CN111172071B - 一株可提高酸性土壤pH值的拮抗细菌及其菌剂的制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株可提高酸性土壤pH值的拮抗细菌及其菌剂的制备和应用。该拮抗菌株为解淀粉芽孢杆菌，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18619；该菌株对尖孢镰刀菌、小麦根腐平脐蠕孢、禾谷镰刀菌、胶胞炭疽菌、链格孢菌、杨树溃疡病菌等病原真菌具有较强拮抗作用；可以在小麦、玉米、辣椒和杨树等植物根际稳定定殖；能够显著提高酸性土壤的pH值并促进作物生长。利用该菌株制备的菌剂可应用于改善酸性土壤小麦、玉米、辣椒、杨树等植物的生长及真菌病害的防治，具有提高酸性土壤pH值及防病促生作用；菌剂的制备工艺简单、发酵周期短、成本低，利于工业化生产和运输。

Description

一株可提高酸性土壤pH值的拮抗细菌及其菌剂的制备和应用

技术领域

本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及一株可提高酸性土壤pH值的拮抗细菌及其菌剂的制备和应用。

背景技术

由于土壤溶液中H⁺和OH^-离子不平衡使土壤pH值小于6.5的土壤称为酸性土壤。酸性土壤主要分布在全球寒带以外的大多数地区，其自然成因与气候关系非常密切。由于土壤中质子参与了几乎所有化学反应循环，土壤酸化会导致质子平衡被打破，从而影响土壤元素形态的转变。一般而言，大多数作物适宜种植的土壤酸碱度在微酸性到中性范围之间。虽然不同作物对土壤酸碱度的耐受性不同，但土壤酸化依然显著影响着植物根系的正常生长和发育。土壤低pH值危害主要通过影响土壤理化性质和微生物活动而影响植物正常生长发育

土壤酸化的治理措施主要有控制酸雨、生物改良、农业措施、使用土壤改良剂等方式。其中，使用土壤改良剂包括：施用石灰石改良剂、矿物和工业废弃物、微生物肥料、生物质炭、有机物料等。

微生物肥料通过所含微生物的生命活动，提高作物养分的供应、促进作物生长发育，增加作物产量，且成本低、肥效高、无污染、对环境友好，可有效替代化学肥料，是经济环保的酸性土壤改良方式，符合国家倡导的大力发展生态农业、绿色农业的要求和人们追求绿色、无公害食品的意愿。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌IV-4。该解淀粉芽孢杆菌IV-4可用于酸性土壤的改良和小麦等作物真菌病害的防治。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明提供的解淀粉芽孢杆菌IV-4，该菌株已于2019年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：CGMCC NO.18619。

所述解淀粉芽孢杆菌IV-4的菌体形态与菌落特征为：

在PDA平板上的菌落呈乳白色，圆形半透明，边缘整齐，表面干燥，菌落中间稍微凸起，显微镜下观察的菌体形态呈杆状。

所述解淀粉芽孢杆菌IV-4的生理生化特征为：

该菌株需氧性为兼性厌氧，革兰氏反应、葡萄糖氧化发酵试验、接触酶反应、淀粉水解试验、甲基红试验、耐盐性试验、苯丙氨基酸脱氨酶试验、硝酸盐还原和柠檬酸盐利用等呈阳性；V-P试验呈阴性；可在NaCl浓度为2％和5％的LB液体培养基中生长。

所述解淀粉芽孢杆菌IV-4的分子生物学特征为：

该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，gyrB序列如SEQ ID NO.2所示。

该菌株具有较广的抗菌谱，对引起小麦、玉米、蔬菜和林果真菌病害的尖孢镰刀菌、小麦根腐平脐蠕孢、禾谷镰刀菌、胶胞炭疽菌、链格孢菌和杨树溃疡病菌等病原菌具有较强的抑制效果；能够在酸性土壤中的小麦、玉米、辣椒和杨树等植物根际稳定定殖；能够显著提高酸性土壤的pH值并促进植物生长。

