JP7335469B1

JP7335469B1 - Ｐｂａｔ農業用フィルム分解菌およびその用途

Info

Publication number: JP7335469B1
Application number: JP2022212805A
Authority: JP
Inventors: 塗晨; 劉穎; 駱永明
Original assignee: 中国科学院南京土壌研究所
Priority date: 2022-09-06
Filing date: 2022-12-29
Publication date: 2023-08-30
Anticipated expiration: 2042-12-29
Also published as: JP2024037121A; CN116555066A; CN116555066B

Abstract

【課題】ＰＢＡＴ（ポリアジピン酸／ブチルテレフタレート）農業用フィルム分解菌株、およびそのＰＢＡＴ生分解への用途を提供する。【解決手段】ＰＢＡＴ農業用フィルム分解菌株であって、前記菌株はＰｕｓｉｌｌｉｍｏｎａｓｓｐ．ＰＢＡＴ-８であり、中国典型培養物保管センターに保管され、保管番号がＣＣＴＣＣＭ２０２２１３７８である、ことを特徴とするＰＢＡＴ農業用フィルム分解菌株を提供する。前記菌株は、土壌または水域環境中のＰＢＡＴプラスチックの分解用途として使用される。【選択図】なし

Description

CCTCC

CCTCC M20221378

本発明は、微生物学の技術分野に関し、具体的に、ＰＢＡＴ(ポリアジピン酸／ブチルテ
レフタレート)農業用フィルム分解菌およびそのＰＢＡＴ生分解への用途に関する。

農業用フィルムは、温度や保湿性を高め、作物の収量アップを促す効果があるため、農業
生産に広く利用されている。ポリエチレン（ＰＥ）に代表される従来の農業用フィルムは
、リサイクル率が低く、環境中での劣化サイクルが長いという問題を抱えている。廃プラ
スチック製品は土壌に蓄積され、ほとんど分解されないまま、深刻な生態系の脅威となり
続けている。ポリアジピン酸／ブチルテレフタレート（Ｐｏｌｙａｄｉｐａｔｅ／ｂｕｔ
ｙｌｅｎｅｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ、ＰＢＡＴ）は、アジピン酸ブチレングリコー
ルとブチレンテレフタレートを共重合した生分解性プラスチックであり、従来のプラスチ
ックの優れた延性、熱可塑性および生分解性などの特徴を兼ねる。近年、ＰＢＡＴを主原
料として製造された生分解性プラスチックが幅広く普及および使用されている。しかし、
関連研究によると、ＰＢＡＴの分解には特定の環境条件が必要な場合が多く、実際に使用
するときの分解効率が高くない。土壌の残留農業用フィルムは、光、機械的攪乱、土壌動
植物および微生物などの複合作用下でより分解しやすく、さらにはマイクロプラスチック
に分解され、土壌の物理化学的性質や作物の成長に影響を与えるため、農業土壌の生態系
の安全性と健全性を脅かし、そのような材料の普及および利用を制限する。したがって、
ＰＢＡＴマルチングフィルムプラスチックおよび二次マイクロプラスチックのグリーンマ
ネジメント技術の研究および開発を強化することが急務となっている。

微生物でＰＢＡＴ農業用フィルムを分解することにより農地での農業用フィルムの残留時
間を効果的に短縮することができる。現在、ＰＢＡＴなどのプラスチック廃棄物の生物処
理に関する研究方法はほとんど行わておらず、有効な菌株資源も少なく、処理効率が低い
ため、そのさらなる応用には限界がある。現在、ＰＢＡＴの微生分解研究には、効率的な
分解菌株資源が不足で、分解効率が低く、分解メカニズムが不明確であるという問題が残
っている。

