CN107164279A

CN107164279A - 一种促进农作物生长的复合菌剂及其应用

Info

Publication number: CN107164279A
Application number: CN201710495552.8A
Authority: CN
Inventors: 申鸿; 夏庆友; 杨星勇; 李艳梅
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2017-06-26
Filing date: 2017-06-26
Publication date: 2017-09-15
Anticipated expiration: 2037-06-26
Also published as: CN107164279B

Abstract

本发明涉及一种促进农作物生长的复合菌剂及其应用，属于农业微生物技术领域，该复合菌剂由以下菌株组成：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)RP01，保藏编号为CGMCC NO：13472、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)JK02，保藏编号为CGMCC NO：13473和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GN03，保藏编号为CGMCC NO：13474。该复合菌剂可被用于改善酸性土壤中农作物根际土壤微生物群落结构、转化农作物根际土壤中有机质、提高农作物抗病性和抗性，促进农作物根际土壤中无机磷溶解，最终达到对农作物的促生作用，提高农作物的经济价值。

Description

一种促进农作物生长的复合菌剂及其应用

技术领域

本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种促进农作物生长的复合菌剂及其应用。

背景技术

微生物与农业如土壤肥力、作物根际微生态环境关系密切，各类微生态制剂的研究与应用技术不断被报道，植物促生菌(PGPR)菌肥就是其中之一。PGPR是自由生活的土壤细菌，能促进矿物质的溶解，有助于增强宿主植物的抗性、对养分的吸收，从而增强植物的生长和产量的影响(周晓鸿，等2012；Bhattacharyya，2012；Kumar，2014；Nonaka，2014；Tailor，2014；Turan，2014；Majeed.2015)。其作用主要为：(1)分泌植物促生物质如吲哚乙酸、细胞分裂素和赤霉素等；(2)改善植物根际营养状况如促进生物固氮作用、促进无机或有机磷的溶解、以及其他营养物质的矿化等；(3)增强宿主植物对病害的生物防控作用。随着二十世纪后期世界农业生产对生物肥料应用的日益重视，我国也开展了将植物促生菌广泛应用在水稻、小麦、玉米、大豆、马铃薯、番茄等主要农作物上(林启美，等2002；周相娟，等2007；吴皓琼，等2011；孙建光，等2012；邓振山，等2012；高君君，等2012)，以及樱桃(吕德国，等2008)、猕猴桃(Hong，2016)等果树上的应用研究。

土壤微生物群落的多样性决定了土壤微生态系统功能的多样性。接种外源微生物肥料的有效性长期以来一直是学术界的热点争议问题，这主要归因于外源促生菌自身无法与土著优势微生物种群进行竞争而导致定殖能力低下、遗传性状不稳定等缺陷(杜晓燕，2008)。紫色土是中国典型的土壤类型，又是沉积岩石中“红层”的主要类型，广泛覆盖于中国四川盆地(何毓蓉，等2003)。在紫色土中单一接种PGPR对植物的促生效应等已有研究，如固氮菌(李春明，等2003；韩光，等2011)、硅酸盐细菌(贺积强，等2003)等。然而，绝大多数都是基于对土壤或基质进行灭菌后研究PGPR对于植物的促生效应。

因此，为了充分发挥我国南方酸性土壤的生产潜力，急需筛选出具土著竞争优势的PGPR微生物菌株，利用其优异的定殖能力和高效的促生效应，以制备农作物促生菌剂。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于：(1)提供一种促进农作物生长的复合菌剂；(2)提供一种促进农作物生长的复合菌剂在改善农作物根际土壤微生物群落结构中的应用；(3)提供一种促进农作物生长的复合菌剂在改善农作物根际土壤中有效养分中的应用；(4)提供一种促进农作物生长的复合菌剂在提高农作物抗病性中的应用；(5)提供一种促进农作物生长的复合菌剂在增强农作物抗性中的应用；(6)提供一种包含促进农作物生长的复合菌剂的农作物菌肥；(7)提供一种包含促进农作物生长的复合菌剂的农作物菌肥的制备方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种促进农作物生长的复合菌剂，所述复合菌剂由以下菌株组成：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)RP01，保藏编号为CGMCC NO：13472、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)JK02，保藏编号为CGMCC NO：13473和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)GN03，保藏编号为CGMCC NO：13474。