含有所述解淀粉芽孢杆菌IV-4的菌剂也属于本发明的保护范围。

所述菌剂中，解淀粉芽孢杆菌IV-4可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液的形式存在。

所述菌剂的剂型可以为液体菌剂或固体菌剂。

进一步的，本发明还提供一种微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

将解淀粉芽孢杆菌IV-4的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养条件为：转速120r/min，温度32℃，发酵罐压强0.05～0.06MPa，培养20～24h，得到解淀粉芽孢杆菌IV-4发酵液；

所述发酵培养基的组成为：葡萄糖5.0g，蛋白胨10.5g，酵母粉10.5g，NaCl 15.0g，CaCl₂ 0.3g，水1.0L。

优选的，所述解淀粉芽孢杆菌IV-4的种子液的接种量为8％～12％(体积比)。

优选的，解淀粉芽孢杆菌IV-4的种子液的制备包括：菌种活化、一级种子液制备和二级种子液制备的步骤；其中：

所述菌种活化为：将低温保存的解淀粉芽孢杆菌IV-4于LB固体培养基平板上划线， 32℃培养24～36h；挑取IV-4菌株单菌落再次划线转接于LB固体培养基平板上，32℃培养 16～24h，备用。

所述一级种子液制备为：取活化后的IV-4菌株菌苔，接种于LB液体培养基中，32℃， 200～220r/min，摇瓶培养8～10h得到一级种子液。

所述二级种子液制备为：将一级种子液按体积百分比为1％～2％接种到二级种子培养基中进行发酵培养，发酵培养条件为：转速120r/min，温度32℃,发酵罐压强0.05～0.06MPa，培养8～10h，作为二级种子液；

所述二级种子培养基配方为：葡萄糖5.0g、蛋白胨10.5g、酵母粉10.5g、NaCl15.0g、 CaCl₂ 0.3g、水1.0L。

上述制备方法中，所制备的解淀粉芽孢杆菌IV-4发酵液可以直接作为液体菌剂使用；进一步的，还可以将上述液体菌剂制备成固体菌剂，其制备方法为：

将解淀粉芽孢杆菌IV-4发酵液按6000～8000r/min离心20～30min，收集沉淀物；向沉淀物中加入硅藻土或玉米粉作为载体基质，所述载体基质的加入量为解淀粉芽孢杆菌IV-4 发酵液重量的6％～8％，搅拌均匀后进行喷雾干燥，即制备得到解淀粉芽孢杆菌IV-4的固体菌剂。

上述制备的微生物菌剂的使用方法为：将液体菌剂按照2～4L/亩的用量，使用时加适量水稀释后灌根使用；固体菌剂的使用按照1～2kg/亩的用量，拌种或加适量水稀释后灌根施用；两种菌剂可以作为生物有机肥、复合微生物肥料的菌种使用。

上述解淀粉芽孢杆菌IV-4或含有解淀粉芽孢杆菌IV-4的菌剂在下述1)-4)至少一项中的用途也属于本发明的保护范围；

1)提高酸性土壤的pH，改良酸性土壤；

2)促进植物在酸性土壤条件下生长；

3)制备酸性土壤改良剂；

4)制备广谱抑菌剂。

优选的，所述广谱抑菌剂对尖孢镰刀菌、小麦根腐平脐蠕孢、禾谷镰刀菌、胶胞炭疽菌、链格孢菌和杨树溃疡病菌均具有较强抑制效果。

本发明的有益效果：

(1)IV-4菌株能够在酸性土壤中稳定定殖，能够显著提高土壤的pH值，能够有效改善植物根际微生物群落结构，改良土壤环境，促进植物生长。

(2)IV-4菌株具有较广的抗菌谱，利用IV-4菌株制备的菌剂可有效防治尖孢镰刀菌、小麦根腐平脐蠕孢、禾谷镰刀菌、胶胞炭疽菌、链格孢菌和杨树溃疡病菌等引起的小麦、玉米、蔬菜和林果真菌病害。

