CN108004166A

CN108004166A - 一种高效降解pbat塑料地膜的微生物菌群

Info

Publication number: CN108004166A
Application number: CN201711334876.XA
Authority: CN
Inventors: 黄志勇; 徐松; 王敬敬; 周婷婷
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2018-05-08

Abstract

本发明的目的是提供一种高效降解PBAT塑料地膜的微生物菌群，该微生物菌群包含有波茨坦短芽孢杆菌、类芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、硫磺色节杆菌和食菌蛭弧菌。本发现是国内外首次发现高效降解PBAT塑料地膜降解菌群，现有大多数技术是针对PBAT塑料地膜的物理性能进行研究，针对其降解菌群的筛选和利用技术发明还未有发现。该菌群在经过驯化之后，根据失重法计算，可以实现在13天之内对PBAT塑料地膜降解效率达到99％以上，降解后肉眼无法观察到成型PBAT地膜的残存。

Description

一种高效降解PBAT塑料地膜的微生物菌群

技术领域

本发明属于功能微生物菌群筛选、驯化和复配技术领域，具体涉及一种高效降解PBAT塑料地膜的微生物菌群。

背景技术

随着社会经济的快速发展，塑料广泛的应用于社会生活的各个方面，它在方便了人们生产生活的同时由于其在自然环境中极其不易分解，也造成了严重的“白色污染”。在处理这些废弃塑料的同时也会造成严重的环境破坏和污染，所以近年来生物降解塑料作为一种新型环保的高分子材料受到人们的青睐，但是其仍存在自然界中降解缓慢和不可以完全降解的问题的严重了制约了生物可降解塑料的市场化和规模化。

现今，利用微生物降解塑料具有降解效率高、反应条件温和、处理过程清洁无污染等优势，已成为近年来研究的热点。与传统的物理和化学降解方法相比，微生物能够加速生物降解塑料的水解，降解高分子材料，具有低能耗环境友好型等各种优点，因此具有塑料降解活性的微生物成为研究的焦点和热点。PBAT属于热塑性生物降解塑料，是己二酸丁二醇酯和对苯二甲酸丁二醇酯的共聚物，兼具PBA和PBT的特性，既有较好的延展性和断裂伸长率，也有较好的耐热性和冲击性能；此外，还具有优良的生物降解性，是目前生物降解塑料研究中非常活跃和市场应用最好降解材料之一。文献以PBAT为主要成分的塑料地膜虽然是生物可可降解的地膜，但是PBAT地膜降解的不完全降解和降解速率较为缓慢严重制约着PBAT塑料地膜的发展，此外国内外大量的科学研究针对于PBAT塑料地膜的力学和热血性能方面的研究，关于PBAT塑料地膜的降解微生物群落专利报道却未曾发现。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效降解PBAT塑料地膜的微生物菌群，该微生物菌群能够高效降解PBAT塑料地膜，这是国内外首次发现降解PBAT塑料地膜的微生物菌群，从而弥补现有技术的空白。

本发明首先提供一种筛选降解PBAT塑料地膜菌群的培养基，其组成及配比(g/L)如下：NH₄NO₃ 1.0～2.0，MgSO₄·7H₂O 0.2～1.0，K₂HPO₄ 1.0～2.0，CaCl₂·2H₂O 0.1～1.0，KCl 0.15～0.5和1.0～10.0mg/L的FeSO₄·6H₂O,ZnSO₄·7H₂O和MnSO₄，pH为7.6～8.0；所述的培养基中添加有PBAT塑料地膜作为唯一碳源；

本发明再一个方面提供一种筛选具有降解PBAT塑料地膜菌群的方法，是使用上述的培养基进行筛选；

本发明还提供一种高效降解PBAT塑料地膜的微生物菌群，包含有波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)、类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、硫磺色节杆菌(Arthrobacter sulfureus)和食菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)；

上述的微生物菌群中波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)、类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、硫磺色节杆菌(Arthrobacter sulfureus)和食菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)的数量比为7～11:1～2:1～10:11～20:10～20:6～7。

本发明再一个方面提供一种PABT塑料地膜降解的方法，是用上述的复合降解菌制剂对PBAT塑料地膜进行降解；

本发现是国内外首次发现高效降解PBAT塑料地膜降解菌群，现有大多数技术是针对PBAT塑料地膜的物理性能进行研究，针对其降解菌群的筛选和利用技术发明还未有发现。该菌群在经过驯化之后，根据失重法计算，可以实现在13天之内对PBAT塑料地膜降解效率达到99％以上，降解后肉眼无法观察到成型PBAT地膜的残存。

附图说明

图1：PBAT地膜在降解菌群SX降解下形态变化情况图；

图2：转接驯化第九代的菌群SX对PBAT地膜降解速率图；

图3：复配菌群和空白对照组对PBAT地膜降解效果对比图。

图4：复配菌群和空白对照组对PBAT地膜降解速率对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明实施过程作详尽描述。