本発明の目的は、ＰＢＡＴ(ポリアジピン酸／ブチルテレフタレート)農業用フィルム分解
菌株およびそのＰＢＡＴ生分解への用途を提供することである。
本発明の上記目的を達成するために、以下の技術的解決策を採用している。
ＰＢＡＴ農業用フィルム分解菌株は、農業用フィルム分解菌株Ｐｕｓｉｌｌｉｍｏｎａｓ
ｓｐ．ＰＢＡＴ-８であり、前記ＰＢＡＴ分解菌株は中国典型培養物保管センターに
保管され、住所：湖北省武漢市武昌区八一路２９９号、保管番号がＣＣＴＣＣＭ２０
２２１３７８であり、保管日が２０２２年９月５日である。
上記ＰＢＡＴ農業用フィルム分解菌株の分離選別方法は以下のとおりであり、
分離するサンプルを連続濃縮培養し、ＰＢＡＴのみを炭素源とする培地に接種して濃縮お
よび選別し、複数回の区切り、精製および再選別により、ＰＢＡＴ農業用フィルムに対す
る分解効果の高い微生物資源を選択し、ＰＢＡＴを炭素源とすることができる効率的な分
解菌ＰＢＡＴ-８を取得する。
本発明の一側面として、本発明は、上記菌株の用途をさらに提供し、前記菌株はＰＢＡＴ
プラスチックの生分解用途に使用される。
さらに、前記菌株は土壌または水域環境中のＰＢＡＴプラスチックの分解用途に使用され
る。
またさらに、前記ＰＢＡＴプラスチックはＰＢＡＴ含有プラスチック製品である。
好ましくは、前記ＰＢＡＴプラスチックはＰＢＡＴ農業用フィルム、ＰＢＡＴ材料含有の
包装バッグまたはＰＢＡＴ材料含有の包装用フィルムである。
本発明の別の側面として、本発明は、プラスチック分解製剤をさらに提供し、前記製剤は
上記菌株を含有する。
さらに、前記製剤はこの菌株を含有する培養物、培養細菌懸濁液または発酵液である。
またさらに、前記製剤は、前記菌株ＰＢＡＴ-８をＯＤ_６００値０．６～１．０に培養し
たものである。

従来技術と比較すると、本発明は以下の有益な効果を有する。
第１に、本発明によるＰＢＡＴ農業用フィルム分解菌株資源は、ＰＢＡＴ農業用フィルム
の生分解に非常に有効であり、分解効率が高い。
第２に、本発明による菌株は、ＰＢＡＴ農業用フィルムを生分解することができ、分解後
のＰＢＡＴフィルムの表面に多数の亀裂や穴が生じ、フィルムの疎水性が著しく低下する
などの特徴が観察される。
第３に、本発明による菌株およびこの菌株によるＰＢＡＴ農業用フィルム分解方法は、グ
リーンで環境に優しく、操作が簡単で、コストが低く、この菌株はＰＢＡＴに対する良好
な分解性を有し、環境中に残留するＰＢＡＴプラスチックの生物修復に新しい資源とアイ
ディアを提供し、幅広い応用見通しを持っている。

本発明により提供されるＰＢＡＴ分解菌Ｐｕｓｉｌｌｉｍｏｎａｓｓｐ．ＰＢＡＴ-８のコロニーの形態特徴を示す図である。本発明により提供される走査型電子顕微鏡下での菌株ＰＢＡＴ-８の顕微鏡形態を示す図である。本発明により提供される菌株ＰＢＡＴ-８の系統樹である。本発明により提供される６ヶ月分解した後のＰＢＡＴフィルムの走査型電子顕微鏡下で（ａ対照、ｂ接種）の形態特徴を示す図である。本発明により提供される分解前後のＰＢＡＴフィルムの水接触角の変化効果を示す図である。

