CN116064322A - 一株同步降解地膜微塑料和吸附重金属的蜡状芽孢杆菌md1w及其应用 - Google Patents

一株同步降解地膜微塑料和吸附重金属的蜡状芽孢杆菌md1w及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株蜡状芽孢杆菌MD1W及其应用，所述菌株于2022年8月25日保藏在中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62744，所述菌株可同步降解地膜微塑料与吸附重金属，其环境适应性强，可应用于地膜微塑料‑重金属复合污染环境的治理和修复。

Description

一株同步降解地膜微塑料和吸附重金属的蜡状芽孢杆菌MD1W及其应用
技术领域
本发明涉及环境污染物生物处理领域，具体涉及一株同步降解地膜微塑料和吸附重金属的蜡状芽孢杆菌MD1W及其应用。
背景技术
农用地膜的使用极大地推动了农业的发展，地膜覆盖可以保持土壤水分和温度、提高化肥的利用率、减缓土壤侵蚀、降低病虫害等，在保障农产品安全的同时实现了增产增收。由于缺乏回收地膜的机械设备，导致大量的地膜残留在土壤中并逐渐积累，残留地膜不断磨损、破裂，形成粒径小于5mm的地膜微塑料，地膜微塑料还可以随地表径流、雨水冲刷等进入河流、湖泊和海洋中。地膜微塑料会堵塞土壤孔隙而影响水分和养分的迁移，阻碍植物根系的生长，导致农作物减产。进入水环境中的地膜微塑料会降低水体的能见度而抑制浮游植物的光合作用，地膜微塑料被水生生物摄取后会影响其代谢、生长和繁殖等过程。此外，随着工业化进程的加快，采矿活动、污水排放、农药和化肥的过度施用等导致大量的重金属进入到环境中，重金属难以被降解，具有隐蔽性、高毒性等特点。由于地膜微塑料具有较大的比表面积和强疏水性，容易与重金属发生相互作用，两者形成复合污染，不仅对生态环境产生不良影响，还可沿食物链进行传递而对人类健康造成严重威胁。因此，选择高效合理的修复技术成为目前亟需解决的问题。
物理和化学修复技术的成本高，对污染环境的修复效果较差，会破坏水体/土壤结构，造成水体和土壤生态系统功能紊乱。微生物修复技术的效果好、成本低、无二次污染，并能够维持生态系统的稳定，是去除环境中污染物的有效方法之一。微生物可以利用自身的代谢活动将复杂污染物分解为低毒或无毒的物质，塑料已被证实可以被微生物降解(细菌和真菌)：微生物首先在塑料表面附着形成生物膜，然后通过分泌胞外酶将塑料分解为低聚物、二聚体和单体，最终矿化为CO2和H2O。微生物细胞壁表面的基团和活性位点可以通过络合/配位作用与重金属形成化合键，从而实现对重金属离子的胞外吸附；吸附在细胞表面的重金属会通过离子转移系统进入到细胞内，与某些分子结合而积累。但目前的研究主要针对单一地膜微塑料或重金属的去除，已有的菌株只能降解地膜微塑料而不能吸附重金属，或者只能够吸附重金属但不能降解地膜微塑料，暂未见可以同时降解地膜微塑料和吸附重金属的高效菌种。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一株同步降解地膜微塑料和吸附重金属的蜡状芽孢杆菌MD1W及其应用。
本发明的目的采用以下技术方案来实现：
本发明提供一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)MD1W，保藏编号为GDMCC No：62744，于2022年8月25日保藏在中国广东省微生物菌种保藏中心。
所述蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)MD1W从广东省肇庆市长期覆盖地膜的农用地土壤中驯化、筛选、纯化获得，所述蜡状芽孢杆菌MD1W在平板上的形态参见图1，菌落较大，似融蜡状或毛玻璃状，表面粗糙，不透明，呈略有光泽的白色。