实施例1：高效PBAT塑料地膜降解菌群的筛选

土壤样品来源：本实验所采用的土壤环境样品分别为来自山东寿光蔬菜基地大棚、福建安溪茶园、新疆81、84建设兵团、广州堆肥厂、印度尼西亚棕榈园和中国科学院天津工业生物技术研究所院内的土壤样品。土壤采样深度为5-10cm，将采集的土壤样品分别贮存于已经完全灭菌的透明封口袋和封口瓶内并编号，密封好，4℃冰箱中保存，备用。

初筛过程：土样为上述采自全国各地的土壤样品，在以PBAT塑料地膜为唯一碳源和能源的上述所新发明SX培养基中进行富集培养。具体操作如下：将10.0g土壤样品加入到250mL的三角瓶中，装有100mL含有3cm×3cm大小左右的300mg PBAT塑料地膜的无机盐液体培养基中，在37摄氏度，180rpm振荡培养，直至PBAT塑料地膜发生降解，以肉眼观察到PBAT塑料地膜明显降解成糊状为指标。

PBAT地膜在菌群SX降解过程中，本课题组研究发现PBAT地膜在降解的过程表观变化的主要经过下面五种形态，具体情况如下(图1)：在未进行任何处理情况下，PBAT地膜表面较为平整、有韧性(图1A)，随添加菌群SX，PBAT地膜韧性逐渐消失，易于破碎，可观察到地膜四周发生破损(图1B)，在菌群的进一步作用下，PBAT地膜发生完全崩解破碎(图1C)，后PBAT地膜由破碎的块状形态在菌群SX的作用下，变成絮状物质心态(图1D)，直至最后降解成肉眼无法观察到的小分子物质(图1E)。

实施例2：高效PBAT塑料地膜降解菌群的驯化

降解菌群的传代驯化：在初始(添加10.0g土壤样品)发现PBAT塑料地膜可发生降解成糊状之后，将该土壤处理组的可降解菌液作为第一代，取10mL的菌液再次按照10％的接种，进行转接到含有3cm×3cm大小左右的300mgPBAT地膜的SX培养基中进行传代二、三、四……N代，在28天转接传代一次。

在以PBAT塑料地膜为唯一碳源的SX培养基中，接种从16年12月22日的新疆84团的土壤样品中筛选得到一种可以降解PBAT塑料地膜的微生物菌群SX，发现PBAT塑料地膜在其内可以发现明显的崩解现象。在37摄氏度培养28天后，发现其对PBAT塑料地膜的降解率可以达到99％以上，而从其他地区采集的土样样品并未有产生可比较的明显的降解效果。从而对其进行不断的转接传代以验证其稳定性。因此证实，微生物菌群SX具有良好的PBAT速率地膜的降解潜力和良好的稳定性。

从新疆84建设兵团棉花田中土壤样品筛选的降解菌群SX，把最初筛选得到的可以降解PBAT地膜降解成糊状的菌群作为第一代，到2017年7月24日为止共转接驯化传代了九次，通过对筛选的到PBAT地膜降解菌群SX进行九代的驯化发现，该菌群的PBAT地膜降解能力都没有因为传代次数的增多而衰退。随着传代次数的增加，菌群逐渐适应了以PBAT地膜为唯一碳源的生长环境，表现出越来越强的PBAT地膜降解能力(图2)。这一结果有别于关于先前各类文献中报道的类似于纤维素降解菌群进行驯化过程的文献中的描述，没有出现退化现象。说明本发明中经过不断驯化的PBAT塑料地膜降解菌群内部各菌株建立了密切协同作用，菌群整体生长性能稳定，在生长稳定性上优于未驯化的PBAT塑料地膜降解天然菌群。

实施例3：高效PBAT塑料地膜降解菌群群落结构分析

从新疆84建设兵团棉花田中土壤样品筛选的降解菌群SX，在经过不断的驯化之后。利用本发明的SX培养基，其组成及配比(g/L)如下：NH₄NO₃ 1.0～2.0，MgSO₄·7H₂O 0.2～1.0，K₂HPO₄ 1.0～2.0，CaCl₂·2H₂O 0.1～1.0，KCl 0.15～0.5和1.0～10.0mg/L的FeSO₄·6H₂O,ZnSO₄·7H₂O和MnSO₄，pH为7.6～8.0；PBAT塑料地膜添加量为300mg每100ml的上述培养基，将PBAT塑料地膜作为唯一碳源。菌群主要是利用PBAT塑料地膜作为生长所需的唯一碳源，在经过不断的驯化之后得到了一组用于PBAT塑料地膜降解的复合微生物菌群，其在降解PBAT塑料地膜时具有优秀的去除效果。

对驯化后的最新一代地膜降解菌液进行DNA的提取，取1.5ml的菌群菌液，12000rmp离心，弃上清收集菌体，加入10mg/mL的溶菌酶0.2毫升，10毫摩尔/L Tris-HCl(pH为8.0)0.2毫升后混匀，37℃下处理化，后续步骤按细菌基因组提取试剂盒说明书进行，参照TIANGEN细菌DNA提取试剂盒进行DNA的提取，并进行电泳鉴定成功得到基因组之后。利用高通量测序的方法，用F515 5'-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3'和R806 5'-GGA CTA CHVGGG TWT CTA AT-3'作为引物序列，高通量测序所得的序列数据采用FLASH和Fastq进行质量控制，再通过Qiime软件流程进行校正，去除嵌合体及靶向区域外的序列，然后进行OUT聚类分析，采用RPD classifier软件贝叶斯算法对97％的相似度水平的OUT代表性序列进行分类学分析，统计各个样品之间的群落组成，分类可信度采用Bootstrap方法估算。对上述降解菌群SX的微生物群落结构进行16s分析，发现菌群中主要存在以下成员：波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)、类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、硫磺色节杆菌(Arthrobacter sulfureus)和食菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)，总数达69％以上。

