CN111100815B - 一株降解pbat塑料的假单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降解PBAT塑料的假单胞菌及其应用，属于环境微生物技术领域。本发明公开的斯氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri strain)，其菌株号为PBAT‑1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年8月5日，保藏编号为CCTCC No.M2019602。本发明提供的菌株对PBAT塑料能够有效的侵蚀和降解。本发明提供的菌剂，生产成本低，能够在14天内降解纯PBAT塑料55.70％、淀粉‑PBAT基塑料46.70％以及木质素‑PBAT基塑料76.88％。本发明能够为解决当前PBAT(聚己二酸/对苯二甲酸丁二酯)基塑料废物对环境的污染和大量占用填埋场填埋容量的问题提供技术和方法，对于保护环境和降低垃圾的处理成本具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及降解PBAT塑料的假单胞菌及其应用。
背景技术
随着人类社会的不断发展，人口的增加及技术的不断进步，塑料已经应用在了人类生活和生产的各个方面。如今“白色污染”问题愈加严重，PBAT作为良好的生物降解材料，兼具PBA与PBT的特性，具有热稳定性好及力学性能优良的特点，在生物降解材料领域的研究中较为活跃，同时也受到市场的欢迎。我国PBAT材料产业化发展速度快，行业内企业集中度高。目前全球PBAT市场需求旺盛，随着欧洲市场的需求量的逐步增加，未来几年国内PBAT材料的产能有望逐步提升。然而，由于PBAT在自然环境中降解缓慢，严重制约了PBAT可降解塑料的市场化和规模化。
目前，焚烧和填埋是最常用的处理方法。焚烧过程中会产生大量二氧化硫、氮氧化物、二噁英等有害气体，给环境带来二次污染；而填埋处理将会占用大量土地。据报道，未经前处理过的PBAT在土壤中填埋140天才能实现降解，且仍有部分残留在土壤中，造成了一定的影响。
为了解决由于废旧塑料引起的环境污染问题，世界各国研究人员都在努力探寻一种有效处理塑料的方法。如对PBAT塑料进行改性，即向传统塑料中加入一些促进降解的添加剂(如过渡金属络合物等光敏剂)。但是这种方法成本高，不耐用，PBAT的原有性质得不到保证。或者采用物理或化学方法处理PBAT，如对其进行减容、切碎、直接热裂解、催化裂解、超临界流体技术等，处理后使PBAT降解成低分子产物，产物可作为化工原料重新利用。但是这种方法成本高，耗能巨大，降解效果不稳定。
目前PBAT塑料地膜对土壤温度、水分等环境的影响，以及作物生长的影响报道较多，而PBAT塑料地膜的降解菌株相关专利报道较少，特别是PBAT塑料地膜降解不完全性和降解速率缓慢严重制约着PBAT塑料地膜的发展。中国科学院天津工业生物技术研究所黄智勇等发明了一种高效降解PBAT的微生物菌群可在13天对PBAT塑料地膜降解率达99％，但微生物菌群培养条件苛刻，不利于产业化生产；另外新疆农业科学院微生物应用研究所霍向东等分离获得了一株降解PBAT塑料的细菌，经过60d培养，降解率达0.92％，降解效率过低。
因此，目前对于PBAT废旧塑料的处理方法还有待进一步改进。
发明内容
发明目的：本发明要解决的技术问题是提供可以降解PBAT塑料的菌株，以解决现有技术中生物降解率低的问题。
本发明还要解决的技术问题是提供上述降解PBAT塑料的菌株在生物降解PBAT中的应用。
一株斯氏假单胞菌，其分类命名为斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeristrain)，菌株号为PBAT-1，已保藏于保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路武汉大学)，保藏日期为2019年8月5日，保藏编号为CCTCCNo.M2019602。
一种降解塑料的菌剂，包括上述斯氏假单胞菌。
上述斯氏假单胞菌在降解PBAT塑料中的应用在本发明的保护范围之内。
上述降解塑料的菌剂在降解PBAT塑料中的应用在本发明的保护范围之内。
其中，所述的PBAT基塑料包括PBAT、淀粉-PBAT、木质素-PBAT。
上述斯氏假单胞菌PBAT-1，分离自南京高新工大生物技术研究院院内土壤，在筛选平板上表现为淡黄色边缘不规则、湿润有褶皱，革兰氏染色呈阴性；通过16S rDNA和Biolog微生物分类鉴定系统鉴定，确定为斯氏假单胞菌，命名为斯氏假单胞菌PBAT-1，16SrDNA序列分析结果和Biolog分类鉴定系统鉴定结果分别见序列表1和表1。
将上述斯氏假单胞菌剂制备成菌剂的方法如下：斜面种-摇瓶种-种子罐-生产罐-产品(包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂)。
具体可采用如下步骤：
(1)将菌株PBAT-1(原种)在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。
(2)将试管种接种于2000ml摇瓶(含400mlLB培养基)中，恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。
(3)配制发酵培养基(葡萄糖1％；酵母粉0.5％；蛋白胨1％；NaCl1％；pH值7.2～7.5)，将30升发酵培养基加入50升种子罐，121℃高压湿热灭菌，冷却至33℃后，将摇瓶菌种按4％(体积百分比)的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为200转/分，无菌空气通入量为1:0.6(体积比)。
