CN117701479B - 一株能够降解苯腈类除草剂的菌株及其微生物菌剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株能够降解苯腈类除草剂的菌株及其微生物菌剂和应用。本发明所述菌株或微生物菌剂不仅可以有效降解溴苯腈、辛酰溴苯腈等苯腈类除草剂，还可以进一步降解苯腈类除草剂的中间代谢产物，如降解3,5‑二溴‑4‑羟基苯甲酸、3‑溴‑4‑羟基苯甲酸等卤代苯甲酸。本发明所述菌株能够在36小时内完全降解30 ppm的溴苯腈，在48小时内完全降解30 ppm的溴苯腈降解产生的3,5‑二溴‑4‑羟基苯甲酸。此外，本发明所述微生物菌剂还具有促生作用，能促进种植于黄褐土上的水稻和小麦的生长。本发明不仅有利于降低苯腈类除草剂的药害，也有利于贫瘠土地的利用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一株能够降解苯腈类除草剂的菌株及其微生物菌剂和应用。
背景技术
水稻和小麦是我国重要的主粮作物，其产量和质量对保障我国粮食安全具有重要意义，其生产过程中所遇到和产生的问题也是人们关注的重点。
溴苯腈、辛酰溴苯腈是常用的苯腈类除草剂，常用于水稻、小麦、玉米、高粱等作物田，用于防除蓼、藜、苋、麦瓶草等多种一年生或多年生阔叶杂草。苯腈类除草剂在防治农田杂草、提高农产品质量和产量方面虽发挥了巨大作用，但因其大量甚至过量使用对环境产生的一系列生态问题也引起了人们的重视。
苯腈类除草剂在规定农作物上施用时，极易飘移到邻近作物上，产生飘移药害，同时其对区域内的蚯蚓、小型动物（如兔子）等生物的生存也具有严重的毒害作用。另辛酰溴苯腈的半衰期虽较短，但其中间代谢产物（卤代苯甲酸）在土壤中残留时间较长，一般可达2～3年，在连作和轮作农田中使用极易造成后茬作物药害，减产甚至绝产。卤代苯甲酸是一类重要的化工中间体，也是复杂的卤代芳烃在环境中代谢的重要中间产物。由于卤素元素的电负性极强，易与生命细胞中的酶系统结合，导致这类化合物稳定性高、毒性强，易在环境中迁移，造成土壤严重的面源污染。3,5-二溴-4-羟基苯甲酸是苯腈类除草剂的主要中间代谢物。目前，由于苯腈类除草剂在农田中的大量使用，导致3,5-二溴-4-羟基苯甲酸在环境中被广泛检出。
微生物具有种类繁多、繁殖迅速和对环境适应性强等特点，在农药的生物降解过程中起到了重要作用。利用微生物的新陈代谢作用，对易残留的农药进行无毒化和减量化处理是一种绿色环保的处理方法。现虽有关于苯腈类除草剂降解菌的报道，但数量较少，不利于降解苯腈类除草剂的微生物菌剂的开发和产业化发展。
微生物中的植物根际促生菌是一类能定殖于植物根际的有益菌，可固氮、溶磷，并分泌酶类、激素类和抗菌类物质来促进植物根系的生长发育，促进植物对水分和矿质元素的吸收和利用，增加农作物抗逆性，提高作物产量与品质。但在自然环境中，有机污染物（如农药）的降解和根际微生物的促生作用往往不是单一细菌的作用，而是由复杂的微生物群落中的菌株相互作用完成。目前缺乏同时具有苯腈类除草剂降解作用和促生作用的微生物菌群，尤其是在贫瘠土（如黄褐土）具有促生作用的微生物菌群。
发明内容
本发明针对上述现有技术的不足，提供了一株能够降解苯腈类除草剂的菌株及其微生物菌剂，利用所述菌株或微生物菌剂不仅可以降解苯腈类除草剂及其中间代谢产物，降低苯腈类除草剂药害，还可以促进黄褐土中植物的生长。
本发明的第一个目的是提供一株能够降解苯腈类除草剂的菌株。
本发明的第二个目的是提供一种微生物菌剂。
本发明的第三个目的是提供所述菌株或所述微生物菌剂在降解苯腈类化合物中的应用。
本发明的第四个目的是提供所述菌株或所述微生物菌剂在制备用于降解苯腈类化合物的产品中的应用。
本发明的第五个目的是提供所述菌株或所述微生物菌剂在降解卤代苯甲酸中的应用。
本发明的第六个目的是提供所述菌株或所述微生物菌剂在制备用于降解卤代苯甲酸的产品中的应用。
本发明的第七个目的是提供所述菌株或所述微生物菌剂在促进种植于黄褐土上的植物生长中的应用。
本发明的第八个目的是提供所述菌株或所述微生物菌剂在制备用于促进种植于黄褐土上的植物生长的产品中的应用。
本发明的第九个目的是提供一种用于促进种植于黄褐土上的植物生长的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一株能够降解苯腈类除草剂的菌株，为阿氏普里斯特氏菌（Priestia aryabhattai）Ba1-1菌株（简称Ba1-1菌株），其能降解苯腈类除草剂以及苯腈类除草剂的中间代谢产物，降低苯腈类除草剂药害。在此基础上，本发明通过将Ba1-1菌株与其它微生物菌株复配，促进了包括Ba1-1菌株在内的总生物量的增长，使复配所得微生物菌剂较Ba1-1菌株具有更好的苯腈类除草剂降解效果。此外，Ba1-1菌株与其它菌株复配所得微生物菌剂还能有效促进黄褐土上植物的生长。因此，本发明请求保护所述Ba1-1菌株及其微生物菌剂和相关的应用。