进一步，所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)RP01、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)JK02和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GN03的菌体数量之比为1:1:1。

进一步，所述农作物为二级生姜脱毒种苗。

2、所述的一种促进农作物生长的复合菌剂在改善农作物根际土壤微生物群落结构中的应用。

3、所述的一种促进农作物生长的复合菌剂在改善农作物根际土壤中有效养分中的应用。

4、所述的一种促进农作物生长的复合菌剂在提高农作物抗病性中的应用。

5、所述的一种促进农作物生长的复合菌剂在增强农作物抗性中的应用。

6、包含所述的一种促进农作物生长的复合菌剂的农作物菌肥。

7、所述的农作物菌肥的制备方法，其特征在于，所述方法具体为：将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)RP01、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)JK02和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GN03的按菌体数量之比为1:1:1混合后，与未经灭菌处理的风干牛粪拌匀，制得农作物菌肥，所述农作物菌肥中菌浓度为3×10⁵CFU/g。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种促进农作物生长的复合菌剂，将所述复合菌剂用于未经灭菌处理紫色土中，该复合菌剂中各菌种与土著优势微生物种群竞争后，能够优异的定殖能力和稳定的遗传性状，将该复合菌剂制作成菌肥用于种植在未经灭菌处理紫色土中的二级生姜脱毒种苗，结果显示：(1)该菌肥能够显著影响二级生姜脱毒幼苗根际土壤微生物区系的数量，从而改善生姜幼苗根际土壤微生物群落结构；(2)该菌肥能够通过转化土壤中的有机质实现对幼苗的促生效应，与CK组相比，使用该菌肥的二级生姜脱毒幼苗的分蘖数、叶片数分别提高了133.3％和111.8％，用于繁育的球茎(地下部)生物量提高了500.0％；与BF-CM组相比，MI-CM组中分蘖数、叶面积、地上部和地下部干重分别提高了40.0％、45.9％、28.6％和25％(3)该菌肥可以提高生姜叶片中多酚氧化酶的活性，从而提高生姜幼苗的防御活性；(4)该菌肥可以降低生姜叶片中丙二醛，从而增强该幼苗的抗性；(5)该菌肥显著改善了生姜幼苗根系土壤的植物营养状况量，与CK组相比，碱解氮、速效磷、速效钾的含量分别提高了50.2％、107.3％和24.5％，与BF-CM组相比，MI-CM组中全磷、速效磷和速效钾含量显著提高了15.15％、91.08％和22.97％，从而有效改善土壤养分状况。

生物材料保藏

短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)RP01于2016年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO：13472；

环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)JK02于2016年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO：13473；

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GN03于2016年12月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO：13474。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为显微镜(1600倍)下RP01、JK02和GN03经染色后的形貌图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

一、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)RP01、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)JK02和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GN03三种的筛选

1、材料准备

(1)供试土壤

土壤采集自重庆市北碚区在西南大学国家紫色土肥力与肥料效应监测基地的轮作蔬菜(莴苣-辣椒-大豆-小白菜)中，样地为种植蔬菜十年以上，且蔬菜产量和质量都较高的种植区。选择3块1×1m范围土壤，按5点采样法随机收集10-20cm土壤，将土样混合均匀后，置于冰桶内，带回实验室于4℃冰箱保存备用。土壤基本理化性质见表1。

表1供试土壤基本理化性质

(2)配置培养基

自身固氮菌选择培养基：CaSO₃ 0.2g；KH₂PO₄ 0.2g；NaCl 0.2g；CaCO₃ 5.0g；MgSO₄·7H₂O0.2g；葡萄糖5.0g；琼脂15g；去离子水1L；pH 7.0；

溶磷菌选择培养基：NaCl 0.2g；MgSO₄·7H₂O 0.1g；MnSO₄·4H₂O 0.03g；KCl0.3g；(NH₄)₂SO₄ 0.5g；FeSO₄·7H₂O 0.003g；Ca₃(PO₄)₂ 3.0g；葡萄糖10g；琼脂15g；去离子水1L；pH 7.0；

解钾菌选择培养基：MgSO₄·7H₂O 0.5g；(NH₄)₂SO₄ 1.0g；Na₂HPO₄ 2.0g；CaCO₃1.0g；钾长石粉1.0g；蔗糖10.0g；酵母粉0.5g；琼脂15g；去离子水1L；pH 7.0；

