CN110607266B

CN110607266B - 产褐藻胶裂解酶的黄杆菌及其应用

Info

Publication number: CN110607266B
Application number: CN201911010492.1A
Authority: CN
Inventors: 严芬; 王梅; 陈星杭; 蔡婷; 翁祖铨
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2019-10-21
Filing date: 2019-10-21
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2039-10-21
Also published as: CN110607266A

Abstract

本发明提供一种产褐藻胶裂解酶的黄杆菌及其应用。所述的黄杆菌B2，保藏编号为CGMCC No.17354。该黄杆菌B2的菌落颜色为黄色，菌落相连，不形成芽孢，不运动，革兰氏阴性菌。所述的黄杆菌是从腐烂的海带中筛选到的，用于产褐藻胶裂解酶，褐藻胶裂解酶的酶活力达到53 U/mL，该酶能够降解褐藻胶，其降解产物为褐藻寡糖，该降解菌的发现对褐藻胶裂解酶及后期褐藻寡糖的制备具有一定的商业价值。

Description

产褐藻胶裂解酶的黄杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及产褐藻胶裂解酶的黄杆菌及其应用。

背景技术

褐藻寡糖是褐藻胶经降解得到的寡聚物，由古罗糖醛酸（G）和甘露糖醛酸（M）组成。由于褐藻寡糖具有多种生理活性，如：抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老及促进植物生长的作用，近年来被越来越广泛的应用于食品、医药和农业等领域，具有巨大的经济价值与应用前景。

目前褐藻寡糖的制备方法通常由酸降解法，酶降解法，氧化降解法。酸降解法是较为常用的方法，其降解产物能维持褐藻胶的自身结构特征，不会产生酶解生成的不饱和双键和氧化降解产物的羧基。氧化降解制备的褐藻寡糖，其还原端1位的醛基易被氧化为羧基，而导致环的破裂。酶作为高效的生物催化剂，其在医药、食品、农业等各个领域内被广泛使用。生物酶法因其操作简便、反应温和、环境污染小等优点被广泛应用于寡糖制备。近年来，已有研究报道有多种微生物能发酵生产褐藻胶裂解酶，如：产微球茎菌（Microbulbifer）、假交替单胞菌（Pseudoalteromonas）、芽孢杆菌(Bacillus)、弧菌（Vibrio）等。目前大部分菌株产褐藻胶裂解酶的活力低，发酵周期长，从而无法使褐藻胶裂解酶菌株应用到实际发酵生产中。本发明提供一种产褐藻胶裂解酶的黄杆菌，该菌株发酵生产的褐藻胶裂解酶，酶活力高达53U/mL，发酵效率高，为褐藻寡糖的制备奠定了一定的基础。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一株产褐藻胶裂解酶的黄杆菌及其应用。本发明产褐藻胶裂解酶的黄杆菌，产酶量大，发酵效率高，在褐藻寡糖的制备中应用潜力大。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的目的之一在于提供了一株产褐藻胶裂解酶的黄杆菌，该菌株黄杆菌B2的分类命名为： Zobellia sp. B2，该菌株已于2019年03月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17354。

上述黄杆菌B2在产褐藻胶裂解酶中的应用。

上述黄杆菌B2在产褐藻胶裂解酶中的应用，其黄杆菌产褐藻胶裂解酶的方法，包括以下步骤：

（1）黄杆菌B2菌液涂布到2216E固体平板培养基上，放置28℃生化培养箱中培养24h；

挑取平板上的黄杆菌进行三区划线，将三区划线后的平板放置28℃生化培养箱中培养24h；

挑取平板上的黄杆菌接种于装有2216E液体培养基的锥形瓶中进行培养，在28℃，转速为180rpm的摇床上培养12-16h至对数中后期，得到种子液；

（2）将步骤（1）制备的种子液接种于装有发酵培养基的锥形瓶中进行培养，在28℃，pH 7.2，转速为180rpm的摇床上培养36h，得到褐藻胶裂解酶发酵液。

上述步骤（1）中所述2216E固体平板培养基配方为：蛋白胨5g/L、酵母粉1g/L、六水合氯化铁0.0018g/L，氯化钠 26.5g/L、氯化钾0.9g/L、氯化钙1.03g/L、七水硫酸镁4.2g/L，琼脂20g/L；2216E固体平板培养基配方中不添加琼脂为2216E液体培养基。

