CN111484954A - 一株产褐藻胶裂解酶的产黑假交替单胞菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株产褐藻胶裂解酶的产黑假交替单胞菌，属于微生物技术领域。本发明的产黑假交替单胞菌已于2019年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2019947。该菌株在25～37℃发酵1‑4％海带干重(荣成产)一天内可完全降解块状海带(0.5～1cm×0.5～1cm)，海带降解率达到70％；可产褐藻胶裂解酶，酶活达到54.5U/mL，比酶活达到545U/mg，该酶水解海藻酸钠可以制备聚合度为2‑4的褐藻寡糖，该菌株及酶基因在肥料、饲料、医药、食品等领域具有广阔的应用前景。

Description

一株产褐藻胶裂解酶的产黑假交替单胞菌
技术领域
本发明涉及一株产褐藻胶裂解酶的产黑假交替单胞菌，属于微生物技术领域。
背景技术
海带是一种大型海藻，具有复杂的、多方面的生物活性，其活性成分有碘、甘露醇和海带多糖等。我国海带养殖已发展成大规模产业，产量约占世界海藻50％，居世界第一位。海带含有丰富的海带多糖，至今已发现有3种多糖：褐藻胶、岩藻多糖、褐藻淀粉。其中褐藻胶是海带中的主要成分，可达海带干重的21％-40％。但是褐藻胶是一种大分子多糖，具有很强的粘性、不易消化。
目前，生物法降解海带及其降解产物褐藻寡糖是国内外学者研究的热点。国外的Masaywki Wakabayashi筛选到一株Microbulbifer species 6532A菌，在30℃，180rpm的条件下发酵2天，可以将块状海带降解成碎片(参考文献：WAKABAYASHI M,SAKATOKU A,NODAF,et al.Isolation and characterization of Microbulbifer species6532Adegrading seaweed thalli to single cell detritus particles[J].Biodegradation,2012,23(1):93-105.)；浙江大学的张心齐 (专利号：CN 103540540A)筛选到一株Tamlana alginolityca菌，在28℃，菌株接种量10％，装液量200mL/250mL的条件下发酵4天，才能将底物为2％海带的降解；海南大学的柏超选育了两个人工菌群，HZ-3-A在30℃，菌株接种量3％，装液量100mL/250mL的条件下发酵 5天，才能基本降解海带(参考文献：柏超.海带降解复合菌的选育及其功能研究[D]；浙江大学,2012.)。
现有制约微生物降解海带制备褐藻寡糖的问题主要有：菌株生长缓慢，耐热性差，不适宜工业化生产；菌株所产褐藻胶裂解酶酶活较低，降解海带能力弱、最大海带降解浓度为2％、无法在较短的时间内降解海带；野生型菌株所产酶丰富，纯化褐藻胶裂解酶难度较大；菌株所产褐藻胶裂解酶比活低，即使进行异源表达提高蛋白的表达量，酶活还是偏低，不能大幅度提高降解海带能力。目前已报道的野生型假交替单胞菌所产的褐藻胶裂解酶的比酶活都在 300U/mg以下。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株产黑假交替单胞菌，已于2019年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2019947。
本发明的第二个目的是提供含上述产黑假交替单胞菌的微生物制剂。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂含有不少于106CFU/mL的湿菌体或不少于106CFU/g的干菌体。
本发明的第三个目的是提供所述产黑假交替单胞菌在降解海带中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述降解海带是将产黑假交替单胞菌接种至海带液体培养基中，25～37℃，160～200rpm培养12～24h，海带完全降解，得到海带降解液。
在本发明的一种实施方式中，所述海带液体培养基的组分包括：干海带(荣成产)0～10％，海藻酸钠0.5～1％，酵母粉0.1～0.2％，K2HPO4 0.2～0.3％，MgSO4·7H2O 0.05～0.1％，CaCl2 0.001～0.002％，FeSO4·7H2O 0.0025～0.003％，NaCl 1.5～2％。