LB培养基：NaCl 10g；酵母粉5g；胰蛋白胨10g；琼脂15g；去离子水1L；pH 7.0。

2、菌株分离、纯化

称取10g上述供试土壤悬溶于90mL无菌水中，28℃、120r/min振荡2h，选择稀释梯度分别为10^-4、10^-5、10^-6和10^-7，分别取100μl涂于自身固氮菌、溶磷菌和解钾菌选择培养基上，28℃下培养3-5d。挑取生长速度快或周围有透明圈的菌株，使用划线法于对应的各选择培养基分离纯化，直至纯培养后分别转接至LB培养基中斜面培养，获得三种菌种，并于-80℃下保存，并将以溶磷菌选择培养基筛选出的菌种标记为RP01，以解钾菌选择培养基筛选出的菌种标记为JK02，以自身固氮菌选择培养基筛选出的菌种标记为GN03。

二、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)RP01、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)JK02和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GN03三种的鉴定

1、形态学鉴定

(1)RP01形态学鉴定

将上述保藏菌种RP01经溶磷菌选择培养基活化后，观察其菌落形态特征，经观察可知，菌种在溶磷菌选择培养基上能形成明显的溶磷圈，菌落表面湿润透明，难以挑起，边缘整齐，培养1-2d后，菌落直径2-3mm，培养3-5d后，菌落直径5-6mm。挑取菌种进行革兰氏染色、荚膜染色和芽孢染色后于显微镜(1600倍)下观察菌体形态，如图1中A所示，革兰氏染色菌体为阳性，孢子呈椭圆型，孢子囊未见膨胀，生长位置为中生，荚膜肥厚。

(2)JK02形态学鉴定

将上述保藏菌种JK02经解钾菌选择培养基活化后，观察其菌落形态特征，经观察可知，菌种在解钾菌选择培养基上形成明显的解钾圈，菌落表面湿润凸起，呈乳白色，边缘整齐，培养1-2d，菌落直径1-mm，培养3-5d，菌落直径5-7mm，然后再挑取菌种进行革兰氏染色、荚膜染色和芽孢染色后于显微镜(1600倍)下观察菌体形态，如图1中B所示，革兰氏染色菌体为阳性，孢子呈椭圆型，孢子囊明显膨胀，生长位置为中生到次端生，荚膜肥厚。

(3)GN03形态学鉴定

将上述保藏菌种GN03经自身固氮菌选择培养基活化后，观察其菌落形态特征，经观察可知，菌落表面光滑湿润，呈白色半透明状，圆形微隆起，边缘整齐，培养1-2d，菌落直径2-3mm，培养3-5d，菌落直径6-8mm，然后再挑取菌种进行革兰氏染色、荚膜染色和芽孢染色后于显微镜(1600倍)下观察菌体形态，如图1中C所示，革兰氏染色菌体为阳性，孢子呈椭圆型，孢子囊未见膨胀，生长位置为中生，荚膜肥厚。

2、生理生化鉴定

参照东秀珠(2001)的常见细菌鉴定手册，对上述分离、纯化后的菌种RP01、JK02和GN03分别进行生理生化鉴定，具体实验方法如下，鉴定结果见表2：

(1)接触酶试验：挑取一小环活化24h的菌种，涂抹于已滴有5％(v/v)过氧化氢的载玻片上，如有气泡产生则为接触酶阳性反应，无气泡产生则接触酶为阴性反应。

(2)氧化酶试验：配制1.0％(w/v)二甲基对苯二胺水溶液，滴在滤纸上使滤纸刚好湿润。取活化24h的菌种，用玻璃棒刮取少许菌苔涂在湿润的滤纸上。在10s内菌苔或其边缘呈现红色者为氧化酶阳性反应，在30s内出现红色者为迟缓阳性，不呈现红色或30s以后才呈现红色则属氧化酶阴性反应。

(3)甲基红(M-R)试验：甲基红试剂(即称取甲基红0.02g溶于60mL体积分数为95％的酒精中，再加40mL水混匀)，接种活化24h的菌种于装有灭菌后的葡萄糖蛋白胨培养液的试管中，37℃培养24h后，沿管壁加入3-4滴甲基红试剂混匀，放置，观察是否变色，若培养液由橘黄色变为红色则为M-R阳性反应。