上述步骤（2）中所述发酵培养基配方为：海藻酸钠5g/L、蛋白胨2g/L、磷酸氢二钾1g/L、氯化钠 26.5g/L、氯化钾0.9g/L、氯化钙1.03g/L、七水硫酸镁4.2g/L。

上述步骤（2）中以3%的接种量将种子液接种至发酵培养基中。

本发明的优点在于：

本发明提供了一株新型的产褐藻胶裂解酶的菌株Zobellia sp. B2，其优点在于：（1）本发明黄杆菌B2培养需求简单，发酵周期短；（2）粗酶液制备简单，离心即可得到粗酶液；（3）黄杆菌B2所产的褐藻胶裂解酶达53U/mL；（4）提供一种产褐藻寡糖的制备方法；黄杆菌B2生产的褐藻胶裂解酶降解褐藻胶，生产具有一定生物活性的褐藻寡糖。

附图说明

图1黄杆菌B2菌落形态图。

图2黄杆菌B2细胞形态特征图。油镜观察×1000。

图3黄杆菌B2进化树。

图4不同氮源对黄杆菌B2产褐藻胶裂解酶的影响。

图5不同浓度的海藻酸钠对黄杆菌B2产褐藻胶裂解酶的影响。

图6培养温度对黄杆菌B2产褐藻胶裂解酶的影响。

图7培养pH对黄杆菌B2产褐藻胶裂解酶的影响。

图8黄杆菌B2所产褐藻胶裂解酶降解海藻酸钠其降解产物褐藻寡糖的TLC图。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

实施例1黄杆菌sp.B2的筛选

黄杆菌B2的筛选包括以下步骤：

（1）富集培养：把从宁德养殖场中获得的腐烂海带样品捣碎后加入2 ml无菌海水，再将菌液涂布到固体平板筛选培养基中28℃培养24h，进行分离初筛。

（2）分离纯化：选择有透明圈或者凸起的菌株进行液体筛选培养基摇瓶发酵复筛，反复用微生物分离方法进行分离纯化，直至获得黄杆菌纯培养物sp.B2。

其中上述富集培养基分离纯化过程中所用到的培养基组分及配比如下：

液体筛选培养基：褐藻酸钠10 g，蛋白胨1 g，人工海水1 L，pH 7.0，121℃蒸汽灭菌20 min。

固体平板筛选培养基：褐藻酸钠10 g，蛋白胨1 g，琼脂20 g，人工海水1 L，pH7.0，121℃蒸汽灭菌20 min。

人工海水的配方为：NaCl 26.5g, KCl 0.9g, CaCl2 1.03g, MgSO4 4.2g, UP水定容至1L。

实施例2黄杆菌B2的鉴定

经过实施例1筛选获得产褐藻胶裂解酶的黄杆菌B2，所用的菌株在固体平板筛选培养基上生长24h后，黄杆菌B2菌落周围形成明显黄色片状凸起（图1）；黄杆菌B2形态呈杆状，油镜下观察的细菌形态如图2所示。不形成芽孢，不运动，革兰氏阴性菌。黄杆菌（sp.B2）的最适生长温度为32℃，pH为7.2。

将B2菌株进行活化，接种于2216E液体培养基中，过夜培养离心后，收集菌体。采用上海生工Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA；以抽提的菌株DNA为模板，使用通用引物M13F: 5’-GTAAAACGACGGCCAGT -3’与M13R:5’-AACAGCTATGACCATG-3’，扩增菌株的16S rRNA序列，测序结果在NCBI数据库中进行比对，下载同源性高的基因序列，利用MEGA 5构建系统发育进化树。进化树如图3。

