CN112501084B - 一株根际益生菌克雷伯氏菌属zh07及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了提供一株根际益生菌克雷伯氏菌属ZH07，所述菌属系从连作十年的花生土壤中分离出的能够降解花生自毒物质的微生物。本发明提供的所述克雷伯氏菌属ZH07对花生自毒酚酸类物质包括苯甲酸、对羟基苯甲酸、水杨酸、肉桂酸、香豆酸和香草酸具有降解作用，对六种自毒物质的降解率均超过50％；采用包含所述克雷伯氏菌属ZH07菌液培养后，花生干重增加约32％，地上部分苗高增加约32％，地下部分根长增加约6％，可见克雷伯氏菌属ZH07对花生有明显的促生作用，能促进花生植株生长。

Description

一株根际益生菌克雷伯氏菌属ZH07及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一株根际益生菌克雷伯氏菌属ZH07及其应用。

背景技术

作为我国四大油料作物之一，花生是一种重要的经济作物，中国一直是世界上最大的花生生产、消费和出口国，近年来，伴随农业种植结构的调整，花生种植呈规模化、集约化，连作面积越来越大，连作障碍已成为花生产量低且不稳定的重要因素之一。花生连作时植株瘦弱、矮小，生育不良，荚果变小，品质下降、总生物量和荚果产量均显著降低，当前，花生连作障碍问题严重威胁我国花生种植及相关产业的可持续发展，已经引起农业部门和学术界的高度重视，而针对这种现象，目前除了轮作还未找到其他行之有效的方法。

对于花生来说，连作条件下，根系分泌物在土壤中不断积累，花生根系分泌物中一些成份会对花生生长起到抑制甚至毒害作用，这种物质被称为花生的自毒物质，影响作物自身防卫反应的基因表达及其正常生理代谢活动。已有研究中，花生根系分泌的主要自毒物质有六种，分别是：苯甲酸、对羟基苯甲酸、水杨酸、肉桂酸、香豆酸和香草酸六类酚酸，酚酸能够引发自毒作用，影响种子萌发、植株生长，使花生大量减产。此外，花生腐烂病也是一种严重影响花生植株生长的因素，植株可由霉菌、镰孢菌等感染产生茎部、根部等位置不同程度的腐烂症状。

在连作土壤中，接种一些有益菌微生物种群和致病菌弱毒菌株可以改变根际生态环境，在根际形成生物屏障以促进幼苗免疫机能的产生，使用含有有益微生物种群的生物有机肥抑制土壤致病菌的发展，这些利用有益微生物的方法可以降解土壤中存在的相克物质或缓解自毒作用的发生，是农业生防菌的良好选择。

发明内容

本发明的目的是提供一株适宜于盐碱地特殊条件，特别是可以很好控制经济作物花生的连作障碍发生的根际益生菌株及其用途。该菌株属于克雷伯氏菌属，保藏名称克雷伯氏菌ZH07(Klebsiella sp ZH07)，可降解花生根系分泌的自毒物质从而缓解连作障碍。

作为本发明的第一个方面，在于提供一株根际益生菌克雷伯氏菌属ZH07，所述菌属系从山东省青岛市连作十年的花生土壤中分离出的能够降解花生自毒物质的微生物根际益生菌克雷伯氏菌属ZH07，该菌属已于2020年11月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNO.21261。

本发明提供的根际益生菌经鉴定为克雷伯氏菌属，其特点在于：菌体革兰氏染色阴性，较短粗的杆状，无芽孢，无鞭毛，在LB平板表面生长的菌落呈近圆形，边缘整齐，表面有光泽，不透明，乳白色，粘性。

作为本发明的第二个方面，在于提供所述根际益生菌克雷伯氏菌属ZH07降解花生自毒酚酸类物质的应用。

优选的，所述花生自毒酚酸类物质包括苯甲酸、对羟基苯甲酸、水杨酸、肉桂酸、香豆酸和香草酸；在实施例中，验证了加入克雷伯氏菌属ZH07后培养基中的自毒物质含量明显降低。

作为本发明的第三个方面，在于提供了所述根际益生菌克雷伯氏菌属ZH07 促进花生植株生长的应用；在实施例中，验证了克雷伯氏菌属ZH07对花生生长具有明显的促进能力。

