膜片表面较为平整,无裂(图2A),菌株S6966-3处理的PBAT膜片变得粗糙不平,出现明显的侵蚀孔洞和清晰的裂痕等微观形态(图2B);PBAT地膜在500~4000 cm-1之间的傅里叶红外谱图如图3所示,在2956 cm-1、1723 cm-1和732 cm-1的振动峰有明显削弱和位置偏移,位于1723 cm-1一处的峰为羰基吸收峰(C=O),随着降解时间的延长,羰基吸收峰明显增强,可能是生物降解地膜中的酯键发生断裂由此形成大量羰基、CH键、C—O—C键减弱,说明在微生物菌株S6966-3的作用下引发水解作用,最后导致分子链断裂,PBAT地膜发生降解,并且通过失重法统计得到PBAT的降解效率为43.33%。
实施例2 菌株特性鉴定
1、菌株形态特性
通过平板划线法观察菌落形态,取活化的菌株进行革兰氏染色,通过光学显微镜观察菌体及芽孢形态。S6966-3的菌落形态如图4所示,菌落为灰白色,不透明,表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状,边缘常呈扩展状,直径为4 mm~10 mm;经革兰氏染色鉴定,S6966-3菌株为革兰氏阳性芽胞杆菌。
2、菌株的生理生化特性
参照东秀珠等编写的《常见细菌系统鉴定手册》的方法,利用细菌微量生化鉴定管对菌株进行生理生化鉴定。结果显示S6966-3菌株在厌氧条件下能发酵葡萄糖菌株,不发酵甘露醇和木糖;与接触酶、水解酶和过氧化氢酶反应呈阳性,但VP试验呈阳性、甲基红试验呈阴性。
3、分子生物学鉴定
采用试剂盒法提取细菌总DNA,并采用细菌16S rDNA通用引物27F和1492R,进行PCR扩增细菌的16S rDNA,将PCR扩增产物回收后进行序列测定,测序结果显示菌株S6966-3的核苷酸序列SEQ ID NO:1所示,再将获得的DNA序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行Blast比对分析,并采用MEGA10.1软件构建系统发育树。
构建的系统发育树如图5所示,显示本发明分离鉴定的菌株S6966-3的16S rDNA序列和与GenBank中蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)具有较高的同源性。并综合上述菌株形态特性、生理生化特性、分子生物学鉴定的结果,将菌株S6966-3的分类学归属于芽孢杆菌属(Bacillus)中的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌种,命名为S6966-3菌株,并于2024年03月20日保存于广东省微生物菌种保藏中心,保藏号为GDMCC No:64439,保藏地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例3 盐浓度对菌株生长的影响
本实施例对蜡样芽孢杆菌S6966-3的生长特性进行研究,建立其生长曲线,具体方法为:将蜡样芽孢杆菌S6966-3单菌落接种到LB培养基中(10 mL)进行隔夜培养(28℃,150rpm,10-12 h)活化;并用移液枪准确吸取1 mL菌液进行10倍梯度稀释,稀释至10-1010倍;取稀释倍数为102、104、106与108的蜡样芽孢杆菌S6966-3菌液进行平板计数培养,取1 mL稀释菌液均匀涂布于平板;并在恒温箱中28℃隔夜培养,选取合适的平板计数。
按照上述方法,每隔2 h以10倍梯度稀释一次,平板计数法得到细菌数;6 h后,取稀释倍数为101、103、105、106、107、108、109与1010的菌液按平板计数法记录得到原液中的细菌数;之后每隔2 h稀释,隔夜培养,菌落计数一次,直至第24 h的细菌数。
设定一系列盐度梯度0%、2%、4%、6%、8%和10%的LB培养基,重复以上步骤,得到不同盐度梯度培养基,分别统计蜡样芽孢杆菌S6966-3在不同盐浓度下的生长曲线。
蜡样芽孢杆菌S6966-3在不同盐浓度下的生长曲线统计结果如图6所示,可以得出,蜡样芽孢杆菌S6966-3的迟缓期比较长,0 h~8 h内,所有设定的盐浓度下细菌数保持稳定,新增殖的细菌数与死亡的细菌数相等;8 h~12 h内,正常生长条件下蜡样芽孢杆菌S6966-3达到对数期,细菌数显著增加,表明蜡样芽孢杆菌S6966-3具有一定的耐盐机制,使蜡样芽孢杆菌S6966-3在一定盐浓度范围内仍然能够正常生长,在8%和10%盐浓度下细菌数先保持稳定然后开始减少;10 h~14 h内,盐浓度为0%、2%和4%条件下,细菌生长活跃,蜡样芽孢杆菌细菌数显著增加;在8 h~16 h内,盐浓度为6%的条件下,细菌缓慢增加。整体来看,8%和10%盐浓度下,蜡样芽孢杆菌S6966-3生长趋势一致,细菌数先保持稳定,后逐渐下降;盐浓度为0%、2%、4%和6%条件下,蜡样芽孢杆菌生长趋势大致相同,细菌数先保持稳定,后显著增加,再减少。
综上显示蜡样芽孢杆菌S6966-3具有一定的耐盐能力,在2~10%的盐浓度范围内仍然能够正常生长,其中在2%和4%盐浓度下,蜡样芽孢杆菌生长效果较好。
实施例4 盐浓度对蜡样芽孢杆菌S6966-3降解PBAT的影响