本发明请求保护一株能够降解苯腈类除草剂的菌株。具体地，所述菌株为阿氏普里斯特氏菌（Priestia aryabhattai）Ba1-1菌株，该菌株于2023年10月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63940。
本发明还请求保护一种微生物菌剂，所述微生物菌剂中含有阿氏普里斯特氏菌Ba1-1菌株。
作为更优的实施方式，所述微生物菌剂中还含有焦瑞身氏溶杆菌（Lysobacter ruishenii）SCAU-3菌株或含有焦瑞身氏溶杆菌SCAU-3菌株、Pseudoxanthomonas indicaSCAU-4菌株和帽形黄色土杆菌（Flavihumibacter petaseus）SCAU-5菌株中的任意两种或三种。
Ba1-1菌株与SCAU-3菌株或与SCAU-3菌株、SCAU-4菌株和SCAU-5菌株中的任意两种或三种共同培养均可显著提升其总生物量，使复配所得微生物菌剂较Ba1-1菌株单菌具有更好的降解苯腈类除草剂的效果。
具体地，所述Lysobacter ruisheniiSCAU-3菌株于2023年10月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63943；所述Pseudoxanthomonas indicaSCAU-4菌株于2023年10月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63944；所述Flavihumibacter petaseusSCAU-5菌株于2023年10月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63945。
本发明所述微生物菌剂包括含所述菌株的菌液、菌粉等。
具体地，所述微生物菌剂中，Ba1-1菌株：SCAU-3菌株：SCAU-4菌株：SCAU-5菌株的浓度比为0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2；不含某菌株时，对应菌株的浓度为0，其余菌株的浓度比仍相同。
优选地，所述微生物菌剂中，Ba1-1菌株：SCAU-3菌株：SCAU-4菌株：SCAU-5菌株的浓度比为1:1:1:1。
本发明所述Ba1-1菌株能降解苯腈类除草剂以及苯腈类除草剂的中间代谢产物，可将其用于降解苯腈类除草剂以及苯腈类除草剂的中间代谢产物或用于制备相关降解产品。SCAU-3菌株、SCAU-4菌株和SCAU-5菌株虽没有降解苯腈类除草剂的效果，但其与Ba1-1菌株共同培养可以显著提高各菌株的生物量，进而提高降解苯腈类除草剂等的效果。因此，本发明请求保护所述Ba1-1菌株或本发明所述微生物菌剂在降解苯腈类化合物中的应用。
本发明还请求保护所述Ba1-1菌株或本发明所述微生物菌剂在制备用于降解苯腈类化合物的产品中的应用。
具体地，所述苯腈类化合物为苯腈类除草剂。
更具体地，所述苯腈类除草剂为溴苯腈和/或辛酰溴苯腈。
本发明还请求保护所述Ba1-1菌株或本发明所述微生物菌剂在降解卤代苯甲酸中的应用。
本发明还请求保护所述Ba1-1菌株或本发明所述微生物菌剂在制备用于降解卤代苯甲酸的产品中的应用。
具体地，所述卤代苯甲酸为3,5-二溴-4-羟基苯甲酸和/或3-溴-4-羟基苯甲酸。
本发明还请求保护所述Ba1-1菌株或本发明所述微生物菌剂在促进种植于黄褐土上的植物生长中的应用。
本发明还请求保护所述Ba1-1菌株或本发明所述微生物菌剂在制备用于促进种植于黄褐土上的植物生长的产品中的应用。
具体地，所述植物为小麦和/或水稻。
更具体地，所述水稻包括粳稻和籼稻。
本发明还提供了一种修复苯腈类除草剂和/或卤代苯甲酸污染的方法，所述方法为：将所述Ba1-1菌株或所述微生物菌剂施于含苯腈类除草剂和/或卤代苯甲酸的环境中。
本发明还提供了一种用于促进种植于黄褐土上的植物生长的方法，所述方法为：将所述Ba1-1菌株或所述微生物菌剂施加于黄褐土后再种植植物。
本发明还提供了所述微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.将Ba1-1菌株、SCAU-3菌株、SCAU-4菌株和SCAU-5菌株分别培养至对数生长期，得活化菌液；
S2.将各菌株的活化菌液分别按10～12%（v/v）的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，得种子液；
S3.将各菌株的种子液分别按10～12%（v/v）的接种量接入生产罐，培养至菌体数量达到10亿个/mL以上；将培养所得菌液按所要制备的微生物菌剂的组成和比例（等浓度等体积）混合均匀后，用容器（塑料包装桶或包装瓶）分装成液体剂型，或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
具体地，步骤S1中所用培养基为R2A培养基。