(4)生产罐(生产量为0.3吨)所采用培养基成分与发酵培养基相同(投料量0.3吨)，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至室温。通无菌空气后，将对数期的种子液按10％(体积百分比)的接种量加入生产罐，接种后生产罐的温度控制在30～37℃，生产罐培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6，搅拌速度为180转/分，整个工艺流程培养时间为24～35小时；发酵结束后菌体数量达到109个/ml以上。
(5)发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型。
有益效果：本发明公开了一种PBAT降解菌株和菌剂，能够在14天内降解纯PBAT塑料55.70％、淀粉-PBAT塑料46.70％以及木质素-PBAT塑料76.88％，这为利用生物降解PBAT塑料废物提供了一种可行的技术手段。将该菌株和/菌剂应用到垃圾填埋场，能够有效降解垃圾中的PBAT废物，提高垃圾填埋场的填埋容量，能创造显著的经济和环境保护效益。
附图说明
图1PBAT基塑料薄膜在降解菌斯氏假单胞菌降解下形态变化情况；(a)纯PBAT塑料薄膜降解情况(b)淀粉-PBAT塑料薄膜降解情况(c)木质素-PBAT塑料薄膜降解情况。
图2斯氏假单胞菌在LB液体培养基中降解PBAT基塑料薄膜的生长情况；(a)纯PBAT塑料薄膜降解过程的OD600(b)淀粉-PBAT塑料薄膜降解过程的OD600(c)木质素-PBAT塑料薄膜降解过程的OD600。
图3斯氏假单胞菌在LB液体培养基中降解PBAT基塑料薄膜的降解率情况；(a)纯PBAT塑料薄膜的降解率(b)淀粉-PBAT塑料薄膜的降解率(c)木质素-PBAT塑料薄膜的降解率。
具体实施例
下面通过具体的实施例，对本发明进行说明，需要说明的是这些实施例仅仅是为了说明目的，而不能以任何方式解释成对本发明的限制。另外，在下列实施例中如果没有特别说明，则所采用的设备和材料均为市售可得的。
实施例1
一、斯氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri strain)PBAT-1的筛选与分离培养。
去南京高新工大土壤样品1g，再使用0.85％生理盐水稀释5倍，制成土壤菌悬液。将制备好的土壤菌悬液1ml加入锥形瓶中，再量取19ml灭菌液体LB培养基加入锥形瓶，制成20ml液体培养土壤菌液。液体无机盐培养基配方为：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl10.0g，水1000ml。将已消毒的PBAT膜(2×2cm2)加入到菌液中，在37℃条件下以200rpm的速度培养，培养时间14天。培养完毕后用移液器器吸取0.1ml进行平板涂布，挑取长出的单菌落进行划线分离，经过5次划线分离后得到斯氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri strain)PBAT-1单菌，对其进行保藏。
二、斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri strain)的鉴定。
形态观察：LB培养基培养的菌体用革兰氏染色法进行显微观察，可见菌株PBAT-1为革兰氏阴性杆菌。在LB固体平板上表现为淡黄色边缘不规则、湿润有褶皱的菌落。
BIOLOG微生物鉴定系统的鉴定：用Biolog微生物鉴定系统进行。活化的菌株接种IF-A培养基，接种量5％，33℃，静置培养33h，将菌液加入仪器的GENⅢ微孔板生化鉴定板，利用仪器的ML3读取鉴定板中各孔的颜色反应特征值，通过分析程序与数据库(Microlog-M，MicroStation，
)中细菌的生理生化数据进行匹配，根据PBAT-1菌株与数据库菌株之间匹配的概率、相似性和位距对PBAT-1菌株进行鉴定。最终将PBAT-1鉴定为菌株斯氏假单胞菌种Pseudomonas stutzeri strain，其中，概率(Prob)为0.516，相似性(Sim)为0.516，距离(Dist)为7.247，结果可靠。
基于16S rDNA序列的分子鉴定：通过划线的方式活化菌株接种于LB固体培养基，37℃，培养过夜，获得单菌落，以单菌落为基因组DNA模板，进行菌落PCR，采用通用引物27F/1492R，PCR扩增菌株的16S rDNA序列。50μL的反应体系含PCR缓冲液5μL，正、反向引物各1umol/L，Mg2+2.5mmol/L，dNTP 0.02mmol/L，Taq DNA聚合酶1.25U。反应条件为：95℃变性5min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物提交金唯智测序。将测序得到的16S rDNA序列用NCBI的BLAST2.0进行同源分析(Nucleotide-Nucleotide Blast)，搜索Genbank核酸数据库，根据比对结果对菌株进行分子鉴定。发现其与编号为ATCC17588斯氏假单胞菌的16S rDNA保守区域的同源性达到99％以上，因此将其鉴定为斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri strain)。
综上，最终将该菌株鉴定为斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri strain)。所得16S rDNA序列分析结果如序列表中所示，Biolog分类鉴定系统鉴定结果见表1。
表1本发明菌株Pseudomonas stutzeri strain PBAT-1的Biolog鉴定结果
注：“？”表示边界值，“+”表示阳性，“-”表示阴性。
实施例2
假单胞菌PBAT-1在液体LB培养基中降解塑料：