(4)乙酰甲基甲醇(V-P)试验：操作同M-R试验，V-P试剂为40％(w/v)KOH溶液15滴，再加入等量α-萘酚溶液(α-萘酚5.0g溶于100mL无水酒精中)，混合均匀，再加入肌酸lmg，猛烈振荡，10min内变为红色即V-P阳性反应。

(5)淀粉水解试验：在牛肉膏蛋白栋培养基平板中加入0.2％(w/v)的可溶性淀粉，用接种环取少量活化24h的菌种点接在配置好的培养基表面，28℃培养24h后，滴加少量的碘液均匀铺满于平板中。菌落周围如出现无色透明圈，则表示该菌具有分解淀粉的能力，则为淀粉水解阳性反应，无透明圈则为淀粉水解阴性反应。

(6)硝酸还原酶试验：接种活化24h的菌种于硝酸盐还原培养液中，37℃培养48h，分成两管，其中一管加入格利斯亚硝酸试剂A(0.5g磺胺酸溶于150mL 30％(v/v)醋酸溶液中)、格利斯亚硝酸试剂B(0.5gα-萘酚加入50mL蒸馏水中，煮沸后加入150mL 30％(v/v)醋酸溶液)各1滴，如出现红色，则为阳性反应。不出现红色，则在另一管中加入少量锌粉，加热，再加入格利斯亚硝酸试剂A、B各1滴，如出现红色，则为硝酸还原酶阴性反应；如不出现红色，则为硝酸还原酶阳性反应。

(7)糖类发酵试验：将活化24h的菌种穿刺接种于培养基(1.0g(NH₄)H₂PO₄，0.2gMgSO₄，0.2g KCl，酵母膏0.2g，琼脂5g，葡萄糖或木糖10g，蒸馏水1000mL，0.04％(w/v)溴甲酚紫酒精溶液20mL)中，适温培养3d后观察颜色变化，若指示剂变黄，表示糖醇发酵产酸，为阳性；不变或变蓝(紫)则为阴性。琼脂柱中若有气泡出现，则表示为产气反应。

(8)明胶液化试验：用穿刺接种法接种活化24h的菌种于明胶液化培养基(蛋白胨5g；明胶150g；水1000mL；pH 7.2-7.4)中，20℃培养48h后，观察培养基有无液化情况，若液化，则为明胶液化阳性反应。

(9)吲哚试验：将活化24h的菌种接种于装有1％(w/v)胰蛋白胨水溶液培养基(pH7.5)的试管中，37℃培养24h后，在培养液中加入乙醚约lmL，充分振荡后静置片刻，再沿管壁加入吲哚试剂(对位二甲基苯甲醛3.0g，戊醇75.0mL，浓盐酸25.0mL)。如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，则为吲哚阳性反应。

(10)柠檬酸盐利用试验：接种活化24h的菌种于柠檬酸盐斜面培养基(柠檬酸钠2.0g；1.0g NH₃H₂PO₄；1.0g K₂HPO₄；5.0g NaCl；0.2g MgSO₄；1.5g琼脂；0.04％(w/v)苯酚红10mL；水1000mL)上，37℃培养36h，若斜面呈蓝色则为柠檬酸盐利用阳性反应，不变色为柠檬酸盐利用阴性反应。

(11)苯丙氨酸脱氨酶试验：接种活化24h的菌种于苯丙氨酸斜面培养基(5.0gNaCl；1.0g Na₂PO₄；3.0g酵母膏；1.0g L-苯丙氨酸；15g琼脂；水1000mL)上，36℃培养24h，滴加10％(w/v)FeCl₃试剂3-5滴，自斜面上方流下，若出现绿色则为苯丙氨酸脱氨酶阳性反应。

表2分离、纯化后所得菌种RP01、JK02和GN03的生理生化特征表

注：“+”表示反应为阳性，“－”表示反应为阴性

由表2可知，GN03的生理生化特征为：接触酶、M-R试验、V-P试验及硝酸还原酶等试验呈现阳性；氧化酶、吲哚试验、柠檬酸盐利用及苯丙氨酸脱氨酶试验呈现阴性；能水解淀粉、液化明胶。

RP01的生理生化特征为：接触酶、V-P试验及柠檬酸盐利用等试验呈现阳性；氧化酶、M-R试验、硝酸还原酶、吲哚试验及苯丙氨酸脱氨酶试验呈现阴性；能液化明胶，不能水解淀粉。