(3)IV-4菌株发酵性状好，菌剂生产工艺简单、生产周期短，原料成本低，有利于工业化生产、运输。

附图说明

图1：根据IV-4菌株的16S rDNA序列，利用Mega 5.0软件中Alignment Explorer程序进行多序列同源性分析构建的系统进化树。

图2：根据IV-4菌株的gyrB序列，利用Mega 5.0分析构建的系统进化树。

图3：IV-4菌株的抑菌谱；图中，A：对杨树溃疡菌的拮抗作用；B：对禾谷镰刀菌的拮抗作用；C：对尖孢镰刀菌的拮抗作用；D：对小麦根腐平脐蠕孢菌的拮抗作用；E：对链格孢菌的拮抗作用；F：对胶胞炭疽菌的拮抗作用。

图4：IV-4菌株的生长曲线图。

图5：通过实时荧光定量PCR技术动态监测尖胞镰刀菌的定量PCR标准曲线。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

本发明实施例中所用到的培养基的组成如下：

LB液体培养基：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1.0L。

LB固体培养基：酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，琼脂16.0g，蒸馏水1.0L。

PDA培养基：马铃薯200.0g，牛肉膏5.0g，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g，(NH₄)₂SO₄1.0g， MgSO₄ 1.0g，KH₂PO₄ 0.6g，CaCO₃ 3.0g，pH 6.8～7.2，水1.0L。

二级种子培养基：葡萄糖5.0g、蛋白胨10.5g、酵母粉10.5g、NaCl 15.0g、CaCl₂0.3g、水1.0L。

发酵培养基：葡萄糖5.0g、蛋白胨10.5g、酵母粉10.5g、NaCl 15.0g、CaCl₂ 0.3g、水 1.0L。

实施例1：菌株的分离与筛选

采集山东省泰安市泰山林地土样，无菌条件下取土样10g，溶于90mL无菌蒸馏水中， 220r/min，振荡培养30min，吸取1mL与9mL无菌水混匀，即得10^-1的稀释液，再取1mL 10^-1的稀释液与9mL无菌水混匀，即得10^-2的稀释液，依稀类推，制备10^-3，10^-4，10^-5， 10^-6，10^-7等一系列稀释液。选用的稀释度为10^-5、10^-6、10^-7的土壤稀释液，分别吸取100uL 涂布于PDA培养基中，30～32℃恒温培养1～3d。挑取单菌落，划线成纯培养物。无菌条件下刮取两环纯培养物接种到LB液体培养基中，30℃下200r/min，震荡培养8～10h，以2％(体积百分比)的接种量接种到LB液体培养基中；空白对照为在LB液体培养基中接入等量的无菌水，每个处理三个重复，30℃，200r/min，摇瓶培养48h，用精密pH试纸测定发酵液pH值，初筛获得pH值达到8以上的纯培养物。对初筛获得的纯培养物再按照上述培养方法摇瓶培养48h，用pH计精准测量发酵液pH值进行复筛，获得发酵液pH 值8.5以上的纯培养物。

将上述获得的纯培养物，以尖孢镰刀菌、小麦根腐平脐蠕孢为靶标病原菌，通过平板对峙试验，进一步筛选对靶标病原菌具有较强拮抗效果的纯培养物。最终获得发酵液pH值8.72，而且对尖孢镰刀菌、小麦根腐平脐蠕孢具有较强拮抗作用的IV-4菌株。

实施例2：IV-4菌株的鉴定

(1)菌体形态与菌落特征

IV-4菌株在PDA平板上的菌落呈乳白色，圆形半透明，边缘整齐，表面干燥，菌落中间稍微凸起，显微镜下观察的菌体形态呈杆状，革兰氏阳性菌。

(2)生理生化特征

IV-4菌株的生理生化特征见表1。该菌株需氧性为兼性厌氧，革兰氏反应、葡萄糖氧化发酵试验、接触酶反应、淀粉水解试验、甲基红试验、耐盐性试验、苯丙氨基酸脱氨酶试验、硝酸盐还原和柠檬酸盐利用等呈阳性；V-P试验呈阴性；可在NaCl浓度为2％和5％的LB液体培养基中生长。

