CN118086150B - 一株耐盐的pbat降解菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株耐盐的PBAT降解菌及其应用。本发明从滨海盐土中分离得到一株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）S6966‑3菌株，该菌株已于2024年03月20日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：64439。S6966‑3菌株属于聚对苯二甲酸‑己二酸丁二醇酯（PBAT）的高效降解菌，可以利用PBAT地膜作为唯一碳源进行生长，对PBAT地膜具有较好的降解效果；并且S6966‑3菌株具有较好的耐盐性，在较高的盐浓度范围内仍然能够正常生长，同时在高盐浓度下也能够很好地降解PBAT，丰富了PBAT降解菌的菌种资源，对改善滨海盐土的土壤质量、降解塑料污染物具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于微生物降解技术领域。更具体地，涉及一株耐盐的PBAT降解菌及其应用。
背景技术
随着新材料新技术的研究，利用沸石、覆盖地膜等措施改良盐碱地也广泛被应用。在淡水资源匮乏，排水设施不完善的情况下，采用地面覆膜是减少土壤盐分积聚最重要的手段。地膜覆盖实际上是为了保水保墒，减少水分蒸发，从而阻止盐分在土壤表层和植物根系的积累，防止土壤返盐的一种措施。有研究表明，地膜覆盖可以有效的保持地表和根系层土壤水分，减少盐分积累，并缓解水盐运动剧烈变化，能够极大的提高农业的产量和效益。
然而，大量农业地膜的使用使农田中残留了大量的塑料，给土壤和环境造成了严重的污染。传统塑料主要是以石油为原料，具有较好的抗变形能力和稳定性，由于这些塑料不易降解，废弃塑料造成的“白色污染”日益加剧。塑料“白色污染”问题亟待解决，环境友好型可降解塑料已被公认为是解决该问题的重要途径之一，引起科研人员的广泛关注。长期覆盖传统地膜的土壤中残留塑料越积越多，这些残留的地膜会阻碍土壤毛管水和自然水的渗透，影响土壤吸湿性，降低土壤的通透性，影响微生物活动和土壤肥力水平，还可能导致地下水难以下渗，造成土壤次生盐碱化，最终影响土壤质量和作物产量。
生物降解地膜被认为是传统塑料地膜的一种有前景的替代品，因为它对作物生长发育及作物品质有类似的积极影响，同时可以在土壤中降解为二氧化碳、水和矿物质。聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯（poly（butylene adipate terephthalate），简称PBAT）作为可替代传统塑料的可生物降解塑料，PBAT地膜因在环境中具有良好的降解性能，有望成为地膜生产中的主要成分。尽管生物降解地膜相比于传统地膜，存留时间较短，但也会产生微塑料，仍然会造成土壤污染。
而通过微生物的作用，高分子聚合物可以逐渐降解为较小的分子，减轻其对生态系统的不良影响，如现有技术公开的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、极小单孢菌（Pusillimonassp.）、斯氏假单胞菌（pseudomonas stutzeri）以及枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等微生物菌株能降解PBAT地膜，但目前用于PBAT的降解菌株还较少，对PBAT的降解率较低，在10%左右，其降解效率还有待提升；更何况是在高盐环境中，能用于滨海盐土中降解PBAT的微生物菌株还鲜有报道。因此，还需研发出更多的、能够高效降解PBAT的微生物菌株，能用于滨海盐土中，有助于改善土壤质量，提高土地利用效率，对于农田土壤和生态环境具有重要经济价值和现实意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有PBAT降解菌的不足，提供一株耐盐的PBAT降解菌及其应用。
本发明的目的是提供一株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）S6966-3菌株。
本发明另一目的是提供蜡样芽孢杆菌S6966-3菌株的应用。
本发明又一目的是提供一种聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯的降解剂。