在本发明的一种实施方式中，所述海带液体培养基的组分包括：干海带0-10％，海藻酸钠0.5％，酵母粉0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl2 0.001％，FeSO4·7H2O 0.0025％，NaCl 1.5％。
在本发明的一种实施方式中，接种的产黑假交替单胞菌是将产黑假交替单胞菌单菌落接种于LB液体培养基中，25～37℃，160～200rpm培养12～24h得到的，接种量为1～5％。
本发明的第四个目的是提供一种制备褐藻寡糖的方法，将所述产黑假交替单胞菌接种至海藻酸钠液体发酵培养基中，35～39℃，160～200rpm培养24～48h，离心取上清，得到褐藻胶裂解酶，与海藻酸钠缓冲液反应24～60h，得到不同聚合度的褐藻寡糖。
本发明的第五个目的是提供上述产黑假交替单胞菌在肥料或饲料领域中的应用。
本发明的第六个目的是提供上述产黑假交替单胞菌在食品或制药领域中的应用。
有益效果：本发明提供的产黑假交替单胞菌，具有产褐藻胶裂解酶活性，酶活达到54.5 U/mL，比酶活545U/mg，可以制备聚合度为2-4的褐藻寡糖，该菌株生长迅速，种子液培养 18小时即可到达指数生长末期；耐热性强，在80℃下可存活30分钟；降解海带能力强，在37℃，菌株接种量5％，装液量50mL/250mL的条件下发酵24小时，可将底物为4％的海带降解成溶液，海带降解效果接近100％，海带降解率达到70％。该菌株具有广阔的肥料、饲料应用前景。
生物材料保藏
产黑假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)SC6，已于2019年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2019947。
附图说明
图1为产黑假交替单胞菌的染色圈图。
图2为产黑假交替单胞菌的菌落形态。
图3为未接6B的空白对照。
图4为培养基中含2％(w/v)的海带时的接菌降解图。
图5为培养基中含4％(w/v)的海带时的接菌降解图。
图6为褐藻寡糖的薄层层析图；从左至右，第一个为甘露糖混标品，第二个为甘露糖醛酸五糖的标品，其余为寡糖样品，可知海带降解充分，主要产物为褐藻二糖、褐藻四糖。
具体实施方式
实施例1褐藻胶裂解酶产生菌的筛选
(1)筛选
从山东荣成海域取样，样品包括海水、腐烂的海带、砂土、泥土等。将样品80℃水浴30min 预处理，然后用无菌生理盐水稀释涂布平板，挑选有透明圈的菌落划线分离，初筛采用革兰氏碘液染色的方法，复筛采用测量酶活和测量海带降解率的方法。从21个样品中筛选了400 多株野生菌，经过初筛、复筛，筛选到5株具有褐藻胶裂解酶能力的菌株。最终选取一株耐热、酶活高、降解海带能力强的菌株编号6B，进行下一步鉴定分析。
由图1知，菌株6B的透明圈的直径达到0.7cm，与菌株的直径比达到3.5。
(2)鉴定
将菌株6B划线得到的单菌落，在LB液体培养基中于37℃，180rpm培养30h，收集菌体，提取基因组，采用通用引物进行16s rDNA扩增，送至上海生工测序，在NCBI数据库中进行序列比对，表明菌株6B为产黑假交替单胞菌，将该菌株命名为产黑假交替单胞菌SC6。
由图2知菌落形态：白黄色，表面湿润光滑，不产色素，革兰染色阴性，菌体形态呈短杆状。
实施例2产黑假交替单胞菌SC6在降解海带中的应用
将产黑假交替单胞菌SC6划线培养，37℃培养24h，挑单菌落接种于LB液体培养基中， 37℃，180rpm培养30h，得到培养液；然后按3％的接种量将培养液接种于海带液体培养基中(培养基成分：干海带，海藻酸钠0.5％，酵母粉0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4·7H2O0.05％， CaCl2 0.001％，FeSO4·7H2O 0.0025％，NaCl 1.5％)，37℃，180rpm培养18～24h后，海带降解完全。用60目分样筛过滤培养基，得到的海带降解物置于65℃烘箱放置4h，得干海带，计算海带降解率。
降解效果：若块状海带(0.5～1cm×0.5～1cm)降解成小碎片或溶液状，则说明海带降解效果接近100％。
海带降解率W(％)＝[(M-m)/M]*100％，其中，M：培养基中干海带的质量；m：海带发酵液经60目筛网过滤后，烘干得到残余干海带的质量。
经检测，海带降解效果接近100％，海带降解率达70％(图3-5)。
实施例3产黑假交替单胞菌SC6在制备寡糖中的应用