表1：IV-4菌株的生理生化特征

注：+为阳性；－为阴性。

(3)菌株16S rDNA序列分析

IV-4菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示；将此序列与Genbank数据库中序列进行Blast分析比对，发现与其同源性较高的菌株均属于芽孢杆菌属，选取7株与IV-4菌株序列相似性较高的菌株进行系统发育分析，利用Mega 5.0软件中Alignment Explorer程序进行多序列同源性分析构建的系统进化树(图1)。IV-4菌株的16S rDNA序列同公开发表的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens，JF899253)的16S rDNA同源性达到99％，结合 IV-4菌株的菌体形态、菌落特征及生理生化特征，鉴定IV-4菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

(4)IV-4菌株gyrB序列分析

IV-4菌株的gyrB序列序列如SEQ ID NO.2所示；将此序列与Genbank数据库中序列进行Blast分析比对，发现与其同源性较高的菌株均属于芽孢杆菌属，选取11株与IV-4 菌株序列相似性较高的菌株进行系统发育分析，利用Mega 5.0软件，采取Neighbor-Joining法构建以gyrB全序列为基础的系统进化树(图2)。IV-4菌株的gyrB序列同公开发表的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens，CP004065)的16S rDNA的同源性达到95％，结合其菌体形态、菌落特征和生理生化特征，鉴定IV-4菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

基于上述对菌株的形态学鉴定和分子生物学鉴定结果，将分离得到的IV-4菌株鉴定为芽孢杆菌Bacillus sp.具体为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)IV-4。并对该菌株进行生物保藏，保藏信息如下：

菌种名称：解淀粉芽孢杆菌

拉丁名：Bacillus amyloliquefaciens

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2019年9月26日

保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.18619。

实施例3：IV-4菌株的抑菌谱测定

用接种环挑取一环纯化的IV-4菌体，点在距离PDA平板中央两端3cm处，以尖孢镰刀菌、小麦根腐平脐蠕孢、禾谷镰刀菌、胶胞炭疽菌、链格孢菌和杨树溃疡病菌为靶标，用打孔器切下直径为5mm的菌饼接种于PDA平板中央，28℃培养2～3天，IV-4菌株的抑菌谱见图3。

试验结果表明IV-4菌株对尖孢镰刀菌、小麦根腐平脐蠕孢、禾谷镰刀菌、胶胞炭疽菌、链格孢菌和杨树溃疡病菌均有较好的拮抗效果。

实施例4：IV-4菌株定殖能力测定

(1)IV-4菌株双抗生素突变菌株的筛选及稳定性检测

刮取2环活化的IV-4菌株菌苔于不含利福平的LB液体培养基中，32℃培养至对数生长期，将培养液以2％(体积比)的接种量接种到利福平浓度为0.5μg/mL的LB液体培养基中，培养8～24h，将该培养液以2％(体积比)的接种量接种到利福平浓度为1μg/mL 的LB液体培养基中，培养24h，依次类推，使利福平的浓度逐渐由0.5μg/mL、1μg/mL、 5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL 直至增加到300μg/mL，培养得到抗利福平的菌株。将得到的抗利福平菌株接种到含300 μg/mL利福平和5μg/mL壮观霉素(Spe)的LB液体培养基中，对同时抗利福平和壮观霉素的双抗菌株进行筛选，筛选过程中，LB液体培养基中利福平的浓度为300μg/mL，壮观霉素浓度的递加及筛选方法与抗利福平菌株的筛选方法相同，最终获得同时抗利福平和壮观霉素的初始双抗标记菌株。