采用16S rDNA序列分析对菌株进行分类鉴定，委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成对菌MD1W的DNA提取，利用27F/1492R引物进行16S rDNA扩增测序，得到了长度为1455bp的序列。将得到的MD1W序列在核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp上进行同源性比对分析，与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的相似性达99.93％，将该菌种归于蜡状芽孢杆菌。
所述蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)MD1W的16S rDNA的核苷酸序列如Seq IDNo:1所示。
本申请的另一目的在于提供所述蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)MD1W在降解地膜微塑料和/或吸附转化重金属中的应用。
优选的，所述地膜微塑料为聚乙烯。
优选的，所述重金属为镉和/或铅。
本发明的有益效果为：
本发明分离筛选得到一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)MD1W，其能够吸附多种重金属同时降解地膜微塑料，其环境适应性强，在pH值4～10、温度20～40℃、盐度0.01％～8％范围内均能生长，可应用于地膜-重金属复合污染环境的治理和修复，应用对象包括采矿区水体/土壤、农田土壤、工业废水、海岸带及近海环境，能有效减轻地膜微塑料和重金属对生态环境和人类健康的危害。
附图说明
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1是蜡状芽孢杆菌MD1W在NB平板上的形态；
图2是蜡状芽孢杆菌MD1W在不同pH环境条件下的生长状况测定结果；
图3是蜡状芽孢杆菌MD1W在不同温度环境条件下的生长状况测定结果；
图4是蜡状芽孢杆菌MD1W在不同盐度环境条件下的生长状况测定结果；
图5是蜡状芽孢杆菌MD1W在地膜微塑料-重金属复合体系中对地膜微塑料的降解效果；
图6是在地膜微塑料-重金属复合体系中地膜微塑料降解前后的表面微观形态；
图7是蜡状芽孢杆菌MD1W在地膜微塑料-重金属复合体系中对重金属的吸附效果。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
实施例1
蜡状芽孢杆菌MD1W菌株的分离鉴定
1、培养基及溶液的配制
无机盐培养基(MSM)：5mL磷酸盐缓冲溶液(Na2HPO4·12H2O 33.4g/L，K2HPO4·3H2O21.75g/L，KH2PO4 8.5g/L，NH4Cl 5.0g/L)；3mL MgSO4溶液(22.5g/L)；1mL FeCl3溶液(0.25g/L)；1mL CaCl2溶液(36.4g/L)；1mL微量元素液(ZnSO4·H2O 42.8mg/L，MnSO4·H2O39.9mg/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 34.7mg/L)，定容至1L。
重金属储备液：分别称取一定量的Cd(NO3)2、Pb(NO3)2溶解于去离子水中，配制成浓度为500mg/L的镉(Cd2+)、铅(Pb2+)储备液。
营养肉汤琼脂固体培养基(NB)：18g营养肉汤，18g技术琼脂粉，蒸馏水1L。
2、菌株的驯化、筛选和分离纯化
将聚乙烯地膜剪成小块膜片(2×1.5cm)，利用粉碎机进行破碎，过10目筛，依次用2％SDS、75％乙醇和95％乙醇分别浸泡4个小时以上清洗地膜，在超净台上用无菌水冲洗3次，自然晾干，紫外灯照射灭菌15min，得到地膜微塑料；
称取10g长期覆盖地膜的农用地土壤，放入装有MSM培养基的三角瓶中，按1g/L的浓度加入所述地膜微塑料，30℃，140rpm振荡培养，培养60d。然后从中取10mL培养液转接至含有地膜微塑料(1g/L)、Cd2+(8mg/L)、Pb2+(5mg/L)的MSM培养基中，振荡培养60d，完成第1次驯化，重复该步骤，再进行驯化4次；