更具体地，所述R2A培养基的配方为：胰蛋白胨0.25 g/L，酸水解酪蛋白0.5 g/L，酵母浸粉0.5 g/L，可溶性淀粉0.5 g/L，磷酸氢二钾（K2HPO4）0.3 g/L，硫酸镁（MgSO4）0.1g/L，丙酮酸钠0.3 g/L，蛋白胨0.25 g/L，葡萄糖0.5 g/L，pH 7.2±0.2。
具体地，步骤S2中所述种子罐中所用培养基的配方为：葡萄糖8 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO41g/L，NaCl 5 g/L，CaCO32 g/L，MgSO40.2 g/L，大豆油0.1%（v/v），pH值7.2～7.5。步骤S3所述生产罐中所用培养基与种子罐中相同。
具体地，在种子罐和生产罐的培养过程中，无菌空气的通气量为1:0.6～1.2，搅拌速度为180～240转/分，培养温度为35 ℃，全流程培养时间为96～108小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一株能够降解苯腈类除草剂的菌株（Priestia aryabhattaiBa1-1菌株）及其微生物菌剂，所述菌株或微生物菌剂不仅可以有效降解溴苯腈、辛酰溴苯腈等苯腈类除草剂，还可以进一步降解苯腈类除草剂的中间代谢产物，如降解3,5-二溴-4-羟基苯甲酸、3-溴-4-羟基苯甲酸等卤代苯甲酸。本发明所述微生物菌剂能够在36小时内完全降解30 ppm的溴苯腈，在48小时内完全降解30 ppm的溴苯腈降解产生的3,5-二溴-4-羟基苯甲酸。此外，本发明所述微生物菌剂还具有促生作用，能促进种植于贫瘠土地上的水稻和小麦的生长。
本发明不仅有利于降低苯腈类除草剂药害，修复苯腈类除草剂及其中间代谢产物所带来的环境污染，也有利于贫瘠土地的利用。本发明所述菌株或微生物菌剂还具有生产使用成本低，使用方便，修复及促生效果好的优点，适合在受卤代芳烃污染的农业生产区、粮油蔬菜生产出口基地、有绿色食品商标标志及贫瘠土地的地区大面积推广使用。
附图说明
图1为Ba1-1菌株在R2A平板上的菌落形态及其在含辛酰溴苯腈的MM固体培养基上的生长情况；图中的A为Ba1-1菌株在R2A平板上的菌落形态；图中的B为Ba1-1菌株在含1 mM辛酰溴苯腈的MM固体培养基上的生长情况。
图2为SCAU-3菌株在NA平板上的菌落形态。
图3为SCAU-4菌株在NA平板上的菌落形态。
图4为SCAU-5菌株在R2A平板上的菌落形态。
图5为Ba1-1菌株的16S rRNA基因系统发育分析结果。
图6为SCAU-3菌株的16S rRNA基因系统发育分析结果。
图7为SCAU-4菌株的16S rRNA基因系统发育分析结果。
图8为SCAU-5菌株的16S rRNA基因系统发育分析结果。
图9为Ba1-1菌株生长的最适温度、最适pH值和最适NaCl浓度测试结果。
图10为SCAU-3菌株生长的最适温度、最适pH值和最适NaCl浓度测试结果。
图11为SCAU-4菌株生长的最适温度、最适pH值和最适NaCl浓度测试结果。
图12为SCAU-5菌株生长的最适温度、最适pH值和最适NaCl浓度测试结果；图中的A为最适温度测试结果；图中的B为最适pH值测试结果；图中的C为最适NaCl浓度测试结果。
图13为Ba1-1菌株降解溴苯腈不同时间后的色谱检测结果及Ba1-1菌株对辛酰溴苯腈的降解曲线；图中的A为Ba1-1菌株降解溴苯腈0 h时的色谱检测结果；图中的B为Ba1-1菌株降解溴苯腈24 h时的色谱检测结果；图中的C为Ba1-1菌株降解溴苯腈36 h时的色谱检测结果；图中的D为Ba1-1菌株降解溴苯腈48 h时的色谱检测结果；图中的E为Ba1-1菌株降解溴苯腈60 h时的色谱检测结果；图中的F为Ba1-1菌株对辛酰溴苯腈的降解曲线。
图14为Ba1-1菌株、SCAU-3菌株、SCAU-4菌株、SCAU-5菌株单菌及四种菌混合（Mixture）降解辛酰溴苯腈40 h时的降解率； P＜0.05。
图15为不同处理组对粳稻幼苗生长的影响；图中的A为植株高度变化；图中的B为叶片数变化；图中的C为植株的生长情况。
图16为不同处理组对籼稻幼苗生长的影响；图中的A为植株高度变化；图中的B为叶片数变化；图中的C为植株的生长情况。
图17为不同处理组对小麦幼苗生长的影响；图中的A为植株高度变化；图中的B为叶片数变化；图中的C为植株的生长情况。