作为本发明的第四个方面，在于提供了克雷伯氏菌属ZH07的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、富集：获取盐碱地连作十年花生的土壤，将花生土壤按照1g/100mL 的质量体积比直接接种于含有自毒物质的无机盐培养基中，30℃摇床160r/min，得到土壤悬液；所述自毒物质选自苯甲酸、对羟基苯甲酸、水杨酸、肉桂酸、香草酸和香豆酸，所述自毒物质的浓度均为1g/L；从而富集以所述自毒物质分别作为唯一碳源时的微生物；

步骤二、选择培养：将步骤一制得的土壤悬液在摇床中培养10天，在超净工作台中取菌悬液1mL于1.5mL的离心管中，并将其稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、 10^-5、10^-6六个浓度梯度，并用移液枪各取50μL菌悬液，接至无机盐培养基上，用涂布器均匀涂布后将平板于37℃的培养箱中倒置培养；

步骤三、纯化：采用平板划线法：用接种环从无机盐培养基上挑取单菌落并在LB培养基上画线，培养2～3d，待菌落长成后，取出观察菌的培养特征；采用LB培养基配方如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract) 5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L，并加入2.5％的琼脂制成固体培养基；

步骤四、驯化：按相同方法配无机盐培养基，将筛选得到的菌株再接回至无机盐培养基上，逐步将碳源的浓度提高至5g/L，部分能适应或者产生变异的微生物留下来，成为优势菌群。

优选的，所述无机盐培养基组成包括(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，Na₂HPO₄ 1.3g/L，碳源1g/L，NaCl 5g/L，余量为水，pH 6.8-7.2。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明提供了一种根际益生菌克雷伯氏菌属ZH07，其具有对包括苯甲酸、对羟基苯甲酸、水杨酸、肉桂酸、香豆酸和香草酸在内的花生自毒酚酸类物质的降解作用，对六种自毒物质的降解率均超过50％；

2.本发明提供的克雷伯氏菌属ZH07菌液培养后，花生干重增加约32％，地上部分苗高增加约32％，地下部分根长增加约6％，可见克雷伯氏菌属ZH07对花生有明显的促生作用。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明提供的克雷伯氏菌属ZH07在LB培养基上的生长特征；

图2为本发明提供的克雷伯氏菌属ZH07对花生生长促进状态对比图；

图3为本发明提供的克雷伯氏菌属ZH07的系统发育树。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例1：降解花生自毒物质微生物的分离及鉴定

降解花生自毒物质微生物的分离主要包括富集、选择培养、纯化和驯化四个部分。

(1)富集

获取盐碱地连作十年花生的土壤，将1g花生土壤直接接种于100ml含有lg/L 苯甲酸的无机盐培养基中，30℃摇床160r/min。这样可以使能够降解苯甲酸的菌株得到富集，便于后续的选择培养和纯化工作。同理可以富集以对羟基苯甲酸、水杨酸、肉桂酸、香草酸和香豆酸作为唯一碳源时的微生物。实验采用无机盐培养基，组成包括(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄2g/L，Na₂HPO₄ 1.3g/L，碳源1g/L，NaCl 5g/L，余量为水，pH 6.8-7.2。

(2)选择培养

土壤悬液在摇床中培养10天，在超净工作台中取菌悬液1mL于1.5mL的离心管中，并将其稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6六个浓度梯度，并用移液枪各取50μL菌悬液，接至无机盐培养基上，用涂布器均匀涂布后将平板于37℃的培养箱中倒置培养。

(3)纯化

因菌株在无机盐培养基上的生长情况不好，难以观察其形态不同，故将挑取的单菌落接在LB培养基上培养并纯化。LB培养基的配方如下：胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L酵母提取物(Yeast extract)5g/L氯化钠(NaCl)10g/L，并加入2.5％的琼脂制成固体培养基。采用平板划线法：用接种环从无机盐培养基上挑取单菌落并在 LB培养基上画线，培养2～3d，待菌落长成后，取出观察菌的培养特征包括菌落的颜色、表面光滑程度(光滑、粗糙、皱纹、同心环、辐射状)等、基质是否产生水溶性色素、大小、形状、边缘(光滑、锯齿状、波浪状、纤维状等)、隆起 (凸、凹、平)、荧光的有无、透明度及培养基的颜色、粘度等。若培养特征完全一致，可以认为是同一种菌，如无单菌落则需多次划线反复纯化。

