CN110295131A - 一株高效降解聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯的寡养单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株高效降解聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯的寡养单胞菌及其应用。本发明从陕西省礼泉县烟霞镇土壤中分离筛选出一株可分泌脂肪酶的PBAT降解菌，寡养单胞菌，并将其命名为Stenotrophomonas sp.strain YCJ1，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC 18059。本发明的优势在于此菌可分泌脂肪酶并高效降解PBAT，且此菌在偏碱性条件下，降解效果更优异，该寡养单胞菌及其脂肪酶能够用作酶制剂、生物菌剂和生物强化剂应用于偏碱性的环境中PBAT及PBAT基可生物降解材料的环境修复，具有良好的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于PBAT降解技术领域，具体涉及一株高效降解PBAT的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.strain YCJ1)。
背景技术
聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯(PBAT)是一种脂肪族类的可生物降解材料，由于兼具传统塑料良好的机械性、热塑性及使用性能，同时PBAT可被环境当中的微生物及其脂肪酶所降解，具有良好的可生物降解性，使得PBAT在农业、食品及包装等行业广泛使用。但目前研究发现，PBAT的降解程度主要与环境中的pH、温度及湿度等理化性质密切相关，体现在西北地区PBAT的降解率远远低于西南地区，再者西北地区环境中微生物种类及数量较少，这使得PBAT的应用受到了严重的限制。因此迫切需要一种环境耐受的PBAT高效降解菌，解决PBAT在不同地区降解率低的问题。
目前，PBAT降解菌的研究甚少，国内外报道的PBAT降解菌主要有鞘脂单胞菌(Sphingopyxis ginsengisoli)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、假单胞菌属产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)及真菌棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，但普遍存在降解率低的问题，而且在偏碱性的环境中菌株对PBAT的降解普遍较慢。
研究者发现微生物的降解方式主要是两种，一方面是微生物分泌脂肪酶，可以攻击PBAT中的酯键，使高分子断裂成小分子链；另一方面微生物通过新陈代谢利用PBAT及PBAT降解产物如对苯二甲酸、己二酸及丁二醇，最终形成二氧化碳和水，因此使得同时具备偏碱性的环境中高效降解PBAT且可分泌降解PBAT的脂肪酶的菌株成为研究热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效降解PBAT的寡养单胞菌及其应用，能够在偏碱性条件下高效降解PBAT同时此菌可分泌降解PBAT的脂肪酶。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一株高效降解聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯的寡养单胞菌，所述寡养单胞菌的保藏编号为CGMCC 18059。
优选的，所述寡养单胞菌分离自陕西礼泉县烟霞镇铺设PBAT土壤。
优选的，所述寡养单胞菌具有在pH为7.2～8.2的偏碱性环境中降解PBAT的作用。
进一步的，所述寡养单胞菌在5天内pH为7.2～8.2的偏碱性环境中对PBAT的降解率高于10％。
优选的，所述寡养单胞菌具有分泌降解PBAT的脂肪酶的作用。
进一步的，所述寡养单胞菌在5天内pH为7.2～8.2的偏碱性环境中分泌的降解PBAT的脂肪酶的酶活高于5U/mL。
所述的高效降解聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯的寡养单胞菌作为生物菌剂在降解PBAT中的应用。
所述的高效降解聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯的寡养单胞菌作为生物强化剂在降解PBAT中的应用。