将实施例1筛选得到的假单胞菌PBAT-1，置于装有LB培养基10mL的50mL锥形瓶中，摇床转速200rpm，温度37℃过夜培养(16h)为种子液。向500ml锥形瓶中加入该种子液10ml和液体无机盐培养基100ml，50mg PBAT、淀粉-PBAT、木质素-PBAT膜用剪刀剪成小片状(约2.0cm×2.0cm)，分别加入锥形瓶中，在37℃摇床200rpm的转速旋转培养。在第7天，14天，21天，30天分别设置3个平行。到相应时间点取出PBAT基塑料纱布过滤清洗后称重并测定菌液OD600值。各时间点的OD600值结果如图2所示，在1～14天的培养中OD600呈现不断增长的趋势。各时间点的PBAT塑料称重质量如图3所示，由图3可知在培养过程中PBAT称重质量不断下降。菌液OD600值和PBAT失重表明假单胞菌PBAT-1能够完成对PBAT的降解。
序列表
<110> 南京高新工大生物技术研究院有限公司
<120> 一株降解PBAT塑料的假单胞菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1377
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
tcgagcggat gagtggagct tgctccatga ttcagcggcg gacgggtgag taatgcctag 60
gaatctgcct ggtagtgggg gacaacgttt cgaaaggaac gctaataccg catacgtcct 120
acgggagaaa gtgggggatc ttcggacctc acgctatcag atgagcctag gtcggattag 180
ctagttggtg aggtaaaggc tcaccaaggc gacgatccgt aactggtctg agaggatgat 240
cagtcacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat 300
tggacaatgg gcgaaagcct gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg tcttcggatt 360
gtaaagcact ttaagttggg aggaagggca gtaagttaat accttgctgt tttgacgtta 420
ccaacagaat aagcaccggc taacttcgtg ccagcagccg cggtaatacg aagggtgcaa 480
gcgttaatcg gaattactgg gcgtaaagcg cgcgtaggtg gttcgttaag ttggatgtga 540
aagccccggg ctcaacctgg gaactgcatc caaaactggc gagctagagt atggcagagg 600
gtggtggaat ttcctgtgta gcggtgaaat gcgtagatat aggaaggaac accagtggcg 660
aaggcgacca cctgggctaa tactgacact gaggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga 720
ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcgact agccgttggg atccttgaga 780
tcttagtggc gcagctaacg cattaagtcg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa 840
aactcaaatg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900
aacgcgaaga accttaccag gccttgacat gcagagaact ttccagagat ggattggtgc 960
cttcgggaac tctgacacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1020
ggttaagtcc cgtaacgagc gcaacccttg tccttagtta ccagcacgtt aaggtgggca 1080
ctctaaggag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg 1140
gcccttacgg cctgggctac acacgtgcta caatggtcgg tacaaagggt tgccaagccg 1200
cgaggtggag ctaatcccat aaaaccgatc gtagtccgga tcgcagtctg caactcgact 1260
gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtga atcagaatgt cacggtgaat acgttcccgg 1320
gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtgggttg ctccagaagt agctagt 1377
Claims (5)
1.一株斯氏假单胞菌，其分类命名为斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，菌株号为PBAT-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2019年8月5日，保藏编号为CCTCC No .M2019602。
2.一种降解塑料的菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的斯氏假单胞菌。
3.权利要求1所述斯氏假单胞菌在降解PBAT塑料中的应用。
4.权利要求2所述降解塑料的菌剂在降解PBAT塑料中的应用。
5.根据权利要求3或4中的应用，其特征在于所述的PBAT塑料包括PBAT、淀粉-PBAT、木质素-PBAT。
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