将筛选的双抗标记菌株在不含利福平和壮观霉素的LB固体培养基和LB液体培养基中，交替培养3-5代，再分别回接到含利福平300μg/mL和壮观霉素300μg/mL的LB液体培养基中进行培养，以证实XH-9菌株耐药稳定性，最终获得能够稳定遗传并且同时抗利福平和壮观霉素的双抗标记菌株。

(2)IV-4菌株在小麦、玉米、辣椒、杨树根际的定殖能力测定

将上述试验得到的IV-4双抗生素突变菌株接种到不含抗生素的LB液体培养基中，28℃摇瓶培养12h。取1mL培养液转接到含利福平(300μg/mL)和壮观霉素(300μg/mL) 的LB液体培养基中，28℃摇瓶培养12h，取1mL培养液转接到不含抗生素的LB液体培养基中，培养48h获得双抗标记菌株菌液，将菌液离心去上清后制成菌悬液，调整菌体浓度为1×10⁸CFU/mL。

定殖试验采用盆栽，土壤为pH值4.70的酸性土壤，小麦、玉米、辣椒苗为株高10cm左右的种子播种苗，杨树为当年扦插成活小苗。接种双抗标记菌株菌液的第10天、20天、 30天、40天，回收根际土，检测IV-4菌株在小麦、玉米、辣椒、杨树根际的定殖情况。试验结果表明，接种IV-4菌株处理第40天，小麦、玉米、辣椒、杨树根际土中，IV-4菌株的菌体数量分别为2.4×10⁵CFU/g干土、3.8×10⁴CFU/g干土、6.3×10⁵CFU/g干土和 2.8×10⁵CFU/g干土，说明IV-4菌株能够在上述植物根际稳定定殖。试验结果见表2。

表2：IV-4菌株在小麦、玉米、辣椒、杨树根际的定殖结果(CFU/g干土)

实施例7：IV-4菌株产芽孢发酵培养基配方优化

(1)种龄的确定

取活化后的IV-4菌株菌苔，接种于LB液体培养基中，32℃，200～220r/min，摇瓶培养8～10h，将培养液以2％(体积比)的接种量接入装有50mL LB种子液培养基的250mL 三角瓶中，共45瓶，32℃、200r/min震荡培养，每隔1小时，取3瓶测定瓶中培养液在 600nm波长处的OD值，连续测定15小时。根据测得的OD值，以算数平均值绘制菌株的生长曲线图(图4)。由图4可知，IV-4菌株的对数生长期为3～9h，10h后为稳定期，因此，确定种子液发酵时间为8h。

(2)基础发酵培养基的筛选

将查阅文献获得的15个解淀粉芽孢杆菌发酵配方作为IV-4菌株的基础试供培养基，在芽孢率达到90％以上时，以梯度稀释涂布法对各发酵培养基进行菌体计数，综合菌体数量和产孢时间两个指标，发酵效果最好的配方为13号配方，发酵时间42h，芽孢率90％以上，菌体数量为3.2×10⁹cfu/mL。因此，选择13号培养基为IV-4菌株的基础发酵培养基，培养基成分为蛋白胨7.0g、酵母粉7.0g、NaCl 10.0g、CaCl₂ 0.2g、葡萄糖10.0g、水1.0L。试验结果见表3。