所述的高效降解聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯的寡养单胞菌在制备用于降解PBAT的脂肪酶中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明从陕西礼泉县烟霞镇铺设PBAT土壤中筛选分离得到一株高效降解PBAT的寡养单胞菌，实验结果证明，此菌株在偏碱性土壤中具有优异的降解效果，同时可分泌降解PBAT的脂肪酶，本发明提供的寡养单胞菌及其分泌的脂肪酶拓宽了对PBAT高效降解菌的认知，弥补了在偏碱性环境中不具备高效降解效果的不足；此菌在自然界分布广泛，适应能力强。
本发明还提供了此菌株在偏碱性环境中高效降解PBAT及PBAT基可生物降解材料的应用研究，为PBAT在环境中的生物修复提供技术保障，并有效解决PBAT在恶劣环境难降解的问题，为PBAT的大面积使用提供技术支持。
附图说明
图1为此寡养单胞菌在以PBAT为唯一碳源无机盐培养基上的菌落形态。
图2为此寡养单胞菌的16S rRNA基因的系统发育树。
图3为此寡养单胞菌在不同pH条件下对PBAT的降解率及产酶测试。
图4为此寡养单胞菌降解PBAT前后，PBAT的电镜照片。
图5为此寡养单胞菌降解PBAT前后，PBAT的X射线衍射图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明从陕西礼泉县烟霞镇铺设PBAT土壤中筛选并分离得到一株高效降解PBAT的寡养单胞菌，并分类命名为Stenotrophomonas sp.strain YCJ1。
本发明将寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.strain YCJ1进行了保藏：
保藏日期：2019年7月1日，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号CGMCC 18059。
所述的高效降解PBAT的寡养单胞菌可以作为生物菌剂或生物强化剂应用于偏碱性的环境中，用于PBAT及PBAT基可生物降解材料的环境修复。
所述的高效降解PBAT的寡养单胞菌分泌的脂肪酶作为脂肪酶制剂应用于偏碱性的环境中，用于PBAT及PBAT基可生物降解材料的环境修复。
实施例中所涉及的培养基其配方如下：
以PBAT为唯一碳源无机盐培养基：PBAT(分子量为10万)的乳化液，10g；KH2PO4，1g；Na2HPO4，1.5g；NH4Cl，2g；CaCl2·2H2O，0.1g；KCl，0.15g；MgSO4·7H2O，0.2g；FeSO4·7H2O，0.01g；ZnSO4·7H2O，0.01g；MnSO4·H2O，0.001g；琼脂，20g；蒸馏水，1000mL；pH为7.2～7.4。
LB培养基：胰蛋白胨，10g；酵母提取物，5g；NaCl，10g；蒸馏水1000mL；pH为7.2～7.4。
油脂培养基：牛肉膏，5g；蛋白胨，10g；NaCl，5g；花生油，10ml；0.6％中性红溶液，1mL；蒸馏水，1000mL；pH为7.2～7.4。
实施例1菌株的分离与鉴定
1.平板分离筛选PBAT降解菌
采集陕西礼泉县烟霞镇某铺设PBAT地膜的农田土壤，称取10g土壤于90mL无菌水的150mL的三角瓶中，配置10-1～10-6系列浓度梯度的土壤菌悬液，接种于以PBAT为唯一碳源无机盐培养基中，在37℃的恒温培养箱中培养3天后，观察培养基上微生物的生长状况，并挑取单一菌落，连续多次接种于以PBAT为唯一碳源无机盐培养基中进行分离纯化，直至分离获得一株细菌，然后观察其菌落形态，如图1所示，菌落呈橘红色，边缘平整，表面光滑。
2.菌株的鉴定
将菌株在LB培养基上，于37℃、转速为130r/min条件的摇床上培养3天，采用水煮法提取菌株的DNA，并用细菌通用引物27F和1492R，对菌株DNA进行扩增，将扩增产物经测序(上海生工)后，得到了长度为1439bp的16S rRNA基因序列，见SEQ ID No:1。将测试结果上传至GENBANK中获得登录号为MK989996，并与GENBANK中已报道的菌株进行同源性比对，并选取相关菌株进行系统发育树分析，如图2，可见此菌株与Stenotrophomonas pavaniiRamos(登录号:LDJN01000038)在同一个分支上，同源性最高为99％。因此本发明筛选获得的降解菌为寡养单胞菌。
因此，发明人将此寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.strain YCJ1)保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC 18059。
实施例2菌株产脂肪酶能力鉴定
将此寡养单胞菌接种于油脂培养基上，37℃培养3天，观察菌落下有明显的红色水解圈，可见此菌可产生脂肪酶。
实施例3菌株对PBAT膜的降解实验及其产脂肪酶实验。
1.PBAT膜的制备
选取5g分子量为10万的PBAT膜，将其溶解于95mL的分析纯的氯仿中，充分搅拌待其溶解后，将其倒入模具，待氯仿挥发，制备得到PBAT膜，并将其剪成1*1cm2的小块，用于菌株降解PBAT膜实验。
2.培养基的准备
在以PBAT为唯一碳源无机盐培养基基础上，加入3％的丁二醇等外加碳源作为此菌的共代谢生长基质。