本发明再一目的是提供一种降解含聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯的塑料制品的方法。
本发明还一目的是提供一种改善海滨盐土中聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯塑料污染的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）S6966-3菌株，该菌株已于2024年03月20日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：64439，保藏地址为广州市先烈中路100大院59号楼5楼；蜡样芽孢杆菌S6966-3菌株从滨海盐土中分离得到，该菌株为革兰氏阳性芽胞杆菌，其菌落为灰白色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状，直径为4 mm～10 mm；S6966-3菌株在厌氧条件下能发酵葡萄糖菌株，不发酵甘露醇和木糖；与接触酶、水解酶和过氧化氢酶反应呈阳性，但VP试验呈阳性、甲基红试验呈阴性；S6966-3菌株具有较好的耐盐性，在较高的盐浓度范围内仍然能够正常生长。
本发明研究显示S6966-3菌株属于聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯（PBAT）高效降解菌，可以利用PBAT地膜作为唯一碳源进行生长，对PBAT地膜具有较好的降解效果；同时，S6966-3菌株在高盐浓度下也能够很好地降解PBAT，能用于滨海盐土中塑料污染物的降解，对改善滨海盐土的土壤质量、降解塑料污染物具有重要的意义。
本发明提供蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）S6966-3菌株其菌液的以下应用：
在生物降解聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯中的应用。
在降解含聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯的塑料制品中的应用。
在聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯塑料污染环境治理中的应用。
在高盐环境中降解聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯塑料污染中的应用。
进一步地，所述高盐环境指环境中的盐浓度为2~10%。
在改善海滨盐土的聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯塑料污染中的应用。
在制备聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯降解剂中的应用。
本发明提供一种聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯降解剂，含蜡样芽孢杆菌S6966-3菌株。
进一步地，所述降解剂含有S6966-3菌株的培养物、培养菌悬液或发酵液。
本发明提供一种降解含聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯的塑料制品的方法，采用上述降解剂进行处理。
本发明还提供一种改善海滨盐土中聚对苯二甲酸-己二酸丁二醇酯塑料污染的方法，在海滨盐土中使用S6966-3菌株或其菌液，或采用上述降解剂对土壤进行处理。
优选地，所述菌液浓度不低于1×108cfu/mL。
本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一株耐盐的PBAT降解菌及其应用，该降解菌为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）S6966-3菌株，S6966-3菌株可以利用PBAT地膜作为唯一碳源进行生长，作用于PBAT地膜上，能引发水解作用，导致分子链断裂，对PBAT地膜具有较好的降解效果；并且S6966-3菌株具有较好的耐盐性，在较高的盐浓度范围内仍然能够正常生长，同时在高盐浓度下也能够很好地降解PBAT，能用于高盐环境中降解PBAT的塑料污染，改善海滨盐土的土壤质量、塑料污染。本发明丰富了PBAT降解菌的菌种资源，对改善滨海盐土的土壤质量、降解塑料污染物具有重要的意义。