15个基础培养基组分：

1号培养基：黄豆饼粉15.0g、麸皮10.0g、葡萄糖3.5g、酵母粉5.0g、NaCl 0.5g、水1.0L。

2号培养基：蔗糖2.5g、黄豆饼粉15.0g、MgCl₂ 0.1g、硫酸锰0.1g、水1.0L。

3号培养基：葡萄糖0.5g、玉米粉3.0g、黄豆饼粉3.0g、硫酸锰2.0g、磷酸氢二钾3.0g、磷酸二氢钾1.5g、水1.0L。

4号培养基：麸皮10.0g、黄豆饼粉15.0g、NaCl 5.0g、K₂HPO₄ 4.0g、MnSO₄ 0.03g、水1.0L。

5号培养基：胰蛋白胨10.0g、酵母粉10.0g、葡萄糖5.0g、磷酸二氢钾2.0g、MnSO₄·7H₂O 1.0g、氯化钾13.0g、水1.0L。

6号培养基：酵母浸粉5.0g、胰蛋白胨12.0g、氯化钾13.0g、水1.0L。

7号培养基：酵母浸粉5.0g、尿素2.0.g、玉米浆5.0g、葡萄糖10.0g、水1.0L。

8号培养基：乙酸钠5.0g、硫酸铵0.5g、K₂HPO₄ 0.4g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、酵母粉1.0g、碳酸钙5.0g、水1.0L。

9号培养基：葡萄糖10.0g、黄豆饼粉20.0g、蛋白胨10.0g、酵母粉10.0g、CaCO₃5.0g、水1.0L。

10号培养基：葡萄糖15.0、可溶性淀粉30.0g、蛋白胨15.0g、MgSO₄·7H₂O 0.8g、磷酸二氢钾3.2g、水1.0L。

11号培养基：葡萄糖15.0g、可溶性淀粉30.0g、蛋白胨15.0g、MgSO₄·7H₂O 1.0g、K₂HPO₄ 3.0g、水1.0L。

12号培养基：酵母粉5.0g、蛋白胨20.0.g、葡萄糖20.0g、MgSO₄·7H₂O 1.0g、水1.0L。

13号培养基：蛋白胨7.0g、酵母粉7.0g、NaCl 10.0g、CaCl₂ 0.2g、葡萄糖10.0g、水1.0L。

14号培养基：蛋白胨7.0g、酵母粉7.0g、NaCl 10.0g、CaCl₂ 0.2g、葡萄糖15.0g、水1.0L。

15号培养基:蛋白胨7.0g、酵母粉7.0g、NaCl 10.0g、CaCl₂ 0.2g、葡萄糖20.0g、水1.0L。

表3：培养基初筛结果

(3)发酵培养基组分优化正交试验

对基础培养基进行筛选后，采用L₁₈(3⁵)以13号培养基配方为基础，对发酵配方进行正交设计试验，设置5因素3水平的正交试验，共有18次试验，每个试验设置3次重复，正交试验各因素水平设置如表4。

表4：IV-4菌株发酵培养基配方优化正交试验的因素与水平设计

IV-4菌株发酵培养基的正交试验结果见表5，结果表明，3号配方发酵效果最好：葡萄糖5.0g、蛋白胨10.5g、酵母粉10.5g、NaCl 15.0g、CaCl₂ 0.3g、水1.0L。发酵液菌体数量达到4.23×10⁹cfu/mL。

表5：IV-4菌株发酵培养基配方优化的正交试验结果

注：表中菌体数量一栏中的小写字母代表的是数据差异显著性检验的符号。

实施例8：IV-4菌剂的制备

(1)菌种活化：将低温保存的IV-4菌种划线接种于LB固体培养基平板上，32℃培养24h；挑取单菌落再次划线转接于LB固体培养基平板上，32℃培养24h。

(2)一级种子液制备：刮取两环步骤(1)活化好的IV-4菌株菌苔，接种于LB液体培养基中，32℃，200r/min，摇瓶培养8～10h，得到一级种子液。

(3)二级种子液制备：将一级种子液按照2％(体积比)的比例接种到装有二级种子培养基的发酵罐中发酵培养；转速120r/min，温度32℃，灌压0.05-0.06MPa，培养8～10h，得到二级种子液。

(4)发酵液培养：将二级种子液按照10％(体积比)的比例接入装有发酵培养基的发酵罐中发酵培养；转速120r/min，温度32℃，灌压0.05-0.06MPa，培养时间24h，得到 IV-4菌株液体菌剂。