3.种子液的制备
将纯化后的菌株接种于100mL的LB培养基中，在37℃、摇床速度为130r/min的条件下，培养12h，得到OD600为1.0的菌液作为种子液。
4.菌株对PBAT膜的降解实验及其产脂肪酶测试
将此菌株接种于外加3％丁二醇的100mL无机盐培养基中，调节pH至6.0、6.4、6.8、7.2、7.8及8.2，再加入PBAT膜3～5块(每块PBAT质量约为0.0150g)，并接种1mL此菌的种子液，于37℃、摇床速度为130r/min的条件下，培养5天，采用称重法测定计算PBAT膜的质量损失率(％)，及对硝基苯酚法检测上清液中的脂肪酶含量(U/mL)。
图3可见，培养基的pH为7.2、7.8、8.2时，该寡养单胞菌对PBAT的降解率分别为11.03％、12.14％、11.88％，可见，在pH为7.2～8.2时，此菌对PBAT的降解效果良好，优于目前报道的菌株对PBAT的降解能力；同时此菌可以分泌降解PBAT的脂肪酶，且其含量变化趋势与降解率一致，在pH为7.2～8.2环境中，分泌脂肪酶均大于5U/mL，产酶效果良好。结果表明，此寡养单胞菌能够在偏碱性环境中对PBAT的降解率良好并可分泌降解PBAT的脂肪酶，所以此菌及其酶作为酶制剂、生物菌剂及生物强化剂可应用于偏碱性的环境中PBAT及PBAT基可生物降解材料的环境修复中，具有良好的使用价值。
实施例4降解PBAT前后的形貌观察
通过环境扫描电镜对降解前后的PBAT膜进行形貌观察。先将PBAT膜表面用无菌水清洗干净，放置真空干燥箱置于60℃恒温干燥24h后，在PBAT膜表面喷金后，在电压为3～10kV；放大倍数为5000倍，观察此菌降解PBAT膜前后，对膜表面的降解情况。
图4中，可见PBAT在降解前，表面平整且光滑，在此寡养单胞菌降解后，PBAT膜表面变得粗糙，出现明显的孔洞，且孔洞周围聚集了很多降解后的碎片，可见此菌对PBAT膜的降解效果明显。
实施例5降解PBAT前后的X射线衍射分析
通过傅里叶变换红外光谱仪测定了PBAT薄膜降解前后的红外谱图。先将PBAT膜表面用无菌水清洗干净，放置真空干燥箱置于60℃恒温干燥24h后。X射衍射测试条件为：测试电压：40KV，测试电流：40mA，使用滤波Cu Kα辐射扫描步长：0.02°，扫描速率：2°/min，扫描范围：10～65°。
图5可见，2θ角度为18°、20°和23°时，出现的峰为PBAT的特征结晶峰，在PBAT降解后，这些峰的峰强增加且峰形更加尖锐明显，这是由于PBAT在降解过程中非结晶部分被此寡养单胞菌所降解，使得PBAT的结晶度的增加所致，这与电镜图所示的结果一致，说明此菌对PBAT膜具有明显的降解效果。
上述实施例为本发明最佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 陕西科技大学
<120> 一株高效降解聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯的寡养单胞菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1439
<212> DNA
<213> 寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp. strain YCJ1)
<400> 1
tgggggaggc tacacatgca gtcgacggca gcacaggaga gcttgctctc tgggtggcga 60
gtggcggacg ggtgaggaat acatcggaat ctactctgtc gtgggggata acgtagggaa 120
acttacgcta ataccgcata cgacctacgg gtgaaagcag gggatcttcg gaccttgcgc 180
gattgaatga gccgatgtcg gattagctag ttggcggggt aaaggcccac caaggcgacg 240
atccgtagct ggtctgagag gatgatcagc cacactggaa ctgagacacg gtccagactc 300
ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga caatgggcgc aagcctgatc cagccatacc 360
gcgtgggtga agaaggcctt cgggttgtaa agcccttttg ttgggaaaga aatccagctg 420
gctaataccc ggttgggatg acggtaccca aagaataagc accggctaac ttcgtgccag 480
cagccgcggt aatacgaagg gtgcaagcgt tactcggaat tactgggcgt aaagcgtgcg 540