附图说明
图1是菌株S6966-3在改良的SM液体培养基中的生长曲线图。
图2是菌株S6966-3降解PBAT地膜的SEM对比图（A：CK；B：S6966-3处理）。
图3是菌株S6966-3降解PBAT地膜的傅里叶红外光谱对比图。
图4是菌株S6966-3在LB培养基上的菌落形态图。
图5是用MEGA 10.1构建的菌株S6966-3的系统进化树分析图。
图6是蜡样芽孢杆菌S6966-3在不同盐浓度下的生长曲线图。
图7是蜡样芽孢杆菌S6966-3在不同盐浓度下的PBAT降解效率柱状图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例中使用培养基如下：
改良的SM培养基（无碳源）：NH4NO31.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、K2HPO41.0 g/L、CaCl2·2H2O 0.1 g/L、KCl 0.15 g/L、FeSO4·6H2O 0.001 g/L、ZnSO4·7H2O 0.001 g/L、MnSO40.001 g/L，pH调至7.4 ± 0.2，121℃灭菌20 min；固体改良的SM培养基在其基础上添加琼脂粉15～20 g/L。
LB培养基：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1000 mL，pH 7.4~7.6；LB固体培养基在其基础上添加琼脂粉：18~20 g。
实施例1 PBAT降解菌的筛选和分离
从湛江市徐闻县南山镇南山村附近采集滨海盐土土壤样品，土壤盐度为0.6%。准确称取土样样品1.0 g，风干研磨分散均匀，以1:10质量比溶入无菌水中，过滤取滤液作为10-1初始液，依次获得10-2和10-3土壤梯度稀释液。分别在固体改良的SM培养基上进行稀释涂布并覆盖PBAT地膜（购买于山东省高密市恒润塑料有限公司），28℃培养5～7 d，直至有单个菌落长出，挑取单菌落在LB培养基上纯化，至最终获得单一菌株，命名为S6966-3。
将PBAT地膜统一剪成2.0 cm×2.0 cm大小的膜片，用3％ KCl溶液浸泡1 h，再用100％无水乙醇清洗3～4次，最后无菌水润洗，放入干燥无菌的培养皿中烘干后在紫外灯下照射灭菌4 h，放入改良的SM培养基（液体培养基）中，然后接种上述获得的单菌株S6966-3，每组3个重复，置于28℃震荡培养箱中培养，观察菌落长势，并反复筛选，选出具有PBAT地膜降解效果的菌株，菌株S6966-3的生长曲线图如图1所示。
PBAT地膜降解实验室模拟：在无菌操作台上，并将PBAT地膜统一剪成2.0 cm×2.0cm大小的膜片，称取其初始质量，记为M0。首先用3％ KCl溶液浸泡1h，再用100％无水乙醇清洗3～4次，之后用无菌水润洗，再放入干燥无菌的培养皿中烘干后在紫外灯下照射灭菌4h。
将纯化后的菌株S6966-3于28℃下LB液体培养18 h后，于12000 rpm转速下离心10min获得菌体，加等体积PBS液体重悬并离心2次后，将获得的菌体用PBS配制成1×108cfu/mL的S6966-3菌液。
将灭菌后的PBAT地膜和S6966-3菌液加入到100 mL改良的SM培养基（液体培养基）中，并设置只加入空白对照组（CK），分别在第10 d、20 d、30 d和40 d记录菌液的OD600nm，于第40 d取出PBAT膜片，烘干后称取PBAT地膜的剩余质量M1，采用失重法计算PBAT地膜降解效率ŋ，通过扫描电镜观察PBAT地膜降解情况，并利用傅里叶红外光谱测定PBAT地膜的化学官能团变化。
失重法计算公式如下：
降解效率ŋ=（M0−M1）/M0×100%
经扫描电镜观察，对比CK和S6966-3处理40 d的PBAT膜片SEM图，结果如图2所示，对照组CK，PBAT膜片表面较为平整，无裂（图2A），菌株S6966-3处理的PBAT膜片变得粗糙不平，出现明显的侵蚀孔洞和清晰的裂痕等微观形态（图2B）；PBAT地膜在500～4000 cm-1之间的傅里叶红外谱图如图3所示，在2956 cm-1、1723 cm-1和732 cm-1的振动峰有明显削弱和位置偏移，位于1723 cm-1一处的峰为羰基吸收峰（C=O），随着降解时间的延长，羰基吸收峰明显增强，可能是生物降解地膜中的酯键发生断裂由此形成大量羰基、CH键、C—O—C键减弱，说明在微生物菌株S6966-3的作用下引发水解作用，最后导致分子链断裂，PBAT地膜发生降解，并且通过失重法统计得到PBAT的降解效率为43.33%。