图18为Ba1-1菌株、SCAU-3菌株、SCAU-4菌株、SCAU-5菌株通过MATLAB计算机模拟的单菌、两菌、三菌及四菌组合在仅含葡萄糖和氨态氮的培养基中生长的生物量。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明所述Ba1-1菌株为阿氏普里斯特氏菌（Priestia aryabhattai），该菌株于2023年10月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63940，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述SCAU-3菌株为焦瑞身氏溶杆菌（Lysobacter ruishenii），该菌株于2023年10月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63943，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述SCAU-4菌株为Pseudoxanthomonas indica，该菌株于2023年10月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63944，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述SCAU-5菌株为帽形黄色土杆菌（Flavihumibacter petaseus），该菌株于2023年10月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63945，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例1 菌株的分离、鉴定及其最适生长条件测试
1、Ba1-1菌株的分离
本发明所述Ba1-1菌株的分离过程如下：
取采自江苏某农药厂厂区的土壤样品5.0 g，加入100 mL含有0.2 mM辛酰溴苯腈的无机盐（MM）培养基，30 ℃、150 rpm摇床培养5天；以5%接种量（v/v）转接至新鲜的同一培养基中，连续富集培养四次；将第五代富集液在含有1 mM辛酰溴苯腈的MM固体培养基上稀释涂布，30 ℃培养4天，挑取平板上产生透明水解圈的单菌落于4 mL液体LB试管培养基中，保存并转接至20 mL含有0.2 mM辛酰溴苯腈的MM培养基中，30 ℃培养5天；用等体积的二氯甲烷萃取，紫外分光光度计检测辛酰溴苯腈降解效果，依据检测结果保存想要的菌株，其中含有辛酰溴苯腈降解菌株Ba1-1，用15%的甘油保存在-80 ℃冰箱。
Ba1-1菌株在R2A平板上的菌落形态及其在含辛酰溴苯腈的MM固体培养基上的生长情况如图1所示；图1中的A为Ba1-1菌株在R2A平板上的菌落形态；图1中的B为Ba1-1菌株在含有1 mM辛酰溴苯腈的MM固体培养基上的生长情况。由图1中的A可知，Ba1-1菌株在R2A平板上呈淡黄色菌落，菌落圆形，小而凸起，表面湿润光滑，边缘整齐，不透明。进一步对其形态和生理特性进行观察发现，Ba1-1菌株为5～8 μm的棒状菌，革兰氏染色阳性，对青霉素和林可霉素具有抗性。
辛酰溴苯腈在水中是难溶的，会变成乳浊液。由图1中的B可知，Ba1-1菌株在含有1mM辛酰溴苯腈的MM固体培养基上培养时能产生透明圈，说明菌体周围的辛酰溴苯腈已经被降解。
2、SCAU-3、SCAU-4和SCAU-5菌株的分离
本发明所述SCAU-3、SCAU-4和SCAU-5菌株的分离过程如下：
采集受苯腈类除草剂污染的黄褐土农田的土样来种植小麦，从小麦苗期移栽后开始取第0、3、9、18、30天的根际土样品，用于16S rRNA扩增子测序。通过高通量测序分析获得小麦土样监测后期出现显著性增长的菌株，并对第30天的小麦根际土样品进行筛菌。具体的筛菌方法如下：
取0.5 g土样加入20 mL MM培养基，30 ℃、150 rpm摇床培养1天进行复苏；将复苏后的土壤菌悬液在R2A或NA固体培养基上稀释涂布，30 ℃培养3天；挑取平板上的单菌落于4 mL R2A或NA液体培养基中，将分离到的单菌通过16S rRNA PCR检测和序列比对获得菌株信息，与高通量测序分析得到的显著性增长的关键菌株一一核对，确认并获得小麦根际关键菌SCAU-3、SCAU-4和SCAU-5，用15%的甘油保存在-80 ℃冰箱。
SCAU-3菌株在NA平板上的菌落形态如图2所示。由图2可知，SCAU-3菌株在NA平板上呈白色菌落，菌落圆形，大而凸起，表面干燥褶皱，边缘整齐且不透明。进一步对其形态和生理特性进行观察发现，SCAU-3菌株的菌体为杆状，0.5～0.6 μm宽，1.1～1.2 μm长，周生鞭毛，好氧，革兰氏染色阴性，吲哚反应阴性，对青霉素、链霉素、氨苄西林、林可霉素有耐受性。
SCAU-43菌株在NA平板上的菌落形态如图3所示。由图3可知，SCAU-4菌株在NA平板上呈浅乳白色菌落，菌落圆形，小而凸起，表面光滑，边缘整齐且不透明。进一步对其形态和生理特性进行观察发现，SCAU-4菌株的菌体为直或弯曲的杆状体，具有单极鞭毛，好氧，革兰氏染色阴性，对青霉素、氨苄西林和林可霉素具有抗性。
SCAU-5菌株在R2A平板上的菌落形态如图4所示。由图4可知，SCAU-5菌株在R2A平板上呈黄色菌落，菌落圆形，光滑，直径1～2 mm。进一步对其形态和生理特性进行观察发现，SCAU-5菌株的菌体为杆状，大小为0.4～0.5 μm宽，0.5～0.6 μm长，无运动，革兰氏染色阳性，对卡那霉素、青霉素、氨苄西林、红霉素、林可霉素有耐受性。
