CN111100828B - 一株可产高活力褐藻胶裂解酶的勒克氏菌及其应用 - Google Patents

一株可产高活力褐藻胶裂解酶的勒克氏菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可产高活力褐藻胶裂解酶的勒克氏菌及其应用，其中，该株勒克氏菌（Leclercia sp.）是从取自黄海的腐烂的海带中分离得到的，其能够产高活力的褐藻胶裂解酶，该菌株已于2019年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 2019313。本发明的有益之处在于：（1）筛选得到的勒克氏菌可产高活力褐藻胶裂解酶，高活力褐藻胶裂解酶对底物海藻混悬液的转化率高，在制备褐藻寡糖时，有利于提高生产效率；（2）利用勒克氏菌制备褐藻寡糖时，由于该菌株可产高活力褐藻胶裂解酶，所以生产成本低、生产效率高。

Description

一株可产高活力褐藻胶裂解酶的勒克氏菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株勒克氏菌及其应用，具体涉及一株可产高活力褐藻胶裂解酶的勒克氏菌及其应用，属于海洋生物技术领域。
背景技术
我国海带产量占国际总产量87%，但高产量并未获得高经济效益。褐藻酸是从褐藻中提取的一种酸性多糖，褐藻酸盐是甘露糖醛酸和古罗糖醛酸组成的线性多糖。利用褐藻资源可开发褐藻酸等相关多功能生物制品，常用于食品和医疗材料领域，但是它的高粘度和高聚合度限制了其应用。褐藻酸盐可经物理降解、化学降解、酶解等方法获得褐藻寡糖。褐藻寡糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、促进植物生长等生物活性，因此可广泛应用于食品、医药、农业及化妆品等领域。
通过目前的研究可知，采用物理降解法和化学降解法来制备褐藻寡糖时，易破坏褐藻寡糖的结构，从而影响褐藻寡糖的生物活性。酶解法制备褐藻寡糖因具有专一性强、条件温和、可控性强等优势，所以采用酶解法制备褐藻寡糖更具有研究意义。褐藻胶裂解酶存在于多种生物体中，经过β-消除后，产生不饱和寡糖。目前，分离纯化得到的菌株有芽孢杆菌属、海洋弧菌属、海洋嗜盐单胞菌等，但这些微生物所产的褐藻胶裂解酶的活力普遍较低，一般在0.3-2U/mL，并且有许多菌株还是致病菌，因而限制了这类微生物的广泛应用。因此，需要分离筛选得到产高活力褐藻胶裂解酶并且能广泛应用的菌株。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一株可产高活力褐藻胶裂解酶并且是非致病菌的勒克氏菌。
本发明的第二个目的在于提供一种该勒克氏菌的应用，具体提供的是利用该勒克氏菌制备褐藻寡糖的方法。
为了实现上述第一个目标，本发明采用如下的技术方案：
一株勒克氏菌，分类命名为 Leclercia sp.，其特征在于，该菌株是从取自黄海的腐烂的海带中分离得到的，其能够产高活力的褐藻胶裂解酶，该菌株已于2019年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No. M 2019313。
为了实现上述第二个目标，本发明采用如下的技术方案：
利用前述保藏编号为CCTCC No. M 2019313的勒克氏菌制备褐藻寡糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将菌株在选择性固体培养基上进行活化；
步骤2：取活化后的菌种数环，转接到种子培养基中，30℃、200-260rpm培养24h，得到种子液；
步骤3：按2-5%的接种量将种子液接入到发酵培养基中，30℃、200-260rpm培养33h，得到发酵液；
步骤4：将发酵液加入到海藻混悬液中，40℃水浴中酶解24-48h，然后升温至120℃，灭活1h，得初解溶液；
步骤5：将初解溶液依次进行膜过滤、浓缩、冷冻干燥，制得褐藻寡糖。
前述的方法，其特征在于，在步骤1中，所用到的选择性固体培养基是以海藻酸钠为唯一碳源的，其配方为：
海藻酸钠5g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸亚铁0.01g/L，琼脂20g/L，自来水配制。
前述的方法，其特征在于，在步骤2中，所用到的种子培养基的配方为：
葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉10g/L，海水配制。
前述的方法，其特征在于，在步骤3中，所用到的发酵培养基的配方为：
葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，自来水配制。
前述的方法，其特征在于，在步骤4中，海藻混悬液由铜藻粉末和水混合而成，其中，铜藻粉末过40目筛。
本发明的有益之处在于：
（1）筛选得到的保藏编号为CCTCC No. M 2019313的勒克氏菌可产高活力褐藻胶裂解酶，高活力褐藻胶裂解酶对底物海藻混悬液的转化率高，在制备褐藻寡糖时，有利于提高生产效率；