实施例2 菌株特性鉴定
1、菌株形态特性
通过平板划线法观察菌落形态，取活化的菌株进行革兰氏染色，通过光学显微镜观察菌体及芽孢形态。S6966-3的菌落形态如图4所示，菌落为灰白色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状，直径为4 mm～10 mm；经革兰氏染色鉴定，S6966-3菌株为革兰氏阳性芽胞杆菌。
2、菌株的生理生化特性
参照东秀珠等编写的《常见细菌系统鉴定手册》的方法，利用细菌微量生化鉴定管对菌株进行生理生化鉴定。结果显示S6966-3菌株在厌氧条件下能发酵葡萄糖菌株，不发酵甘露醇和木糖；与接触酶、水解酶和过氧化氢酶反应呈阳性，但VP试验呈阳性、甲基红试验呈阴性。
3、分子生物学鉴定
采用试剂盒法提取细菌总DNA，并采用细菌16S rDNA通用引物27F和1492R，进行PCR扩增细菌的16S rDNA，将PCR扩增产物回收后进行序列测定，测序结果显示菌株S6966-3的核苷酸序列SEQ ID NO：1所示，再将获得的DNA序列在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上进行Blast比对分析，并采用MEGA10.1软件构建系统发育树。
构建的系统发育树如图5所示，显示本发明分离鉴定的菌株S6966-3的16S rDNA序列和与GenBank中蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）具有较高的同源性。并综合上述菌株形态特性、生理生化特性、分子生物学鉴定的结果，将菌株S6966-3的分类学归属于芽孢杆菌属（Bacillus）中的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）菌种，命名为S6966-3菌株，并于2024年03月20日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：64439，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例3 盐浓度对菌株生长的影响
本实施例对蜡样芽孢杆菌S6966-3的生长特性进行研究，建立其生长曲线，具体方法为：将蜡样芽孢杆菌S6966-3单菌落接种到LB培养基中（10 mL）进行隔夜培养（28℃，150rpm，10-12 h）活化；并用移液枪准确吸取1 mL菌液进行10倍梯度稀释，稀释至10-1010倍；取稀释倍数为102、104、106与108的蜡样芽孢杆菌S6966-3菌液进行平板计数培养，取1 mL稀释菌液均匀涂布于平板；并在恒温箱中28℃隔夜培养，选取合适的平板计数。
按照上述方法，每隔2 h以10倍梯度稀释一次，平板计数法得到细菌数；6 h后，取稀释倍数为101、103、105、106、107、108、109与1010的菌液按平板计数法记录得到原液中的细菌数；之后每隔2 h稀释，隔夜培养，菌落计数一次，直至第24 h的细菌数。
设定一系列盐度梯度0%、2%、4%、6%、8%和10%的LB培养基，重复以上步骤，得到不同盐度梯度培养基，分别统计蜡样芽孢杆菌S6966-3在不同盐浓度下的生长曲线。
蜡样芽孢杆菌S6966-3在不同盐浓度下的生长曲线统计结果如图6所示，可以得出，蜡样芽孢杆菌S6966-3的迟缓期比较长，0 h~8 h内，所有设定的盐浓度下细菌数保持稳定，新增殖的细菌数与死亡的细菌数相等；8 h~12 h内，正常生长条件下蜡样芽孢杆菌S6966-3达到对数期，细菌数显著增加，表明蜡样芽孢杆菌S6966-3具有一定的耐盐机制，使蜡样芽孢杆菌S6966-3在一定盐浓度范围内仍然能够正常生长，在8%和10%盐浓度下细菌数先保持稳定然后开始减少；10 h~14 h内，盐浓度为0%、2%和4%条件下，细菌生长活跃，蜡样芽孢杆菌细菌数显著增加；在8 h~16 h内，盐浓度为6%的条件下，细菌缓慢增加。整体来看，8%和10%盐浓度下，蜡样芽孢杆菌S6966-3生长趋势一致，细菌数先保持稳定，后逐渐下降；盐浓度为0%、2%、4%和6%条件下，蜡样芽孢杆菌生长趋势大致相同，细菌数先保持稳定，后显著增加，再减少。