3、菌株的鉴定
分别提取Ba1-1、SCAU-3、SCAU-4和SCAU-5菌株的基因组DNA，利用细菌16S rRNA通用引物（27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’）扩增各菌株的16S rRNA基因片段并委托擎科生物科技有限公司进行测序，将测序结果在数据库EzBioCloud中进行比对，进行菌株的16S rRNA基因系统发育分析。
Ba1-1菌株、SCAU-3菌株、SCAU-4菌株和SCAU-5菌株的16S rRNA基因片段序列依次如SEQ ID NO.1～4所示。将Ba1-1菌株的16S rRNA基因序列在数据库EzBioCloud中进行比对分析，结果显示菌株Ba1-1与Priestia属亲缘关系最近，其中与Priestia aryabhattaiB8W22T相似性达99.79%，与Priestia megateriumNBRC 15308T相似性达99.65%。结合菌落形态特性、生理生化特征以及16S rRNA基因系统发育分析结果（如图5所示），Ba1-1菌株初步鉴定为阿氏普里斯特氏菌（Priestia aryabhattai）。
将SCAU-3菌株的16S rRNA基因序列在数据库EzBioCloud中进行比对分析，结果显示SCAU-3菌株与Lysobacter属亲缘关系最近，其中与Lysobacter ruisheniiCGMCC1.10136T相似性达99.79%，与Lysobacter oleiD-14T相似性达98.23%。结合菌落形态特性、生理生化特征以及16S rRNA基因系统发育分析结果（如图6所示），SCAU-3菌株初步鉴定为焦瑞身氏溶杆菌（Lysobacter ruishenii）。
将SCAU-4菌株的16S rRNA基因序列在数据库EzBioCloud中进行比对分析，结果显示SCAU-4菌株与Pseudoxanthomonas属亲缘关系最近，其中与Pseudoxanthomonas indicaP15T相似性达99.43%，与Pseudoxanthomonas mexicanaAMX26BT相似性达97.30%。结合菌落形态特性、生理生化特征以及16S rRNA基因系统发育分析结果（如图7所示），SCAU-4菌株初步鉴定为Pseudoxanthomonas indica。
将SCAU-5菌株的16S rRNA基因序列在数据库EzBioCloud中进行比对分析，结果显示SCAU-5菌株与Flavihumibacter属亲缘关系最近，其中与Flavihumibacter petaseusNBRC 106054T相似性达99.86%，与Flavihumibacter profundiCHu64-6-1T相似性达97.35%。结合菌落形态特性、生理生化特征以及16S rRNA基因系统发育分析结果（如图8所示），SCAU-5菌株初步鉴定为帽形黄色土杆菌（Flavihumibacter petaseus）。
4、菌株的最适生长条件测试
Ba1-1菌株生长的最适温度、最适pH值和最适NaCl浓度的测试结果如图9所示。由图9可知，Ba1-1菌株的生长温度范围为4～37 ℃，最适生长温度为30 ℃，生长pH范围为5～10，最适pH为6～9，有较强的NaCl耐受能力，在NaCl浓度为0.5～3%（w/v）时均可快速生长。
SCAU-3菌株生长的最适温度、最适pH值和最适NaCl浓度的测试结果如图10所示。由图10可知，SCAU-3菌株的生长温度范围为25～37 ℃，最适生长温度为30 ℃，生长pH范围为6～10，最适pH为8～9，在NaCl浓度为0.5%（w/v）时可快速生长。
SCAU-4菌株生长的最适温度、最适pH值和最适NaCl浓度的测试结果如图11所示。由图11可知，SCAU-4菌株的生长温度范围为25～37 ℃，最适生长温度为30 ℃，生长pH范围为5～10，最适pH为6～10，在NaCl浓度为0.5～1.5%（w/v）时可快速生长。
SCAU-5菌株生长的最适温度、最适pH值和最适NaCl浓度的测试结果如图12所示。由图12可知，SCAU-5菌株的生长温度范围为4～37 ℃，最适生长温度为25 ℃（图12中的A），生长pH范围为4～10，最适pH为5～8（图12中的B），在NaCl浓度为0.5%（w/v）时可快速生长（图12中的C）。
实施例2 苯腈类除草剂降解实验
本发明利用高效液相色谱（HPLC）法检测了Ba1-1菌株对溴苯腈及其中间代谢产物的降解情况，同时基于检测结果，绘制了Ba1-1菌株降解辛酰溴苯腈（简称BO）的降解曲线，以此反应Ba1-1菌株对苯腈类除草剂的降解情况。各化合物的高效液相色谱检测方法如下，检测所用高效液相色谱仪为岛津RID-10A，色谱柱为C18反相柱，规格250 mm×4.6 mm；柱温为30°C。