不同盐浓度下PBAT地膜降解实验室模拟:在无菌操作台上,并将PBAT地膜统一剪成2.0 cm×2.0 cm大小的膜片,称取其初始质量,记为M0。首先用3% KCl溶液浸泡1 h,再用100%无水乙醇清洗3~4次,之后用无菌水润洗,再放入干燥无菌的培养皿中烘干后在紫外灯下照射灭菌4 h。将获得的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)S6966-3菌株于28℃下LB液体培养18 h后,于12000 rpm转速下离心10 min获得菌体,加等体积PBS液体重悬并离心2次后,将获得的菌体用PBS配制成1×108cfu/mL蜡样芽孢杆菌S6966-3菌液。将灭菌后的PBAT地膜和蜡样芽孢杆菌S6966-3菌液分别加入到0%、2%、4%、6%、8%和10%盐浓度的改良的SM培养基(液体培养基)中培养。于第40 d取出PBAT膜片,烘干后称取PBAT地膜的剩余质量M1,采用失重法计算PBAT地膜在不同盐浓度下的降解效率ŋ,计算方法同实施例1。
统计结果如图7所示,显示蜡样芽孢杆菌S6966-3在0%~4%盐浓度下对PBAT地膜的降解效果较好,其中2%盐浓度下降解效率最高。PBAT地膜的降解效率在6%~10%盐浓度中降解率逐渐降低,与2%盐浓度相比,6%、8%和10%盐浓度处理的PBAT地膜降解效率分别降低了47.01%、81.35%和93.39%。表明蜡样芽孢杆菌S6966-3在0%~4%盐浓度条件下,能够明显促进PBAT地膜的降解,能够应用于高盐土壤环境中PBAT地膜的降解,如应用到海滨盐土中,对改善滨海盐土的土壤质量、降解塑料污染物具有重要的意义。
综上,本发明公开了一株耐盐的PBAT降解菌及其应用,该降解菌为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)S6966-3菌株,属于PBAT高效降解菌,可以利用PBAT地膜作为唯一碳源进行生长,作用于PBAT地膜上,能引发水解作用,导致分子链断裂,对PBAT地膜具有较好的降解效果;并且S6966-3菌株具有较好的耐盐性,在较高的盐浓度范围内仍然能够正常生长,同时在高盐浓度下也能够很好地降解PBAT,能用于高盐环境中降解PBAT的塑料污染,改善海滨盐土的土壤质量、塑料污染。本发明丰富了PBAT降解菌的菌种资源,对改善滨海盐土的土壤质量、降解塑料污染物具有重要的意义。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1. 一株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)S6966-3菌株,其特征在于,所述菌株已于2024年03月20日保存于广东省微生物菌种保藏中心,保藏号为GDMCC No:64439。
2.权利要求1所述S6966-3菌株或其菌液在生物降解聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯或在降解含聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯的塑料制品中的应用。
3.权利要求1所述S6966-3菌株或其菌液在聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯塑料污染环境治理中的应用。
4.权利要求1所述S6966-3菌株或其菌液在改善海滨盐土的聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯塑料污染中的应用。
5.权利要求1所述S6966-3菌株或其菌液在制备聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯降解剂中的应用。
6.一种聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯的降解剂,其特征在于,含权利要求1所述S6966-3菌株。
7.根据权利要求6所述降解剂,其特征在于,所述降解剂含有S6966-3菌株的培养菌悬液。
8.一种降解含聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯的塑料制品的方法,其特征在于,采用权利要求6或7所述降解剂进行处理。
9.一种改善海滨盐土中聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯塑料污染的方法,其特征在于,在海滨盐土中使用权利要求1所述S6966-3菌株或其菌液,或采用权利要求6或7所述降解剂对土壤进行处理。
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Screening and characterization of novel lipase producing Bacillus species from agricultural soil with high hydrolytic activity against PBAT poly (butylene adipate co terephthalate) co-polyesters;Aqsa kanwal等;《Polymer Bulletin》;20220104;第79卷;摘要,第10062页 * |
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