JK02的生理生化特征为：接触酶、氧化酶、M-R试验、硝酸盐还原及柠檬酸盐利用等试验呈现阳性；V-P试验、吲哚试验及苯丙氨酸脱氨酶试验呈现阴性；能水解淀粉、液化明胶。

3、分子生物学鉴定

16S rDNA序列鉴定上述保藏的菌种RP01、JK02和GN03的种属，具体方法如下：各菌种活化后，分别接种于LB液体培养基(28℃、120r/min)振荡培养24h，再采用TAKARAMiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0分别提取各细菌的全基因组DNA，以此为模板进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，即用细菌通用引物27F和1492R扩增16S核糖体序列，引物27F的序列为：5′—AGAGTTTGATCATGGCTCAG—3′，引物1492R的序列为：5′—TACGGTTACCTTGTTACGACTF—3′。扩增条件为：25μL Premix Taq(Takara Taq TM Version 2.0plus dye)，浓度均为25pmol的引物27F和1492R各2μL，1.0μL模板DNA，去离子水20μL。扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸2min，循环30次，然后72℃延伸10min，得到扩增后的DNA样品。将三种菌的PCR扩增产物送交上海英潍捷基贸易有限公司纯化、测序。

对于RP01，结果如SEQ ID NO.1。将测序后的16S rDNA序列提交NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对并对其同源序列用MEGA6.06软件的Neighbor-join法构建系统发育树。基于16S rDNA系统发育分析结果表明该菌株与登录号为J254673的短小芽孢杆菌处于同一最小分枝，且与多株短小芽孢杆菌属菌株相似度达到99％以上，结合菌株的形态学特征、生理生化特征，并参照《常见细菌系统鉴定手册》，将其命名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)RP01，简称RP01。

对于JK02，结果如SEQ ID NO.2。将测序后的16S rDNA序列提交NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对并对其同源序列用MEGA6.06软件的Neighbor-join法构建系统发育树。基于16S rDNA系统发育分析结果表明该菌株与登录号为HQ003414的环状芽孢杆菌处于同一最小分枝，且与多株芽孢杆菌属菌株相似度达到98％以上，结合菌株的形态学特征、生理生化特征，并参照《常见细菌系统鉴定手册》，将其命名为环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)JK02，简称JK02。

对于GN03，结果如SEQ ID NO.3。将测序后的16S rDNA序列提交NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对并对其同源序列用MEGA6.06软件的Neighbor-join法构建系统发育树。基于16S rDNA系统发育分析结果表明该菌株与登录号为KJ767360的解淀粉芽孢杆菌处于同一最小分枝，且与多株解淀粉芽孢杆菌属菌株相似度达到99％以上，结合菌株的形态学特征、生理生化特征，并参照《常见细菌系统鉴定手册》，将其命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GN03，简称GN03。

实施例2

复合菌剂在二级生姜脱毒种苗促生中的作用

一、包含复合菌剂菌肥的制备

将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)RP01、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)JK02和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GN03的按菌体数量之比为1:1:1混合后，与风干牛粪拌匀，制得农作物菌肥，该农作物菌肥中有效活菌数为3×10⁵CFU/g。其中，所述牛粪采自重庆市北碚区良种牛繁育中心，牛粪的基本理化性质见表3，无需对牛粪进行灭菌处理，直接经2个月自然风干。

表3供试牛粪的理化性质

二、将上述菌肥用于二级生姜脱毒种苗的栽培

以施加包含复合菌剂的菌肥(MI-CM)为试验组，单施复合菌剂(MI)、单施牛粪(CM)、普通生物菌剂+牛粪(BF-CM)、不施肥(CK)为四个对照组。其中，普通生物菌剂(BF)为市售宝禄1号(POLUMA-1，重庆宝禄满农业发展有限公司，总接种菌数约10⁸CFU/g)。每组设置四个平行组，试验共计20盆。

选择盆容积为2L的塑料花盆，每盆装未灭菌的供试土壤1.5kg。选发芽整齐、长势一致的姜苗，每盆种2株。

按50克/盆混施，施肥3天后移栽生姜组培苗(2棵/盆)。试验于2014年4月在西南大学资源环境学院盆栽场进行。随机分布，每天定量浇水，试验周期为90天。

按五点随机取样法取根系范围内土壤，4℃暂存，用于土壤微生物数量和土壤酶活性测定；植株测定株高、地径、叶片数、叶面积、分蘖数、地上部地下部鲜重后，于105℃杀青10min后，80℃烘干至恒重，分别测定植株地上部、地下部干重。