高效液相色谱法检测辛酰溴苯腈：取20 mL样品（降解菌液）加5 mL二氯甲烷整瓶萃取，用无水硫酸钠去除有机相多余水分后取0.25 mL于1.5 mL离心管中，在通风处中吹干后，加入1 mL甲醇复溶，经孔径为0.22 μm有机相滤膜过滤后用HPLC检测。检测条件：流动相为100%甲醇，流速为1.0 mL/min；检测波长为221 nm和229 nm。
高效液相色谱法检测溴苯腈：取1 mL样品，12000 rpm离心5min，小心吸取上清，上清经孔径为0.22 μm水相滤膜过滤后用HPLC检测。检测条件：流动相为乙腈:水:乙酸（50:50:0.5，V:V:V），流速为1.0 mL/min；检测波长为221 nm和250 nm。
高效液相色谱法检测3,5-二溴-4-羟基苯甲酸（简称DBHB）：取1 mL样品12000 rpm离心5min，小心吸取上清，上清经孔径为0.22 μm水相滤膜过滤后用HPLC检测。检测条件：流动相为甲醇:水:乙酸（60:40:0.5，V:V:V），流速为1.0 mL/min；检测波长为221 nm和250nm。
高效液相色谱法检测3-溴-4-羟基苯甲酸（简称BHB）：取1 mL样品，12000 rpm离心5 min，小心吸取上清，上清经孔径为0.22 μm水相滤膜过滤后用HPLC检测。检测条件：流动相为甲醇:水:乙酸（60:40:0.5，V:V:V），流速为1.0 mL/min；检测波长为221 nm和250 nm。
高效液相色谱法检测2-溴苯酚：取1 mL样品，12000 rpm离心5 min，小心吸取上清，上清经孔径为0.22 μm水相滤膜过滤后用HPLC检测。检测条件：流动相为甲醇:水:乙酸（60:40:0.5，V:V:V），流速为1.0 mL/min；检测波长为221 nm和250 nm。
高效液相色谱法检测4-羟基苯甲酸（简称HB）：取1 mL样品，12000 rpm离心5 min，小心吸取上清，上清经孔径为0.22 μm水相滤膜过滤后用HPLC检测。检测条件：流动相为甲醇:水:乙酸（60:40:0.5，V:V:V），流速为1.0 mL/min；检测波长为221 nm和250 nm。
将Ba1-1菌株按终浓度为0.03（OD600值）的接种量接至含30 mg/L（30 ppm）溴苯腈/辛酰溴苯腈的20 mL MM培养基中，30 ℃、150 rpm摇床培养，在培养0 h、24 h、36 h、48 h、60 h分别取1 mL用于检测菌体的浓度（OD600值），绘制菌株生长曲线，对于剩下的降解菌液进行整瓶破坏性取样，用等体积二氯甲烷萃取，取至60小时。用高效液相色谱法检测辛酰溴苯腈的浓度，绘制其降解曲线。
Ba1-1菌株降解溴苯腈不同时间后的色谱检测结果及Ba1-1菌株对辛酰溴苯腈的降解曲线如图13所示；图13中的A为Ba1-1菌株降解溴苯腈0 h时的色谱检测结果；图13中的B为Ba1-1菌株降解溴苯腈24 h时的色谱检测结果；图13中的C为Ba1-1菌株降解溴苯腈36 h时的色谱检测结果；图13中的D为Ba1-1菌株降解溴苯腈48 h时的色谱检测结果；图13中的E为Ba1-1菌株降解溴苯腈60 h时的色谱检测结果；图13中的F为Ba1-1菌株对辛酰溴苯腈的降解曲线。
由图13中的A～E可知，随着降解时间的延长，Ba1-1菌株能将溴苯腈降解为3,5-二溴-4-羟基苯甲酸，再降解为3-溴-4-羟基苯甲酸，最终降解为4-羟基苯甲酸，从而降低溴苯腈及其中间代谢产物的危害，且所述Ba1-1菌株能够在36小时内完全降解30 ppm的溴苯腈，在48小时内完全降解30 ppm的溴苯腈降解产生的3,5-二溴-4-羟基苯甲酸。由图13中的F可知，菌株Ba1-1在60 h时对辛酰溴苯腈的降解率达86.67%，并能以辛酰溴苯腈为唯一碳源生长，菌体浓度（OD600值）由初始的0.03增至0.05。
此外，本发明还分别检测了Ba1-1菌株、SCAU-3菌株、SCAU-4菌株、SCAU-5菌株和四种菌混合（四种菌按等浓度等体积混合，称为Mixture）对辛酰溴苯腈的降解率。将Ba1-1菌株、SCAU-3菌株、SCAU-4菌株、SCAU-5菌株和Mixture分别按终浓度0.03（OD600值）的接种量接至含有30 mg/L辛酰溴苯腈的20 mL MM中，30 ℃、150 rpm摇床培养，期间取1 mL用于检测菌体的浓度（OD600值），绘制菌株生长曲线，对剩下的MM进行整瓶破坏性取样，用等体积二氯甲烷萃取，取至45小时，用高效液相色谱法检测辛酰溴苯腈的浓度。
Ba1-1菌株、SCAU-3菌株、SCAU-4菌株、SCAU-5菌株单菌及四种菌混合（Mixture）降解辛酰溴苯腈40 h时的降解率如图14所示。由图14可知，SCAU-3菌株、SCAU-4菌株和SCAU-5菌株均没有降解辛酰溴苯腈的能力。在第40小时，四种菌混合对30 ppm辛酰溴苯腈（BO）的降解率已达73.67%，而Ba1-1菌株单菌在相同条件下的降解率为59.67%，四种菌混合对辛酰溴苯腈的降解能力有显著性提高（P＜0.05）。