综上显示蜡样芽孢杆菌S6966-3具有一定的耐盐能力，在2~10%的盐浓度范围内仍然能够正常生长，其中在2%和4%盐浓度下，蜡样芽孢杆菌生长效果较好。
实施例4 盐浓度对蜡样芽孢杆菌S6966-3降解PBAT的影响
不同盐浓度下PBAT地膜降解实验室模拟：在无菌操作台上，并将PBAT地膜统一剪成2.0 cm×2.0 cm大小的膜片，称取其初始质量，记为M0。首先用3％ KCl溶液浸泡1 h，再用100％无水乙醇清洗3～4次，之后用无菌水润洗，再放入干燥无菌的培养皿中烘干后在紫外灯下照射灭菌4 h。将获得的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）S6966-3菌株于28℃下LB液体培养18 h后，于12000 rpm转速下离心10 min获得菌体，加等体积PBS液体重悬并离心2次后，将获得的菌体用PBS配制成1×108cfu/mL蜡样芽孢杆菌S6966-3菌液。将灭菌后的PBAT地膜和蜡样芽孢杆菌S6966-3菌液分别加入到0%、2%、4%、6%、8%和10%盐浓度的改良的SM培养基（液体培养基）中培养。于第40 d取出PBAT膜片，烘干后称取PBAT地膜的剩余质量M1，采用失重法计算PBAT地膜在不同盐浓度下的降解效率ŋ，计算方法同实施例1。
统计结果如图7所示，显示蜡样芽孢杆菌S6966-3在0%~4%盐浓度下对PBAT地膜的降解效果较好，其中2%盐浓度下降解效率最高。PBAT地膜的降解效率在6%~10%盐浓度中降解率逐渐降低，与2%盐浓度相比，6%、8%和10%盐浓度处理的PBAT地膜降解效率分别降低了47.01%、81.35%和93.39%。表明蜡样芽孢杆菌S6966-3在0%~4%盐浓度条件下，能够明显促进PBAT地膜的降解，能够应用于高盐土壤环境中PBAT地膜的降解，如应用到海滨盐土中，对改善滨海盐土的土壤质量、降解塑料污染物具有重要的意义。
综上，本发明公开了一株耐盐的PBAT降解菌及其应用，该降解菌为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）S6966-3菌株，属于PBAT高效降解菌，可以利用PBAT地膜作为唯一碳源进行生长，作用于PBAT地膜上，能引发水解作用，导致分子链断裂，对PBAT地膜具有较好的降解效果；并且S6966-3菌株具有较好的耐盐性，在较高的盐浓度范围内仍然能够正常生长，同时在高盐浓度下也能够很好地降解PBAT，能用于高盐环境中降解PBAT的塑料污染，改善海滨盐土的土壤质量、塑料污染。本发明丰富了PBAT降解菌的菌种资源，对改善滨海盐土的土壤质量、降解塑料污染物具有重要的意义。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1. 一株蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）S6966-3菌株，其特征在于，所述菌株已于2024年03月20日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：64439。
2.权利要求1所述S6966-3菌株或其菌液在生物降解聚对苯二甲酸－己二酸丁二醇酯或在降解含聚对苯二甲酸－己二酸丁二醇酯的塑料制品中的应用。
3.权利要求1所述S6966-3菌株或其菌液在聚对苯二甲酸－己二酸丁二醇酯塑料污染环境治理中的应用。
4.权利要求1所述S6966-3菌株或其菌液在改善海滨盐土的聚对苯二甲酸－己二酸丁二醇酯塑料污染中的应用。
5.权利要求1所述S6966-3菌株或其菌液在制备聚对苯二甲酸－己二酸丁二醇酯降解剂中的应用。
6.一种聚对苯二甲酸－己二酸丁二醇酯的降解剂，其特征在于，含权利要求1所述S6966-3菌株。
7.根据权利要求6所述降解剂，其特征在于，所述降解剂含有S6966-3菌株的培养菌悬液。
8.一种降解含聚对苯二甲酸－己二酸丁二醇酯的塑料制品的方法，其特征在于，采用权利要求6或7所述降解剂进行处理。
9.一种改善海滨盐土中聚对苯二甲酸－己二酸丁二醇酯塑料污染的方法，其特征在于，在海滨盐土中使用权利要求1所述S6966-3菌株或其菌液，或采用权利要求6或7所述降解剂对土壤进行处理。
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