本発明の具体的な実施形態または従来技術の技術的解決策をより明確に説明するために、
以下、具体的な実施形態または従来技術の説明において使用される必要のある図面を簡単
に説明するが、明らかに、以下で説明される図面は本発明のいくつかの実施形態に過ぎず
、当業者であれば、創造的な労働をすることなく、これらの図面に基づいて他の図面を得
ることができる。
本発明により提供されるＰＢＡＴ高効率分解菌Ｐｕｓｉｌｌｉｍｏｎａｓｓｐ．ＰＢ
ＡＴ-８は、中国典型培養物保管センターに保管され、住所：湖北省武漢市武昌区八一路
２９９号、保管番号がＣＣＴＣＣＭ２０２２１３７８であり、保管日が２０２２年９
月５日である。
この菌株は環境中ＰＢＡＴプラスチックに良好な分解効果を有し、特に農業土壌中のＰＢ
ＡＴ農業用フィルムに良好な分解効果を有する。本発明により提供される菌株は、ＰＢＡ
Ｔ農業用フィルムを生分解し、分解後のＰＢＡＴフィルムの表面が荒れ、多数の亀裂や穴
が生じ、フィルムの疎水性が著しく低下するなどの特徴がある。この方法はグリーンで環
境に優しく、操作が簡単で、コストが低く、環境中の残留ＰＢＡＴプラスチックの生物修
復に新しい資源およびアイディアを提供し、幅広い応用見通しを持っている。
本発明は、上記保管番号のＰＢＡＴ-８菌株だけでなく、適度な範囲で変異しても強いＰ
ＢＡＴ分解能力を有する菌株も保護しようとする。
実際に使用するとき、菌株を培養して発酵液（特に微生物製剤）としてその応用範囲を拡
張する。
本発明の組成物（好ましくは、発酵剤培養物として使用する場合）は純粋な培養物または
混合培養物であり得る。したがって、本発明では、純粋な培養物は、全部または実質的に
全部が本発明のＰＢＡＴ分解菌からなるような培養物として限定される。代替形態におい
て、混合培養物は、複数種類の微生物、具体的に、本発明のＰＢＡＴ分解菌株を含む複数
種類の微生物菌株からなるような培養物として限定される。