实施例3 微生物菌剂对贫瘠地小麦及水稻幼苗生长的影响
1、微生物菌剂种子液的制备
分别挑取Ba1-1菌株、SCAU-3菌株、SCAU-4菌株和SCAU-5菌株至100 mL添加有0.2mM辛酰溴苯腈的R2A液体培养基中，30 ℃，160 rpm摇床培养至菌体生长对数期，6000 rpm离心5 min收集菌体，用灭菌的MM培养基洗涤菌体2次，再用10 mL灭菌的MM培养基重悬，将重悬后的四种菌株的菌液按等浓度等体积混合均匀，得菌体种子液。
2、植株的处理
分别对粳稻（南粳9108）、籼稻（黄华占）、小麦（济麦22）种子进行消毒、发苗，待籼稻生长至2叶期准备移栽，待粳稻和小麦生长至3叶期准备移栽。
水稻组的处理方法如下：
每个花盆中加入200 g土样（来自贫瘠地黄褐土农田），将制备的微生物菌剂的菌体种子液按2×107CFU/kg的比例加入土样中混合均匀，此处理为“苗+菌”组；每个花盆中加入200 g土样（来自贫瘠地黄褐土农田），加辛酰溴苯腈溶液至其在土样中的浓度为10 mg/kg土，此处理为“苗+药”组；每个花盆中加入200 g土样（来自贫瘠地黄褐土农田），先加辛酰溴苯腈溶液至其在土样中的浓度为10 mg/kg土，再将制备的微生物菌剂的菌体种子液按2×107CFU/kg的比例加入土样中混合均匀，此处理为“苗+药+菌”组；另设置CK空白对照组（苗组），该组仅加入与种子液等体积的水；随后在每个花盆里移栽3株水稻苗，各设置3个重复实验组。
小麦组的处理方法如下：
每个花盆中加入200 g土样（来自贫瘠地黄褐土农田），加辛酰溴苯腈溶液至浓度为10 mg/kg土，将制备的微生物菌剂的菌体种子液按2×107CFU/kg的比例加入土样中混合均匀，此处理为加药加菌组；每个花盆中加入200 g土样（来自贫瘠地黄褐土农田），加辛酰溴苯腈溶液至浓度为10 mg/kg土，加入与种子液等体积的水，此处理为仅加药组；每个花盆中加入200 g灭菌土样（来自贫瘠地黄褐土农田），加辛酰溴苯腈溶液至浓度为10 mg/kg土，将制备的微生物菌剂的菌体种子液按2×107CFU/kg的比例加入土样中混合均匀，此处理为加药加菌（灭菌土）组；随后在每个花盆里移栽3株小麦苗，各设置3个重复实验组。
定时浇水保证每个花盆的总质量不变；测量粳稻、籼稻组的初始（0 d）以及培养14d后的株高、叶片数变化，小麦组测量14 d及28 d的株高、叶片数变化，记录各处理组的生长情况。
不同处理组对粳稻、籼稻和小麦幼苗生长的影响依次如图15～17所示；图中的A为植株高度变化；图中的B为叶片数变化；图中的C为植株的生长情况。
由图15可知，在粳稻的种植实验中，“苗+菌”组与“苗”组相比，叶片数增长1.05倍；“苗+药+菌”组与“苗+药”组相比，株高增长1.03倍，叶片数增长1.2倍。而由图16可知，在籼稻的种植实验中，“苗+菌”组与“苗”组相比，株高增长4.35倍，叶片数增长1.79倍；“苗+药+菌”组与“苗+药”组相比，株高增长4.35倍，叶片数增长1.69倍。
辛酰溴苯腈为苯腈类选择性芽后茎叶触杀型除草剂，通过抑制光合作用过程促使植物组织坏死，达到最终除草目的。苯腈类除草剂除对杂草有药害外，对苗期作物也会有一定的影响，甚至会对后茬作物的生长产生抑制。此外，苯腈类除草剂的施用对土壤菌群，尤其是益生菌群也会产生抑制作用，将严重影响土壤菌群结构和丰度的稳定性，从而导致作物生长状况不佳。上述原因导致了苯腈类除草剂和微生物菌剂同时施加时，效果可能要差一些。但相比仅加药组，额外添加菌剂对水稻/小麦的生长有显著促进作用。
由图17可知，在小麦的种植实验中，加药加菌（灭菌土）组与仅加药组相比，株高增长1.33倍，叶片数增长2倍；而加药加菌组与仅加药组相比，株高增长1.82倍。
上述数据计算的是株高/叶片数的增长倍数，以水稻中“苗+菌”组与“苗”组的株高增长倍数的计算为例，其计算公式为：（“苗+菌”组14天的平均株高-“苗+菌”组0天平均株高）/（“苗”组14天的平均株高-“苗”组0天平均株高）。上述结果表明，本发明所述微生物菌剂可以促进种植于黄褐土的水稻和小麦的生长。
实施例4 生物量实验
本实施例所用方法参照文献Ruan Z, Xu M, Xing Y, Jiang Q, Yang B, JiangJ, Xu X. Interspecies Metabolic Interactions in a Synergistic ConsortiumDrive Efficient Degradation of the Herbicide Bromoxynil Octanoate. J AgricFood Chem. 2022 Sep 21;70(37):11613-11622. doi: 10.1021/acs.jafc.2c03057.Epub 2022 Sep 11. PMID: 36089742.