其中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)所占比例最高，达到20％，其次是硫磺色节杆菌(Arthrobacter sulfureus)的所占比例达到19％，然后是波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)，比例为11％，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)比例为10％，食菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)比例为7％，类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)比例为2％。

在这些活性微生物群落中，本发明的复合菌液选用如下的微生物：波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)，可产甘露聚糖酶，淀粉酶等，对淀粉基类材料具有明显的降解效果，此外还对多种动植物病原真菌有明显抑制作用，适用于植物促生的应用；类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)，可产生如抗生素、拮抗蛋白、植物激素、酶、絮凝剂等多种生物活性物质，对于大分子材料具有一定的降解效果。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，主要应用来发酵腐熟各类有机肥(粪肥)；且提高作物抗病、抗寒、抗旱能力；增加土壤养分、改良土壤结构、提高化肥利用率；促使土壤中的有机质分解成腐殖质，刺激作物生长。解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)对丁草胺具有明显的降解效果，对于有机质的降解具有明显的作用。硫磺色节杆菌(Arthrobacter sulfureus)对含有苯环类化合物具有降解效果，在芳烃降解、耐盐、产表面活性物质等方面均有报道，在有机废弃物降解菌群中，具有降解酚、喹啉、咔唑等有机物的功能。食菌蛭弧菌(Bdellovibriobacteriovorus)能稳定分解蛋白质，一般不直接利用碳水化合物，而以肽、氨基酸作碳源和能源，能液化明胶，严格好氧。

实施例4：高效PBAT塑料地膜降解菌群的复配及降解效果

本发明将实施例3中的高效PBAT降解菌通过上述培养基进行筛选后，参照实施例3中高通量测序上述各个菌的所占数量比例，在经过一系列不断的优化之后，将上述的菌群中波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)、类芽孢杆菌(Paenibacillusbarengoltzii)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、硫磺色节杆菌(Arthrobacter sulfureus)和食菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)的数量比最终确定为7～11:1～2:1～10:11～20:10～20:6～7进行混合，然后利用PBAT塑料地膜作为唯一碳源，在37摄氏度，180rpm的转速培养箱中进行摇瓶实验。

同时参考纤维素降解失重率的方法来计算复配得到菌群对PBAT地膜的降解率，与CK空白对照组进行比较。在PBAT塑料地膜的降解的试验过程中，注意观察PBAT的降解剩余塑料量，在规定的时间从培养液中取出剩余的PBAT地膜，用70％酒精浸泡30min，然后用超纯水清洗两遍，再放在一次性干净的培养皿，置于60℃烘箱烘干过夜，烘干至恒重，称取重量，采用失重测定法利用下面公式计算PBAT塑料地膜的降解率，每个处理有三个重复。

计算失重率的公式：

其中，V为失重率

V₀为初始PBAT塑料地膜的重量(mg)

V₁为降解过程中剩余PBAT塑料地膜的重量(mg)

最终结果证实：这样形成的复配PBAT降解菌液对PBAT地膜依然具有良好的降解效果(图3)，与CK空白对照组相比，在经过15天的降解后，PBAT塑料地膜发现显著的降解(图4)。

本发明筛选获得的复配菌群具有显著的PBAT塑料地膜降解效果，从而能够有效的应用于PBAT塑料地膜处理领域。

Claims

1.一种筛选降解PBAT塑料地膜菌群的培养基，其组成及配比如下：NH₄NO₃ 1.0～2.0，MgSO₄·7H₂O 0.2～1.0，K₂HPO₄ 1.0～2.0，CaCl₂·2H₂O 0.1～1.0，KCl 0.15～0.5和1.0～10.0mg/L的FeSO₄.6H₂O,ZnSO₄.7H₂O和MnSO₄，pH为7.6～8.0；所述的培养基中添加有PBAT塑料地膜作为唯一碳源。

2.一种筛选具有降解PBAT塑料地膜菌群的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的培养基进行筛选。

3.一种降解PBAT塑料地膜的微生物菌群，其特征在于，所述的菌群包含有波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)、类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、硫磺色节杆菌(Arthrobacter sulfureus)和食菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)。

4.如权利要求3所述的菌群，其特征在于，所述的波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillusborstelensis)、类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、硫磺色节杆菌(Arthrobacter sulfureus)和食菌蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)的数量比为7～11:1～2:1～10:11～20:10～20:6～7。

5.一种PABT塑料地膜降解的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求2所述的方法筛选的菌群进行降解。

6.一种PABT塑料地膜降解的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求4或5所述的菌群进行PABT塑料地膜的降解。