(5)固体菌剂制备：将步骤(4)获得的IV-4菌株液体菌剂7000r/min离心25min，去除离心上清液，向沉淀物中缓慢加入硅藻土或玉米粉作为载体基质，加入硅藻土或玉米粉的量为IV-4菌株液体菌剂重量的6％，搅拌均匀后喷雾干燥，得到IV-4菌株固体菌剂。

(6)菌剂的使用方法：将所述IV-4菌株液体菌剂按照2～4L/亩的用量，使用时加适量水稀释后灌根使用；固体菌剂的使用按照1～2kg/亩的用量，拌种或加适量水稀释后灌根施用；两种菌剂可以作为生物有机肥、复合微生物肥料、微生物菌剂的菌种使用。

实施例9：IV-4菌剂的应用

(1)盆栽试验1：IV-4菌剂对小麦根际尖孢镰刀菌的拮抗作用。

本试验以小麦为材料，用清水将小麦种子冲洗2次，再用清水浸泡10h，将大小以及形状均匀一致的小麦种子播种到内径24cm的塑料盆中，15粒/盆，共栽植40盆，试验选用pH值为5.65的酸性土壤。待小麦幼苗长至10cm，施加IV-4液体菌剂，同时设置加灭活IV-4液体菌剂的空白对照。

本试验选用的病原真菌为尖胞镰刀菌。尖孢镰刀菌孢子悬浮液的孢子浓度为5.25× 10⁵cfu/mL。

本试验共设计2组处理。处理组：加尖胞镰刀菌孢子悬浮液和IV-4液体菌剂各40mL；对照组：加尖胞镰刀菌孢子悬浮液和灭活IV-4液体菌剂各40mL。加菌后每隔10天取小麦根际土样，提取土壤总DNA，通过实时荧光定量PCR对土壤中尖胞镰刀菌数量进行监测，试验结果见表6，检测尖胞镰刀菌数量的qRT-PCR标准曲线见图5。

表6：实时荧光定量PCR-尖胞镰刀菌数量监测结果

注：表中数据为3次重复的平均值±标准误差。

试验结果表明，试验的10d、20d、30d、40d、50d，处理组小麦根际尖孢镰刀菌的数量显著低于对照组，两者之间存在显著差异(p<0.05)。说明IV-4菌株在小麦根际的定殖能够显著降低根际土中尖孢镰刀菌的数量。

(2)盆栽试验2：IV-4菌剂对小麦生长发育及根际土壤pH值的影响

小麦种子的处理与播种同盆栽试验1，试验选用pH值为5.65的酸性土壤。待小麦幼苗长至10cm，每盆保留长势一致的小麦幼苗10棵，施加IV-4液体菌剂，同时设置施加灭活IV-4菌剂的空白对照。小麦幼苗长至60d时，将处理组和对照组的小麦幼苗整盆取出，分别随机选取30棵小麦幼苗，收集小麦根际土样，测定根际土样的pH值。测定小麦干鲜重等生长量指标。试验结果见表7。

表7：IV-4菌剂对小麦根际土壤pH值及幼苗生长的影响

注：表中数据为3次重复的平均值±标准误差。同列中数据后缀字母不同表示不同处理组之间存在显著差异(p<0.05)，字母相同则表示不同处理组之间差异不显著。

试验结果表明，施加IV-4菌剂的处理组小麦根际土壤pH值为6.16，对照组土壤pH值为5.85，表明施加IV-4菌剂可显著提高小麦根际土壤的pH值；施加IV-4菌剂的处理组与施加灭活IV-4菌剂的对照组相比，小麦平均株高增加8.67％，平均根长增加15.48％，单株鲜重增加20.69％，单株干重增加17.86％。说明IV-4菌剂能够显著促进小麦生长发育并提高其根际土壤的pH值。

以上所述仅为本申请的优选实施例，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一株可提高酸性土壤pH值的拮抗细菌及其菌剂的制备和应用

<130> 2020

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1453

<212> DNA

<213> IV-4菌株的16S rDNA

<400> 1

cggggcgggc gtgctataca tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt 60

tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg 120

gaaaccgggg ctaataccgg atggttgtct gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc 180

ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240

accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300

cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360

cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa 420

gaacaagtgc cgttcaaata gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct 480

aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 540

cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg 600

agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag 660

cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta 720

actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac 780

gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg 840

cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg 900

ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 960

gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag 1020

gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080

gcaacccttg atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac 1140

aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac 1200

acgtgctaca atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa 1260

atctgttctc agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt 1320

aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380

caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac ctttatggag ccagccgccg 1440

aaggtgaaca aag 1453

<210> 2

<211> 700

<212> DNA

<213> IV-4菌株的gyrB

<400> 2

gggtagggct cggattattg tttcagcaac gtcatacgga cagattccgc cctccgccgc 60

tgtctggatc ggcgctgtct ccatcacgat ttatgtgatg atttcaggaa tccacggttc 120

agcgtggata tccgtcgtca aagatatcat gattttaggc atcgtcctgt atttaggtat 180

ttatctgccc attcattatt acggcgggtt tacggagatg ttcaaacaaa ttgacgccgc 240

aaaacccggt tttctcacgc tgccggaaac cggacagagc gtttcctggt tcagctcaac 300

ggttttgctg accgccctcg gcttttatat gtggcctcat acctttgccg cttcctattc 360

ggcggagcat ccgcgggtgt ttcggaaaaa cgcgatcatc atgcctcttt atcagctcgt 420

cctgctgttt gtcatcttta ccggatttgc ggcgattctg caggtgcccg gtttaaaagg 480

ggcggacacg gatctcgcct tattaaagct gtctgtgaaa acctttgatc cctggtttgt 540

cgggctgatc ggatcggcgg gcatcctgac ggcgcttgta cccggttcaa tgatattaat 600

ggcctcaagc acgctgttcg ccaaaaatgt gtacaaagcc attctgcccg gcacgactga 660

cgaaaaagtc tcacggctcg cacatcgtac ccctggctaa 700

Claims (7)

1.一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）IV-4，其生物保藏号为：CGMCCNO.18619。

2.含有权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）IV-4的菌剂。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中还包括辅料和/或载体。

4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的剂型为液体菌剂或固体菌剂。

5.一种微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将生物保藏号为CGMCC NO.18619的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）IV-4的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养条件为：转速120r/min，温度32℃，发酵罐压强0.05～0.06MPa，培养20～24h，得到解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）IV-4发酵液；

所述发酵培养基的组成为：葡萄糖5.0g，蛋白胨10.5g，酵母粉10.5g，NaCl 15.0g，CaCl₂ 0.3g，水1.0L；

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）IV-4的种子液的制备包括：菌种活化、一级种子液制备和二级种子液制备的步骤；

所述菌种活化为：将低温保存的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）IV-4于LB固体培养基平板上划线， 32℃培养24～36h；挑取IV-4菌株单菌落再次划线转接于LB固体培养基平板上，32℃培养16～24h，备用；

所述一级种子液制备为：取活化后的IV-4菌株菌苔，接种于LB液体培养基中， 32℃，200～220r/min，摇瓶培养8～10h得到一级种子液；

所述二级种子液制备为：将一级种子液按体积百分比为1%～2%接种到二级种子培养基中进行发酵培养，发酵培养条件为：转速120r/min，温度32℃,发酵罐压强0.05～0.06MPa，培养8～10h，作为二级种子液；

所述二级种子培养基配方为：葡萄糖5.0g、蛋白胨10.5g、酵母粉10.5g、NaCl 15.0g、CaCl₂ 0.3g、水1.0L。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）IV-4的种子液的接种量为8%～12%。

7.权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）IV-4或权利要求2-4任一项所述的菌剂在下述1）-3）至少一项中的用途：

1）提高酸性土壤的pH，改良酸性土壤；

2）促进作物在酸性土壤条件下生长；

3）制备酸性土壤改良剂。

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