1、土壤微生物数量测定

土壤微生物数量采用稀释平板计数法测定。其中，细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基在37℃下培养24h；固氮菌采用自生固氮菌选择培养基在28℃下培养5d；溶磷菌采用溶磷菌选择培养基在28℃下培养3d；解钾菌采用解钾菌选择培养基在28℃下培养3d，结果见表4。

表4实验组与对照组的土壤中微生物数量

注：同一列中标记不同小写字母表示处理间差异达5％显著水平

由表4可知，细菌总数总体表现为：MI＞MI-CM＞BF-CM＝CM＝CK。其中，CK、CM和BF-CM三组的土壤中细菌总数仅为10～20×10⁶cfu·g^-1，均处于最低水平。而MI和MI-CM两组的土壤中细菌数量得到显著提升，尤为值得注意的是，MI中，生姜根际细菌总数更是提高了一个数量级，分别较CK、CM和BF-CM提高了427.0％、820.0％和458.7％。该结果充分表明该复合菌剂及包含该复合菌剂的菌肥能够显著影响二级生姜脱毒幼苗根际土壤微生物区系的数量，从而改善该幼苗根际土壤微生物群落结构。

同时，通过分析各组中固氮菌、溶磷菌和解钾菌数量可知，MI和MI-CM两组中三种菌的数量均显著高于CK、CM和BF-CM三组。其中，MI中，固氮菌总数分别较CK、CM和BF-CM处理提高了360.2％、379.2％和2352.8％；溶磷菌总数分别提高了505.3％、1101.5％和2339.4％；解钾菌总数提高了1638.0％、1242.5％和338.8％。该结果表明，本发明中所分离、筛选出的RP01、JK02和GN03三种菌具有强烈的竞争优势，即使是对于未灭菌供试土壤也能显著促进各自的增殖，实现生姜根际土壤微生态结构的改善。

2、生姜叶片多酚氧化酶活性和丙二醛含量测定

植株多酚氧化酶(PPO)活性和丙二醛(MDA)含量测定参照文献(陈建勋等，2006；李忠光，2008)的方法，结果见表5。

表5实验组与对照组中生姜幼苗叶片PPO和MDA含量

由表5可知，各组中生姜叶片中PPO活性总体表现为：MI-CM＞BF-CM＝MI＝CK＝CM，表明单一接种复合菌剂并不能提高生姜叶片中POD含量，但是在MI-CM组中，POD含量较CK、CM、MI和BF-CM组，分别显著提高了61.2％、62.5％、137.9％和100.6％。由于PPO是植物呼吸链的末端氧化酶，它能催化酚类化合物氧化，在植物抗病性中发挥重要作用(Richter etal.2012)。一般而言，PPO活性由植物病原菌的侵染诱导产生，如抗枯萎病离体培养香蕉幼苗PPO含量增高(Kavino,Manoranjitham et al.2014)，然而，本试验中MI-CM处理的生姜叶片PPO活性显著高于MI处理，显然可以排除所筛选三种菌是病原菌的可能性，相反，复合菌剂中三种菌在一定程度上诱导生姜幼苗防御活性的提高，以致提供生姜幼苗的抗病性。

MDA是膜脂过氧化最重要的产物之一，其含量高低能间接衡量植物衰老状况及植物的抗逆性。通常，植物体内MDA含量与抗逆性呈负相关，如土壤盐渍化(Shukla etal.2012,Xun et al.2015)和干旱(Wang et al.2012)等。各组中生姜叶片中MDA活性总体表现为：CK＝MI＞BF-CM＞MI-CM＝CM，MI-CM组中MDA含量均显著低于CK、MI、BF-CM三个对照组，说明施用适宜的复合菌剂并辅以合理的施肥措施可以对二级生姜脱毒幼苗的植物细胞膜起保护作用，增强其抗性。