実施例１：ＰＢＡＴ分解菌の分離選別および同定
（１）ＰＢＡＴ分解菌の分離と選別
本発明で得られたＰＢＡＴ高効率分解菌は、農業用フィルムを長年使用する農業土壌およ
び農業用フィルムの表面から分離して選別したものであり、具体的なステップは以下のと
おりであり、
Ｓ１、山東省東営市の長年使用の農業用フィルムの農業土壌と残留マルチングフィルムを
採取し、１０ｇの土壌と残留農業用フィルムサンプルを秤量し、減菌済のコニカルフラス
コに入れ、生理食塩水とガラスビーズを加え、恒温振動インキュベーターに２８℃、１８
０ｒ／分で２時間培養して、土壌懸濁液を調製する。
Ｓ２、土壌懸濁液を２％接種量（ｖ／ｖ）でカーボンフリー鉱物塩培地（ＭＳＭ）に接種
し、７５％エタノールで減菌したＰＢＡＴ農業用フィルム破片（１ｇ／Ｌ）を加え、３０
℃、１８０ｒ／分、遮光条件下で振動培養する。
Ｓ３、定期的にサンプリングして培養系のＯＤ_６００値を測定し、培養系が濁った時点で
２％の接種量（ｖ／ｖ）で上記と同じ新しいカーボンフリー鉱物塩培地（ＭＳＭ）に繰り
返して接種し、連続的に濃縮および培養する。
Ｓ４、３回濃縮培養した後培養液を勾配希釈し、異なる希釈度（１×１０^-３、１×１０^-
^４、１×１０^-５、１×１０^-６、１×１０^-７）の細菌懸濁液を調製し、希釈コーティン
グプレート法により菌株を分離し、菌液を固体ＭＳＭ培地にコーティングし、固体ＭＳＭ
培地に減菌ＰＢＡＴフィルムを被せ、急速に増殖したコロニーを選択し、区切って分離、
精製して潜在的なＰＢＡＴ分解菌株を取得し保管する。
Ｓ５、得られた菌株をＭＳＭ培地に接種し、減菌ＰＢＡＴ膜を加えて分解実験を行い、菌
株の増殖状況とＰＢＡＴ膜の分解動態および分解率を観察および記録する。
使用する分離選別用培地はカーボンフリー鉱物塩培地（ＭＳＭ）であり、その成分は以下
のとおりであり、Ｋ_２ＨＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏ０．７ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４０．７ｇ、ＮＨ_４
ＮＯ_３１．０ｇ、ＮａＣｌ０．５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ＦｅＳＯ_４
・７Ｈ_２Ｏ０．００２ｇ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．００２ｇ、ＭｎＳＯ４・Ｈ_２Ｏ
０．００１ｇである。上記試薬を１Ｌの蒸留水に溶解し、１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨでｐ
Ｈを７．０に調節する。前記固体ＭＳＭ培地を調製するとき上記成分に１．５％の寒天を
加える。ＭＳＭＡ培地に減菌ＰＢＡＴ膜を添加して唯一の炭素源として使用する。
上記の分離と選別により、急速に増殖しＰＢＡＴマルチングフィルムに対する分解速度が
速い菌株を得、ＰＢＡＴ-８と命名した。
（２）ＰＢＡＴ分解菌株の生理的特徴および分子生物学的同定
プレート上のコロニーの形態特徴を観察したところ、ＰＢＡＴ-８コロニーの直径が約１
～２ｍｍであり、コロニーが円形で、エッジが整然とし、表面がしっとり滑らかで半透明
のクリームイエローである（図１参照）。
ＬＢ培地で対数増殖した細菌を収集し、遠心分離して２．５％のグルタルアルデヒドで４
時間固定し、０．１ｍｏｌ／ＬのＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、３０％、５０％、７０％、
９０％および１００％濃度のエタノールで順に勾配脱水し、ＴＥＲＴ－ブタノールで置換
処理した後冷凍乾燥する。適量の細菌をカーボンゲル上に固定し、表面に金を散布した後
走査型電子顕微鏡で菌株の顕微鏡形態特徴を観察する。走査型電子顕微鏡で観察したとこ
り、菌株ＰＢＡＴ-８は１～２μｍの棒状で、鞭毛などの構造物は見つからなかった（図
２参照）。
対数増殖した少量のコロニーを選択してグラム染色を行ったところ、光学顕微鏡下で、染
色後の菌株が赤色を示し、グラム陰性菌である。
キットを用いて菌株のＤＮＡを抽出し、バクテリアユニバーサルプライマーを用いて菌株
ＰＢＡＴ-８のＰＣＲ増幅を行った。
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅プライマーシーケンスは以下のとおりであり、
２７Ｆ：５'- ＡＧＡｇＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＣＡＧ- ３'、
１４９２Ｒ：５'-ｇＧＴＴＡＣＣＴＴｇＴＴＡＣＧＡＣＴＴ- ３'。
ＰＣＲ増幅系（５０ μＬ）：テンプレートＤＮＡ５ μＬ、Ｍｉｘ(２×) ２５ μ
Ｌ、プライマー２７Ｆ２ μＬ、プライマー１４９２Ｒ２ μＬ、ｄｄＨ_２Ｏ１６
μＬ、この１６ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅プライマーシーケンスは従来の１６Ｓユニバー
サルプライマーである。
増幅手順：９５℃で５分間予備変性し、９５℃で１分間変性し、５８℃で１分間アニーリ
ングし、７２℃で２分間延長し、３０回循環し、最後に７２℃で１０分間延長し、４℃で
保管する。
増幅生成物の電気泳動検出を行い、上海生工生物技術有限公司に配列決定を依頼した。
得られたシーケンスとＮＣＢＩデータベース中のシーケンスとＢＬＡＳＴで分析し、相同
性が近い菌株を選択し、ＭＥＧＡ６．０ソフトウエアを用いてＮｅｉｇｈｂｏｒＪｏｉ
ｎｉｎｇ法で系統樹を構築した。
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子シーケンスの比較結果から分かるように、菌株ＰＢＡＴ-８とＰ
ｕｓｉｌｌｉｍｏｎａｓｓｐ．ＴＳ３５は同じ枝に属し、進化的距離も比較的近く（
図３参照）、系統樹スパン値は１００で、シーケンス同一性比較が９９．９３％であるた
め、菌株ＰＢＡＴ-８とＰｕｓｉｌｌｉｍｏｎａｓｓｐ．ＴＳ３５とはおそらく同属
であると考える。したがって、菌株ＰＢＡＴ-８をマイクロモノスポラＰｕｓｉｌｌｉｍ
ｏｎａｓｓｐ．ＰＢＡＴ-８と命名した。この菌株は中国典型培養物保管センターに
保管されている。