过程如下：
1、单菌株模型的构建与校正
利用Ba1-1、SCAU-3、SCAU-4和SCAU-5菌株的全基因组序列，基于GSMMs（一种基于基因-蛋白质-代谢反应关联结合化学计量平衡的数学框架，可以通过优化目标兴趣函数来促进多尺度表型的预测）分别构建单菌株代谢模型并进行人工校正。人工校正是在MATLAB数学软件中通过COBRAToolbox-3.0完成，依据包括实验数据（每个菌株生长所需的最简培养基）、文献资料和公共数据库。对于有降解能力的菌株，根据其对农药的代谢步骤手动添加代谢反应。模型验证的内容包括验证模型模拟和实验中菌株对不同碳源和氮源的利用能力是否一致；验证模型预测的特定条件下（如仅含辛酰溴苯腈为唯一碳氮源的培养基）的菌株生长量与实验测定的生长数据是否一致。
2、多菌-菌群模型构建与多条件模拟
对于微生物菌群模拟，本发明开发了一个最佳功能菌株组合设计框架SuperCC（https://github.com/ruanzhepu/superCC.git），用于预测不同营养环境下微生物菌群的代谢通量分布，由此预测菌群内菌株之间的相互作用及最优的菌株组合。在MATLAB数学软件中构建了2菌/3菌/4菌的菌群（菌群中各菌均为等比例混合），并计算在培养基中仅含有100 mmol/g DW辛酰溴苯腈、100 mmol/g DW葡萄糖和100 mmol/g DW NH4 +为唯一碳氮源时的模拟情况，结果如图18所示。图中的每一横行代表一个组合，菌所对应色块有颜色表示该组合中存在对应菌；模拟的碳氮源含量均恒定且一致。以第一行为例，该组合里只有Ba1-1菌株单菌，其生物量对应左边的颜色，将颜色与右边的图例柱颜色对应可比较其生物量。同理，最下面一行的组合是同时含有4个菌株，其生物量是最高的。
由图18可知，本发明所述四个菌株在单菌的时候利用所述碳氮源所生成的生物量都极低，在0～13之间，尤其是菌株SCAU-3，在上述条件下难以获得增长。但当菌株以组合的形式出现时，Ba1-1和SCAU-3组成的2菌-菌群，或者Ba1-1和SCAU-3、SCAU-4、SCAU-5中的任意两菌组成的3菌-菌群都能产生翻倍的总生物量。此外，当SCAU-3、SCAU-4和SCAU-5组合时，由于菌株间的竞争关系，反而使总生物量更少了（甚至少于单菌时的生物量）。但四菌进行组合时，Ba1-1可以协调其余3菌间的竞争关系，可以促进总生物量的增长。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1. 一株能够降解苯腈类除草剂的菌株，其特征在于，所述菌株为阿氏普里斯特氏菌（Priestia aryabhattai）Ba1-1菌株，该菌株于2023年10月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63940。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的阿氏普里斯特氏菌Ba1-1菌株。
3. 根据权利要求2所述微生物菌剂，其特征在于，还含有焦瑞身氏溶杆菌（Lysobacter ruishenii）SCAU-3菌株或含有焦瑞身氏溶杆菌SCAU-3菌株、Pseudoxanthomonas indicaSCAU-4菌株和帽形黄色土杆菌（Flavihumibacter petaseus）SCAU-5菌株中的任意两种或三种；
所述焦瑞身氏溶杆菌SCAU-3菌株于2023年10月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63943；
所述Pseudoxanthomonas indica SCAU-4菌株于2023年10月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63944；
所述帽形黄色土杆菌SCAU-5菌株于2023年10月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63945。
4.权利要求1所述菌株或权利要求2所述微生物菌剂在降解苯腈类除草剂中的应用。
5.权利要求1所述菌株或权利要求2所述微生物菌剂在制备用于降解苯腈类除草剂的产品中的应用。
6.权利要求1所述菌株或权利要求2所述微生物菌剂在降解卤代苯甲酸中的应用，其特征在于，所述卤代苯甲酸为3,5-二溴-4-羟基苯甲酸和/或3-溴-4-羟基苯甲酸。
7.权利要求1所述菌株或权利要求2所述微生物菌剂在制备用于降解卤代苯甲酸的产品中的应用，其特征在于，所述卤代苯甲酸为3,5-二溴-4-羟基苯甲酸和/或3-溴-4-羟基苯甲酸。
8.权利要求1所述菌株或权利要求2所述微生物菌剂在促进种植于黄褐土上的植物生长中的应用，其特征在于，所述植物为小麦和/或水稻。
9.权利要求1所述菌株或权利要求2所述微生物菌剂在制备用于促进种植于黄褐土上的植物生长的产品中的应用，其特征在于，所述植物为小麦和/或水稻。
10.一种用于促进种植于黄褐土上的植物生长的方法，其特征在于，将权利要求1所述菌株或权利要求2所述微生物菌剂施加于黄褐土后再种植植物；所述植物为小麦和/或水稻。
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| CN117701479A (zh) | 2024-03-15 |
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