3、生姜植株氮、磷、钾养分含量的测定

首先统计各组中生姜幼苗的农艺性状，结果见表6。

表6实验组与对照组中生姜幼苗的农艺性状

由表6可知，CK组中生姜幼苗的所有生长指标均显著低于其它组，表明二级生姜脱毒幼苗对土壤养分状况有较高要求，没有充分的养分供给，其二级生姜脱毒幼苗发育受到严重影响，也就无法实现生姜组培育苗的经济价值。此外，MI组除株高指标外，与CK、CM两组无显著差异，表明单一接种植物促生菌并不能改善生姜二级组培苗的生长发育。各组中生姜幼苗的农艺性状总体呈现为：MI-CM＞BF-CM＞CM＞MI＝CK，MI-CM组中二级生姜脱毒幼苗的各项生长指标均高于CK、CM两组。与CK组相比，MI-CM组中分蘖数、叶片数分别提高了133.3％和111.8％，用于繁育的球茎(地下部)干重提高了500.0％；与BF-CM组相比，MI-CM组中分蘖数、叶面积、地上部和地下部干重分别提高了40.0％、45.9％、28.6％和25％，其中BF-CM组中有效活菌数为10⁸CFU/g，而MI-CM组中有效活菌数为3×10⁵CFU/g，足以说明含有本发明复合菌剂的菌肥，在有效活菌数含量较低的情况下，都能有效提高二级生姜脱毒幼苗各项生长指标。

以上结果表明本发明中复合菌剂本身不具备植株生长所需的肥效作用，而必须通过转化土壤中的有机质等实现对植株的促生效应，但同时也表明选择合适的复合菌剂才可以提高二级生姜脱毒幼苗各项生长指标，大大增加其经济价值。

对生姜植株氮、磷、钾养分含量进行测定，其中，植株全氮采用蒸馏法，全磷采用钒钼黄比色法，全钾采用火焰光度法(杨剑虹等，2008)，结果见表7。

表7实验组与对照组中生姜幼苗叶片中氮、磷、钾含量

由表7可知，各组中二级生姜脱毒幼苗叶片中氮、磷、钾含量总体表现为：MI-CM＞BF-CM≥MI＝CK≥CM。与生姜幼苗的农艺性状相一致的是，MI组中，氮、磷、钾含量并未显著提高，说明单一接种复合菌剂并不能显著改善生姜植株的养分含量。而MI-CM组中，二级生姜脱毒幼苗地上部/地下部氮、磷、钾养分的含量方面，显著高于CK和BF-CM两组，其中在提高二级生姜脱毒幼苗地上部钾、地下部氮/磷养分的含量显著高于BF-CM组，分别提高了22.22％、30.00％和16.67％。表明接种适宜的复合菌剂不仅能促进二级生姜脱毒幼苗的生长，提高其品质，还能显著改善二级生姜脱毒幼苗的对养分的吸收利用，从而提高二级生姜脱毒幼苗的经济价值。

4、土壤理化性质的测定

测试二级生姜脱毒幼苗根系土壤的理化性质，其中，pH值采用酸度计测试、有机质采用重铬酸钾容量法测定、全氮采用凯氏定氮法测定、全磷采用钼蓝比色法测定、全钾采用火焰光度法测定、碱解氮、有效磷采用olsen法测定、速效钾采用NH₄Ac-火焰光度法测定，具体测定方法参照(杨剑虹等，2008)，结果见表8。

表8实验组与对照组中二级生姜脱毒幼苗根系土壤的理化性质

由表8可知，各组中二级生姜脱毒幼苗根系土壤的理化性质总体表现为：MI-CM≥BF-CM＞CM＞MI＞CK，其中，除土壤有机质和速效钾外，CK组中土壤理化指标均处于最低水平。与CK、CM和MI三组相比，MI-CM组中二级生姜脱毒幼苗根系土壤中全氮、磷、钾和速效磷养分的含量得到了显著提高；与BF-CM组相比，MI-CM组中二级生姜脱毒幼苗根系土壤中全氮、碱解氮和全钾含量虽无显著提高，但是全磷、速效磷和速效钾含量显著提高了15.15％、91.08％和22.97％，其中，尤为值得注意的是，速效磷含量的显著提高，表明本发明中包含复合菌剂的菌肥较普通微生物肥料更有助于促进难溶态磷素的供应，改善土壤养分状况。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学