吸取最后一个驯化周期的培养菌液100μL，涂布在NB培养基上，将平板倒扣放置于30℃生化培养箱中，2～3d后，待菌落长好，在平板上挑取不同形态的菌落进行划线纯化，获得纯化的菌株，编号为MD1W；
采用16S rDNA序列分析对该菌株进行分类鉴定，将该菌种归于蜡状芽孢杆菌。
实施例2
蜡状芽孢杆菌MD1W的环境适应性
菌株MD1W对不同pH值、温度和盐度的适应性，将菌液接种到MSM培养基中(1g/L地膜微塑料，8mg/L Cd2+和5mg/L Pb2+)，初始OD600值为1.6；pH值分别设定为4、5、6、7、8、9和10，温度分别设定为20℃、25℃、30℃、35℃和40℃，以NaCl(w/v)设定盐度为0.01％、0.1％、0.5％、1％、2％、4％、6％、8％和10％，每个处理设置三个平行，140r/min，30℃振荡培养，60d后取样测量菌的OD600。
测定结果参见附图2-4，蜡状芽孢杆菌MD1W在酸性、中性和碱性的环境中(pH值4～10)均能生长，其中最适pH值为7，这说明菌MD1W具有较宽的酸碱适应范围；菌株MD1W在20℃～40℃范围内均可生长，最适温度为30℃，在40℃时生长状况良好，说明该菌对高温具有一定的耐受性；菌株MD1W还具有很强的耐盐能力，当NaCl范围为0.01％～8％时表现出良好的生长状态。这些实验结果表明蜡状芽孢杆菌MD1W对环境条件的变化具有较强的适应能力，能够适应酸性、中性和碱性环境，还具有较广的生长温度范围和强耐盐性。
实施例3
蜡状芽孢杆菌MD1W的降解吸附性能
将MD1W菌悬液转入到含有地膜微塑料(1g/L)、Cd2+(8mg/L)和Pb2+(5mg/L)的MSM培养基中，为处理组；设置不添加菌MD1W的对照组，每个处理设置三个平行。30℃，140r/min条件下振荡培养60d，离心，取定量上清液，经0.22μm滤头进行过滤，利用电感耦合等离子体发射光谱仪测定镉(Cd2+)和铅(Pb2+)的浓度，计算镉和铅的去除率；
将离心得到的地膜微塑料和菌体分离，依次用75％乙醇、95％乙醇和100％乙醇分别浸泡地膜微塑料4个小时以上，在超净台上用无菌水冲洗3次后自然晾干，称重，确定地膜微塑料的降解率，利用扫描电子显微镜观察地膜微塑料的微观特征。
地膜微塑料重量的减少是判定其被降解的指标之一，在地膜微塑料-镉-铅的复合污染体系中，MD1W对地膜微塑料的降解效果如图5所示，在添加菌株MD1W后，随着培养时间的延长，MD1W对地膜微塑料的降解率逐渐增加，在60d时地膜微塑料的去除率达到8.87％；扫描电镜观察地膜微塑料的表面形态结果如图6所示，原始地膜微塑料(a)表面光滑平整，在地膜微塑料-镉-铅的复合污染体系中经过60d的培养后，对照组(b)的地膜微塑料表面十分完整，仅仅出现了非常轻微的粗糙现象，处理组(c)的地膜微塑料出现明显的裂痕、褶皱和孔洞，呈现出一定程度的破损和脱落，这说明蜡状芽孢杆菌MD1W对地膜微塑料具有较好的降解能力。同时，MD1W对镉和铅也很好的吸附作用(见图7)，MD1W对镉和铅的的吸附率分别达到51.37％和98.28％。由此可见，MD1W在吸附重金属的同时还对地膜微塑料具有较好的降解效果。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)MD1W，其特征在于，保藏编号为GDMCC No：62744，于2022年8月25日保藏在中国广东省微生物菌种保藏中心。
2.根据权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)MD1W在降解地膜微塑料和/或吸附转化重金属中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述地膜微塑料为聚乙烯。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重金属为镉和/或铅。
5.包括权利要求1所述蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)MD1W的降解菌剂。
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