taggtggtcg tttaagtccg ttgtgaaagc cctgggctca acctgggaac tgcagtggat 600
actgggcgac tagagtgtgg tagagggtag cggaattcct ggtgtagcag tgaaatgcgt 660
agagatcagg aggaacatcc atggcgaagg cagctacctg gacccaacac tgacactgag 720
gcaagaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cctaaacgat 780
gcgaactgga tgttgggtgc aatttggcac gcagtatcga agctaacgcg ttaagttcgc 840
cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900
cggtggagga tgtggtttaa tccgatgcaa cgcgaagaac cttacctggc cttgacatgg 960
ccacaacttt ccagagatgg atgggtgcct tcgggaactc gaacacaggt gctgcatggc 1020
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgtc 1080
cttagttgcc agcacgtaat ggtgggaact ctaaggagac cgccggtgac aaaccggagg 1140
aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatggc ccttacggcc agggctacac acgtactaca 1200
atggtaggga cagagggctg caagccggcg acggtaagcc aatcccagaa accctatctc 1260
agtccggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcagat 1320
cagcattgct gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg 1380
agtttgtgca ccagaagcag gtagcttaac cttcgggagg gcgctgccac ggtgtgccc 1439
Claims (9)
1.一株高效降解聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯的寡养单胞菌，其特征在于，所述寡养单胞菌于2019年7月1日保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 18059。
2.根据权利要求1所述的高效降解聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯的寡养单胞菌，其特征在于，所述寡养单胞菌分离自陕西礼泉县烟霞镇铺设PBAT土壤。
3.根据权利要求1所述的高效降解聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯的寡养单胞菌，其特征在于，所述寡养单胞菌具有在pH为7.2～8.2的偏碱性环境中降解PBAT的作用。
4.根据权利要求3所述的高效降解聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯的寡养单胞菌，其特征在于，所述寡养单胞菌在5天内pH为7.2～8.2的偏碱性环境中对PBAT的降解率高于10％。
5.根据权利要求1所述的高效降解聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯的寡养单胞菌，其特征在于，所述寡养单胞菌具有分泌降解PBAT的脂肪酶的作用。
6.根据权利要求5所述的高效降解聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯的寡养单胞菌，其特征在于，所述寡养单胞菌在5天内pH为7.2～8.2的偏碱性环境中分泌的降解PBAT的脂肪酶的酶活高于5 U/mL。
7.权利要求1-6任一项所述的高效降解聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯的寡养单胞菌作为生物菌剂在降解PBAT中的应用。
8.权利要求1-6任一项所述的高效降解聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯的寡养单胞菌作为生物强化剂在降解PBAT中的应用。
9.权利要求1-6任一项所述的高效降解聚对苯二甲酸/己二酸丁二酯的寡养单胞菌在制备用于降解PBAT的脂肪酶中的应用。
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