<120> 一种促进农作物生长的复合菌剂及其应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1422

<212> DNA

<213> 短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）

<220>

<223> 16S rDNA序列

<400> 1

catgcaagtc gagcgaacag aagggagctt gctcccggat gttagcggcg gacgggtgag 60

taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg agctaatacc 120

ggatagttcc ttgaaccgca tggttcaagg atgaaagacg gtttcggctg tcacttacag 180

atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg gggtaatggc tcaccaaggc gacgatgcgt 240

agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg 300

gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga 360

gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt gcgagagtaa 420

ctgctcgcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg 480

cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaaggg ctcgcaggcg 540

gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg gagggtcatt ggaaactggg 600

aaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat 660

gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt aactgacgct gaggagcgaa 720

agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct 780

aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg 840

ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 900

gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaca 960

accctagaga tagggctttc ccttcgggga cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc 1020

agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt 1080

gccagcattt agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1140

atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggacaga 1200

acaaagggct gcaagaccgc aaggtttagc caatcccata aatctgttct cagttcggat 1260

cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc 1320

gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgcaac 1380

acccgaagtc ggtgaggtaa cctttatgga gccagcctcc ga 1422

<210> 2

<211> 1424

<212> DNA

<213> 环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）

<220>

<223> 16S rDNA序列

<400> 2

acatgcaagt cgagcggact ttaaaagctt gcttttaaag ttagcggcgg acgggtgagt 60

aacacgtggg caacctgcct gtaagactgg gataacttcg ggaaaccgga gctaataccg 120

gataatcctt ttcctctcat gaggaaaagc tgaaagacgg tttacgctgt cacttacaga 180

tgggcccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta 240

gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300

aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 360

tgatgaaggt tttcggatcg taaaactctg ttgttaggga agaacaagta caagagtaac 420

tgcttgtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480

ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg 540

tcctttaagt ctgatgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg agggtcattg gaaactgggg 600

gacttgagtg cagaagagaa gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660

tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ttggtctgta actgacgctg aggcgcgaaa 720

gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780

agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gcagcaaacg cattaagcac tccgcctggg 840

gagtacggcc gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900

catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacac 960

tcctagagat aggacgttcc ccttcggggg acagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt 1020

cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt 1080

tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1140

gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggatgg 1200

tacaaagggc agcaaaaccg cgaggtcgag caaatcccat aaaaccattc tcagttcgga 1260

ttgtaggctg caactcgcct acatgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1320

cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa 1380

cacccgaagt cggtggggta accttttgga gccagccgcc taag 1424

<210> 3

<211> 1419

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）

<220>

<223> 16S rDNA序列

<400> 3

tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60

acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120

atggttgttt gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180

ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240

ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300

ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360

gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata 420

gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480

ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540

tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600

aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660

tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720

gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780

agtgttaggg ggtttccggc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840

gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900

catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960

tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020

gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080

ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140

tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200

caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260

gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320

cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380

cccgaagtcg gtgaggtaac ctttatggag ccagccgcc 1419

Claims

1.一种促进农作物生长的复合菌剂，其特征在于，所述复合菌剂由以下菌株组成：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)RP01，保藏编号为CGMCC NO：13472、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)JK02，保藏编号为CGMCC NO：13473和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)GN03，保藏编号为CGMCC NO：13474。

2.如权利要求1所述的一种促进农作物生长的复合菌剂，其特征在于，所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)RP01、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)JK02和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GN03的菌体数量之比为1:1:1。

3.如权利要求1或2所述的一种促进农作物生长的复合菌剂，其特征在于，所述农作物为二级生姜脱毒种苗。

4.权利要求1或2所述的一种促进农作物生长的复合菌剂在改善农作物根际土壤微生物群落结构中的应用。

5.权利要求1或2所述的一种促进农作物生长的复合菌剂在改善农作物根际土壤中有效养分中的应用。

6.权利要求1或2所述的一种促进农作物生长的复合菌剂在提高农作物抗病性中的应用。

7.权利要求1或2所述的一种促进农作物生长的复合菌剂在增强农作物抗性中的应用。

8.包含权利要求1或2所述的一种促进农作物生长的复合菌剂的农作物菌肥。

9.权利要求8所述的农作物菌肥的制备方法，其特征在于，所述方法具体为：将短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)RP01、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)JK02和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GN03的按菌体数量之比为1:1:1混合后，与未经灭菌处理的风干牛粪拌匀，制得农作物菌肥，所述农作物菌肥中菌浓度为3×10⁵CFU/g。