（2）利用保藏编号为CCTCC No. M 2019313的勒克氏菌制备褐藻寡糖时，由于该菌株可产高活力褐藻胶裂解酶，所以生产成本低、生产效率高。
附图说明
图1是复筛阶段菌株产生的透明圈；
图2是构建的菌株的系统发育树；
图3是菌株的生长曲线；
图4 是TLC板对终产物褐藻寡糖的检测结果（左为寡糖标准品，右为样品）。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、菌株的筛选及鉴定
经过对产酶菌种的经年研究，我们从海带中分离得到了一株可产高活力褐藻胶裂解酶的勒克氏菌（ Leclercia sp.）。
该可产高活力褐藻胶裂解酶的勒克氏菌（ Leclercia sp.）具体是通过下面的方法筛选得到的：
1、获取出发菌株
2018年4月16日，我们从黄海采摘回来4棵腐烂的海带，通过初筛和复筛从中分离得到了一株出发菌株，初筛和复筛的详细过程如下：
（1）初筛
使用研钵将采摘回来的4棵腐烂海带分别研碎，制成样品液，分别记为SE1、SE2、SE3、SE4。取5只15mL试管，编号1至5，分别加入4.5mL无菌水，1号试管中加入0.5mL样品液，充分混合后用1000μL移液枪吸取0.5mL稀释液移入下一支试管，依次进行梯度稀释，将样品稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5五个梯度。选取各样品10-3、 10-4、10-5 三个浓度梯度，用100μL移液枪吸取50μL，涂布于选择性固体培养基上，其中，来自SE1的3个浓度梯度的样品分别记为SE13、SE14、SE15，来自SE2的3个浓度梯度的样品分别记为SE23、SE24、SE25，来自SE3的3个浓度梯度的样品分别记为SE33、SE34、SE35，来自SE4的3个浓度梯度的样品分别记为SE43、SE44、SE45，然后30℃下恒温培养24h，最后挑取透明圈最大（即降解海藻酸钠能力最强）的那个单菌落，在这一步我们从标号为SE14的平板（对应的海带样品的标号为SE1，稀释梯度为10-4）和标号为SE44的平板（对应的海带样品的标号为SE4，稀释梯度为10-4）上筛选到了两个透明圈比较大的单菌落，我们将这两个单菌落中的菌株分别记为：菌株SE14、菌株SE44。
选择性固体培养基的配方为：海藻酸钠5g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸亚铁0.01g/L，琼脂20g/L，自来水配制。
（2）复筛
我们将初筛得到的菌株SE14和菌株SE44分别接种到种子培养基中，于30℃、230rpm恒温培养24h获得种子液，然后将种子液接种到发酵培养基中，于30℃、230rpm恒温培养24h获得发酵液，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min获得发酵上清液。在无菌的条件下，将两个牛津杯放置于MAlg平板培养基上，向其中一个牛津杯中加入200µL来自菌株SE14的发酵上清液，向另一个牛津杯中加入200µL来自菌株SE44的发酵上清液，然后将MAlg平板培养基置于30℃培养箱中培养24h。培养结束后，向MAlg平板培养基上倾倒革兰氏碘液，然后测量两个牛津杯周围的透明圈（见图1）的直径并计算透明圈面积，透明圈面积越大，对应的褐藻胶裂解酶降解海藻酸钠的活力就越高，经计算，菌株SE14所产的褐藻胶裂解酶降解海藻酸钠的活力更高一些。
种子培养基的配方为：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉10g/L，海水配制。
发酵培养基的配方为：葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，自来水配制。
MAlg培养基的配方为：葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，琼脂20g/L，自来水配制。
（3）测定菌株SE14的酶活力
酶活力单位定义为：每1min透明圈面积增加0.1mm2所需的酶量为一个酶活力单位（EU，enzyme unit）。
透明圈实验结果表明：筛选出来的菌株SE14其所产的褐藻胶裂解酶的酶活为9.3EU。
2、鉴定菌株SE14及构建菌株SE14的系统发育树
用试剂盒抽提法提取菌株SE14的DNA，经PCR扩增后获得菌株SE14的16SrDNA，运用NCBI中的Blast 程序与数据库中的细菌16S rDNA 序列进行相似性比对。比对结果：菌株SE14为勒克氏菌（ Leclercia sp.）。
获得菌株SE14的16S rDNA后，用MEGA 5.1 软件（Neighbor-Joining）构建菌株SE14的系统发育树（见图2），分析各菌株的进化关系，鉴定细菌种类。鉴定结果：菌株SE14为勒克氏菌（ Leclercia sp.）。
二、菌种保藏
由于我们筛选得到的菌株SE14能够产较高活力的褐藻胶裂解酶（酶活为9.3EU），所以我们将该菌株SE14保藏在了中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉，保藏日期为：2019年4月28日，保藏编号为：CCTCC No. M 2019313，分类命名为：勒克氏菌（Leclercia sp.）。