如图1所示，所得菌落特点为：菌体革兰氏染色阴性，较短粗的杆状，无芽孢，无鞭毛，在LB平板表面生长的菌落呈近圆形，边缘整齐，表面有光泽，不透明，乳白色，粘性。

(4)驯化

为获得高效降解菌株，在分离纯化之后进行驯化操作，按相同方法配无机盐培养基，将筛选得到的菌株再接回至无机盐培养基上，将碳源的浓度提高至5 g/L，部分能适应或者产生变异的微生物留下来，成为优势菌群。

(5)鉴定

采取提基因组DNA的方式进行PCR扩增。DNA提取采用上海生工细菌基因组DNA提取试剂盒。

扩增引物为：

27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；

1429R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。

16Sr PCR扩增体系(50μL)

16Sr PCR扩增程序

扩增结束后电泳验证扩增产物的DNA检测PCR产物片段的长度和亮度，验证合格的送至测序公司测序。测序获得的ZH07的16S rRNA序列片段大小为1397bp，如序列表SEQNo.1所示，在NCBI网站上进行序列同源性比对分析，并用MEGA 7.0软件进行多序列同源性分析，并构建系统发育树，如图3所示。

通过形态、生理生化特征和16S rRNA序列分析，菌株ZH07被鉴定为克雷伯氏菌属(Klebsiella sp)。

该菌株已于2020年11月30日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.21261。

实施例2：花生自毒物质降解率测定

降解率测定分别以六种自毒物质为唯一碳源，将-80℃冰箱中的菌种吸取10 μL加入5mL体积的LB液体培养基中活化，37℃摇床培养12h，完成活化。用LB 培养基调节OD₆₀₀至0.5，取1mL OD₆₀₀为0.5的菌液加入到49mL无机盐培养液中 (对照加入1mL无菌水)，培养液中以对应的自毒物质为唯一碳源，浓度为5g/L， 37℃摇床培养。以LB液体培养基为对照，每隔12h取1mL培养液测定OD₆₀₀值作为降解菌增殖的相对数量。另取少量菌液加入到无菌离心管中，8000r/min离心8 min，采用紫外可见分光光度法，取上清液测定对应自毒物质的最大吸收峰波长的吸光度值，重复3次，计算降解率。各物质的最大吸收波长(nm)分别为香豆酸268、香草酸250、水杨酸298、肉桂酸269、对羟基苯甲酸246、苯甲酸230。对不同自毒物质降解率的测定结果表1所示：

表1六种自毒物质降解率实验结果

	香草酸	香豆酸	对羟基苯甲酸	苯甲酸	水杨酸	肉桂酸
							对照吸光度	2.323	2.423	2.437	2.458	2.336	2.292
处理后样品吸光度	1.081	0.995	0.895	1.042	0.791	1.111
							降解率	53.47％	58.93％	63.27％	57.61％	66.14％	51.53％

注：降解率公式为，

降解率＝(对照吸光度-处理后样品吸光度)/对照吸光度×100％。

由表1可见，加入克雷伯氏菌属ZH07后培养基中的自毒物质含量明显降低，对六种自毒物质的降解率均超过50％。

实施例3：根际益生菌对花生生长的促生测定

利用温室盆栽实验验证克雷伯氏菌属ZH07对花生生长的促进能力。

营养液配比如下(1L)：柠檬酸铁0.075g，Ca(NO3)₂ 0.03g，KCL 0.075g， MgSO₄·7H₂O 0.06g，K₂HPO₄ 0.136g，CaSO₄ 0.46g，微量元素1mL。

微量元素配比如下(1L)：H₃BO₃ 2.86g，MnSO₄ 1.81g，CuSO₄·5H₂O 0.8g， ZnSO₄0.22g，H₂MoO₄ 0.02g。

用0.1％的次氯酸钠溶液消毒花生种子10分钟，然后用无菌水冲洗种子三次。洗净的种子用无菌水浸泡10h使之充分吸水。在灭菌完成的蛭石中拌入营养液到达湿润状态，然后分装至塑料杯中，每杯约100g，蛭石中间放入一颗花生种子，将活化好的各菌株菌液统一调节OD₆₀₀值为0.5，每杯加入300μL体积的OD₆₀₀值为0.5的菌液，对照则不加入菌液，每组重复三次。培养30天后小心从蛭石中取出完整的花生植株，将花生植株上残留的蛭石冲洗干净，擦干后分别测量植株的根长、苗高和鲜重，用滤纸包好做好记号放入烘箱中一同烘干。24h后取出烘干后的花生植株测定干重。结果如表2所示，花生植株生长的对比图如图2所示。