将产黑假交替单胞菌SC6划线培养，37℃培养24h，挑单菌落接种于LB液体培养基中， 37℃，180rpm培养30h，得到培养液；然后按3％的接种量将培养液接种于海藻酸钠液体发酵培养基中(培养基成分：海藻酸钠0.5％，酵母粉0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4·7H2O0.05％， CaCl2 0.001％，FeSO4·7H2O 0.0025％，NaCl 1.5％)，37℃，180rpm发酵48h；取10mL发酵液，8000rpm离心10min，取上清，得到褐藻胶裂解酶液。取0.2mL酶液，加入到1.8mL0.5％海藻酸钠缓冲液，40℃水浴24～60h。沸水浴10min，冷却到室温，8000rpm离心10min，取上清，得到褐藻寡糖溶液。
取2μL点样于薄层层析板上，展开剂为正丁醇：甲酸：水(5:5:3)，显色剂为地衣酚(900 mg的地衣酚溶于25mL水中，加入375mL无水乙醇，冰浴，缓慢加入50mL浓硫酸)，105℃显色5min。经检测，褐藻寡糖的聚合度为2-4。由图6知制备褐藻寡糖的聚合度。
实施例4测量褐藻胶裂解酶活力的方法
将产黑假交替单胞菌SC6划线培养，37℃培养24h，挑单菌落接种于LB液体培养基中， 37℃，180rpm培养30h，得到培养液；然后按3％的接种量将培养液接种于液体发酵培养基中(培养基成分：海藻酸钠0.5％，酵母粉0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4.7H2O 0.05％，CaCl20.001％，FeSO4.7H2O 0.0025％，NaCl 1.5％)，37℃，180rpm培养48h，取10mL发酵液，8000rpm离心10min，取上清，得到褐藻胶裂解酶液。
取0.2mL酶液，加入到1.8mL 0.5％海藻酸钠缓冲液，40℃水浴15min，加入1.5mlDNS 试剂，混匀后沸水浴5min，冷却到室温，定容至15mL，用紫外分光光度计测量OD540，根据标准曲线计算还原糖的质量，并根据公式计算酶活。
酶活力单位(U/mL)：在实验条件下，1mL粗酶液每分钟催化底物产生1μg还原糖所需的酶量。
计算公式：酶活力(U/mL)＝1000An/(tV)
结果表明，褐藻胶裂解酶的酶活达到54.5U/mL，比酶活达到545U/mg。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株产黑假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)，已于2019年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019947。
2.含权利要求1所述产黑假交替单胞菌的微生物制剂。
3.如权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂含有不少于106CFU/mL的湿菌体或不少于106CFU/g的干菌体。
4.权利要求1所述产黑假交替单胞菌在降解海带中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述降解海带是将权利要求1所述产黑假交替单胞菌接种至海带液体培养基中，25～37℃，160～200rpm培养12～24h，海带完全降解，得到海带降解液。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述海带液体培养基的组分包括：干海带0～10％，海藻酸钠0.5～1％，酵母粉0.1～0.2％，K2HPO4 0.2～0.3％，MgSO4·7H2O 0.05～0.1％，CaCl2 0.001～0.002％，FeSO4·7H2O 0.0025～0.003％，NaCl 1.5～2％。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，接种前，将产黑假交替单胞菌单菌落接种于LB液体培养基中，25～37℃，160～200rpm培养12～24h得到的。
8.一种制备褐藻寡糖的方法，其特征在于，将权利要求1所述产黑假交替单胞菌接种至海藻酸钠液体发酵培养基中，25～37℃，160～200rpm培养18～24h，离心取上清，得到褐藻胶裂解酶，与海藻酸钠缓冲液反应24～60h，得到褐藻寡糖。
9.权利要求1所述产黑假交替单胞菌在肥料或饲料领域中的应用。
10.权利要求1所述产黑假交替单胞菌在食品或制药领域中的应用。
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