三、利用菌株SE14制备褐藻寡糖
利用菌株SE14制备褐藻寡糖，具体包括以下步骤：
1、活化菌株
准备选择性固体培养基：海藻酸钠5g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸亚铁0.01g/L，琼脂20g/L，自来水配制，灭菌后备用。
将菌株SE14从-80℃环境中取出，室温解冻，然后在选择性固体平板培养基上进行活化，活化温度30℃，活化时间24h。
、制备种子液
准备种子培养基：葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉10g/L，海水配制，灭菌后备用。
取活化后的菌种数环，转接到种子培养基中，30℃、200-260rpm（本实施例采用的是230rpm）培养24h，得到种子液。
、制备发酵液
准备发酵培养基：葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，自来水配制，灭菌后备用。
按2-5%（体积分数）的接种量（本实施例采用的接种量是5%）将上述种子液接入到发酵培养基中，30℃、200-260rpm（本实施例采用的是230rpm）培养33h，得到发酵液，即褐藻胶裂解酶粗酶液。
在发酵阶段，监测菌体的生长曲线，菌体生长情况见图3。
由图3可知，菌株SE14在该发酵培养基中可以快速、高密度生长，这不仅有利于缩短发酵时间，而且有利于提高发酵液（即褐藻胶裂解酶粗酶液）中褐藻胶裂解酶的浓度，从而有利于提高产物（褐藻寡糖）的产量。
、获取初解溶液
将褐藻胶裂解酶粗酶液以1:10的体积比加入到海藻混悬液中，40℃水浴中酶解至少24h（可适当延长酶解时间至48h），然后升温至120℃，灭活1h，得初解溶液。
海藻混悬液：由铜藻粉末和水混合而成，其中，铜藻粉末过40目筛，铜藻粉末和水的混合比例为1g:20ml。
铜藻粉末的获得方法：冲洗铜藻原料，去除泥沙、贝壳等杂质，晾干（或烘干）后，用粉碎机研磨成粉末，过40目筛。
、获取褐藻寡糖
将初解溶液依次进行膜过滤、浓缩、冷冻干燥，制得褐藻寡糖。
经称量，1000mL海藻混悬液（含有50g铜藻粉）可制得12.6g褐藻寡糖，用TLC板对终产物褐藻寡糖进行检测，结果见图4。由图4可知，主要产物为褐藻三糖和褐藻四糖。
综上，由于菌株SE14可产高活力褐藻胶裂解酶，并且在特定的发酵培养基中可以快速、高密度生长，所以利用菌株SE14来制备褐藻寡糖时，不仅缩短了发酵时间，而且提高了发酵液（即褐藻胶裂解酶粗酶液）中褐藻胶裂解酶的浓度，这很有利于提高产物（褐藻寡糖）的产量。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一株勒克氏菌，分类命名为Leclercia sp.，其特征在于，该菌株是从取自黄海的腐烂的海带中分离得到的，其能够产高活力的褐藻胶裂解酶，该菌株已于2019年4月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No. M 2019313。
2.采用权利要求1所述的勒克氏菌制备褐藻寡糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将权利要求1所述的菌株在选择性固体培养基上进行活化；
步骤2：取活化后的菌种数环，转接到种子培养基中，30℃、200-260rpm培养24h，得到种子液；
步骤3：按2-5%的接种量将种子液接入到发酵培养基中，30℃、200-260rpm培养33h，得到发酵液；
步骤4：将发酵液加入到海藻混悬液中，40℃水浴中酶解24-48h，然后升温至120℃，灭活1h，得初解溶液；
海藻混悬液由铜藻粉末和水混合而成，其中，铜藻粉末过40-60目筛；
步骤5：将初解溶液依次进行膜过滤、浓缩、冷冻干燥，制得褐藻寡糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤1中，所用到的选择性固体培养基是以海藻酸钠为唯一碳源的，其配方为：
海藻酸钠5g/L，硫酸铵5g/L，硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸亚铁0.01g/L，琼脂20g/L，自来水配制。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤2中，所用到的种子培养基的配方为：
葡萄糖5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉10g/L，海水配制。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤3中，所用到的发酵培养基的配方为：
葡萄糖3g/L，海藻酸钠3g/L，蛋白胨3g/L，酵母浸粉6g/L，自来水配制。
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