実施例２：菌株によるＰＢＡＴ膜の分解実験
ＰＢＡＴ分解菌の農業土壌中のＰＢＡＴ農業用フィルムに対する分解効果を評価するため
に、農地で一般的に使用されているＰＢＡＴマルチングフィルムを選択して分解実験を行
い、使用したＰＢＡＴマルチングフィルムは新疆西部節水有限公司から購入した。
菌株によるＰＢＡＴフィルムの分解実験は以下のステップに従って行われる。
細菌懸濁液の調製：少量（接種ループで１リング摘んだ）のＰＢＡＴ-８コロニーまたは
ＰＢＡＴ-８グリセロールサンプルをＬＢ培地に接種して振動培養し、対数増殖まで培養
し、０．０１ｍｏｌ／ＬのＰＢＳ緩衝溶液で表面に残った培地を洗浄し、ＭＳＭ培地で再
懸濁し、ＯＤ_６００値を１．０に調節した。
ＰＢＡＴ農業用フィルムの表面を洗浄した後５×５ｃｍの大きさにカットし、秤量した後
７５％のエタノールで減菌した。コニカルフラスコに１００ｍＬの減菌ＭＳＭ培地を加え
、３枚の減菌ＰＢＡＴフィルムを加え、１０％（ｖ／ｖ）の接種量で上記ＰＢＡＴ-８菌
を含有する細菌懸濁液を接種した。同時に、接種しない対照処理も設定し、毎処理につい
て３つの並行試料を設定した。コニカルフラスコを恒温振動インキュベーターに３０℃、
１８０ｒ／分で振動培養し、定期的にサンプリングして分解前後のＰＢＡＴの表面特性変
化を測定した。
ＰＢＡＴ膜の表面の顕微鏡形態変化は以下のように処理され：培養した後、接種処理組と
対照組のＰＢＡＴ膜を採取し、減菌水で表面の余分な培地を洗浄し、２．５％のグルタル
アルデヒドで４時間固定し、３０％、５０％、７０％、９０％、１００％のエタノールで
順に各回１５分間勾配脱水し、ＴＥＲＴ‐ブタノールで置換した。処理後のサンプルを乾
燥し、固定し金を散布した後走査型電子顕微鏡下で観察した。
ＰＢＡＴマルチングフィルムの質量変化は以下のように処理され：分解後のＰＢＡＴ膜を
２％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液で振動し（１８０ｒ／分）４時
間洗浄し、蒸留水でリンスし、オーブンで一定の重量まで低温乾燥し、分解後のＰＢＡＴ
マルチングフィルムの質量を測定し、以下の式に従ってＰＢＡＴマルチングフィルムの分
解率を算出する。
ＰＢＡＴ分解率（％）=（初期質量－分解後質量）／初期質量×１００％
ＰＢＡＴ膜表面の官能基の変化はフーリエ赤外分光法（ＦＴＩＲ）により測定され、全反
射（ＡＴＲ）モードを選択し、洗浄した膜を自然乾燥した後測定した。走査波長範囲が６
５０～４０００ｃｍ^-１、分解能４ｃｍ^-１、走査回数が３２回であった。
水接触角計で分解前後のＰＢＡＴ膜の疎水性変化を表現した。分解後のＰＢＡＴサンプル
を蒸留水で洗浄して１５分間超音波処理した後、室温で風乾させた。風乾後のサンプルを
広げ、スライド表面に固定し、サンプルテーブルに置き、接触角計の水滴体積を２μＬと
し、接触角計で写真を撮り、ＳＣＡ２０（Ｖｅｒｓｉｏｎ２）ソフトウエアを用いて静水
滴とＰＢＡＴ表面の接触角をフィッティングし分析した。３つの各処理を並行して行った
。
走査型電子顕微鏡の結果から分かるように、ＰＢＡＴ-８分解菌を接種したＰＢＡＴ農業
用フィルムの表面が荒れ、生分解穴が目立ち、亀裂や剥がれが生じた（図４参照）。分解
時間の増加に従って、ＰＢＡＴ膜の表面にある穴、亀裂が激しくなった。対照組と比較す
ると、ＰＢＡＴ-８分解菌を接種した処理では、４０日後にＰＢＡＴ膜の分解率が６．６
１％となった。ＦＴＩＲの結果から分かるように、分解時間の増加に従って、ＰＢＡＴの
各官能基のピーク値が培養時間の増加とともに低下する。カルボニル（Ｃ=Ｏ）官能基の
減少は、分解菌を接種した後ＰＢＡＴエステル結合が酵素作用下で加水分解し、主鎖が切
断され、アルコールなどの低分子やオリゴマーの生成を伴うため、ＰＢＡＴが分解された
ことからである。疎水性の変化もプラスチック分解の重要な指標となる。水接触角変化の
結果から分かるように、ＰＢＡＴ-８分解菌を接種して１ヶ月分解した後、ＰＢＡＴ膜の
表面疎水性が対照組に比べて著しく低下する（図５参照）。分解時間の増加に従って、Ｐ
ＢＡＴ膜の疎水性が徐々に低下する傾向がある。
最後に、以上の各実施例は本発明の技術的解決策を説明するものに過ぎず、発明を制限す
るものではないことに留意されたい。