表2克雷伯氏菌属ZH07促生实验结果

	鲜重/g	干重/g	苗高/cm	根长/cm
					对照	5.355	0.695	15.138	12.851
ZH07	8.787	0.923	20.051	13.667
					增加率％	64.09	32.81％	32.45％	6.35％

由表2可知，花生生长30天后测定，花生鲜重增加64.09％，干重增加32.81％，地上部分苗高增加32.45％，地下部分根长增加6.35％。室内盆栽试验测定菌株对植物生长作用影响表明，克雷伯氏菌属ZH07对花生有明显的促进生长作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学，山东蓬勃生物科技有限公司

<120> 一株根际益生菌克雷伯氏菌属ZH07及其应用

<130> 20201217

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1397

<212> DNA

<213> 克雷伯氏菌菌属ZH07

<400> 1

agtcgagcgg tagcacagag agcttgctct cgggtgacga gcggcggacg ggtgagtaat 60

gtctgggaaa ctgcctgatg gagggggata actactggaa acggtagcta ataccgcata 120

acgtcgcaag accaaagtgg gggaccttcg ggcctcatgc catcagatgt gcccagatgg 180

gattagctgg taggtggggt aacggctcac ctaggcgacg atccctagct ggtctgagag 240

gatgaccagc cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg cagcagtggg 300

gaatattgca caatgggcgc aagcctgatg cagccatgcc gcgtgtgtga agaaggcctt 360

cgggttgtaa agcactttca gcggggagga aggcgntnag gttaataacc tnnncgattg 420

acgttacccg cagaagaagc accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg 480

gtgcaagcgt taatcggaat tactgggcgt aaagcgcacg caggcggtct gtcaagtcgg 540

atgtgaaatc cccgggctca acctgggaac tgcattcgaa actggcaggc tagagtcttg 600

tagagggggg tagaattcca ggtgtagcgg tgaaatgcgt agagatctgg aggaataccg 660

gtggcgaagg cggccccctg gacaaagact gacgctcagg tgcgaaagcg tggggagcaa 720

acaggattag ataccctggt agtccacgct gtaaacgatg tcgatttgga ggttgtgccc 780

ttgaggcgtg gcttccggag ctaacgcgtt aaatcgaccg cctggggagt acggccgcaa 840

ggttaaaact caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 900

cgatgcaacg cgaagaacct tacctggtct tgacatccac agaacttagc agagatgntt 960

tggtgccttc gggaactgtg agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgttgtgaa 1020

atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcct ttgttgccag cggttaggcc 1080

gggaactcaa aggagactgc cagtgataaa ctggaggaag gtggggatga cgtcaagtca 1140

tcatggccct tacgaccagg gctacacacg tgctacaatg gcatatacaa agagaagcga 1200

cctcgcgaga gcaagcggac ctcataaagt atgtcgtagt ccggattgga gtctgcaact 1260

cgactccatg aagtcggaat cgctagtaat cgtagatcag aatgctacgg tgaatacgtt 1320

cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg ggttgcaaaa gaagtaggta 1380

gcttaacctt cgggagg 1397

Claims (5)

1.一株根际益生菌克雷伯氏菌属(Klebsiella sp. )ZH07，其特征在于，于2020年11月28日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.21261。

2.权利要求1所述的一株根际益生菌克雷伯氏菌属ZH07的应用，其特征在于，降解花生自毒酚酸类物质。

3.根据权利要求2所述的一株根际益生菌克雷伯氏菌属ZH07的应用，其特征在于，所述花生自毒酚酸类物质包括苯甲酸、对羟基苯甲酸、水杨酸、肉桂酸、香豆酸和香草酸。

4.权利要求1所述的一株根际益生菌克雷伯氏菌属ZH07的应用，其特征在于，促进花生植株生长。

5.根据权利要求4所述的一株根际益生菌克雷伯氏菌属ZH07的应用，其特征在于，所述花生植株生长包括植株的根长、苗高和鲜重的增加。

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