Claims

ＰＢＡＴ農業用フィルム分解菌株であって、前記菌株は極小単胞菌（Ｐｕｓｉｌｌｉｍｏ
ｎａｓｓｐ．ＰＢＡＴ-８）であり、中国典型培養物保管センターに保管され、保管
番号がＣＣＴＣＣＭ２０２２１３７８である、ことを特徴とするＰＢＡＴ農業用フィ
ルム分解菌株。
前記菌株はＰＢＡＴプラスチックの生分解用途として使用される、ことを特徴とする請求
項１に記載の菌株の用途。
前記菌株は土壌または水域環境中のＰＢＡＴプラスチックの分解用途として使用される、
ことを特徴とする請求項２に記載の用途。
前記ＰＢＡＴプラスチックはＰＢＡＴ含有プラスチック製品である、ことを特徴とする請
求項３に記載の用途。
前記ＰＢＡＴ含有プラスチック製品は、ＰＢＡＴ農業用フィルム、ＰＢＡＴ材料含有の包
装バッグまたはＰＢＡＴ材料含有の包装用フィルムである、ことを特徴とする請求項４に
記載の用途。
請求項１に記載の菌株を含有することを特徴とするプラスチック分解製剤。
前記製剤は前記菌株を含有する培養物、培養細菌懸濁液または発酵液である、ことを特徴
とする請求項６に記載のプラスチック分解製剤。
前記製剤は、前記菌株ＰＢＡＴ-８をＯＤ_６００値０．６～１．０に培養したものである
、ことを特徴とする請求項７に記載のプラスチック分解製剤。