根据菌体形态及菌株DNA测序结果（SEQ ID NO.1），初步鉴定所用的菌株为黄杆菌属Zobellia sp.，并命名为黄杆菌B2。

筛选鉴定所得黄杆菌B2，于2019年03月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号CGMCCNo.17354。

实施例3

黄杆菌sp.B2菌液上清液酶活性的测定

挑取固体平板筛选培养基上的黄杆菌B2接种于装有产酶培养基的锥形瓶中，培养温度为28℃，转速为180rpm，放在摇床中培养36h，得到菌株的发酵液。11800rpm下离心10min，取上清液与DNS试剂反应，在540nm下测吸光值。酶活力单位定义为：每分钟释放1μmol的还原糖，所需的酶量。测得的酶活力为53U/mL。

酶活力计算公式为： U=（A*1000*N）/T

A—用DNS法测得的OD值在葡萄糖标准曲线公式y=0.283x+0.0356上所对应的浓度（mg/mL）；

N—酶液的稀释倍数；

T—酶反应的时间。

上述酶活性测定过程中所用到的产酶培养基组分及配比如下：海藻酸钠5g/L、蛋白胨2g/L、磷酸氢二钾 1g/L、氯化钠 26.5g/L、氯化钾0.9g/L、氯化钙1.03g/L、七水硫酸镁4.2g/L，pH 7.2。

实施例4

采用黄杆菌sp.B2制备褐藻胶裂解酶：

挑取固体平板筛选培养基上的黄杆菌B2接种于装有2216E的液体培养基中，培养温度为28℃，转速为180rpm，放在摇床中培养12-16h至对数中后期，得到菌株的种子液。然后以3%的接种量将种子液接种至装有产酶培养基的锥形瓶中，培养温度为28℃，放在摇床中转速为180rpm，培养36h，得到褐藻胶裂解酶液，测其酶活为53U/mL。

实施例5

不同氮源对褐藻胶裂解酶的影响：

挑取固体平板筛选培养基上的黄杆菌B2接种于装有2216E的液体培养基中，培养温度为28℃，转速为180rpm，放在摇床中培养12-16h至对数中后期，得到菌株的种子液。然后以3%的接种量将种子液接种至装有产酶培养基的锥形瓶中，转速为180rpm，培养36h，得到褐藻胶裂解酶液，分别测其酶活性。

所述产酶培养基的氮源分别为NH4Cl、尿素、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨，其余组分同实施例3的产酶培养基。

不同氮源对黄杆菌sp.B2产褐藻胶裂解酶的影响见图4。图4结果表明蛋白胨为氮源时其酶活最高，酶活达到53U/mL，其次是牛肉膏，酵母粉。以NH4Cl、尿素为氮源时没有酶活性。

实施例6

不同浓度的海藻酸钠对褐藻胶裂解酶的影响：

所述产酶培养基中海藻酸钠的浓度分别为1%、3%、5%、7%、9%，其余组分同实施例3的产酶培养基。

不同浓度的海藻酸钠对黄杆菌B2产褐藻胶裂解酶的影响见图5。图5结果表明海藻酸钠浓度为7g/L时其酶活最高，酶活达到38.71U/mL，随着温度的升高，其酶活性先降再升后降。

实施例7

温度对褐藻胶裂解酶的影响：

挑取固体平板筛选培养基上的黄杆菌B2接种于装有2216E的液体培养基中，培养温度为28℃，转速为180rpm，放在摇床中培养12-16h至对数中后期，得到菌株的种子液。然后以3%的接种量将种子液接种至装有产酶培养基的锥形瓶中，分别将温度设置为24、28、32、36、40℃，转速为180rpm，培养36h，得到褐藻胶裂解酶液，分别测其酶活性。

培养温度对黄杆菌B2产褐藻胶裂解酶的影响见图6。图6结果表明温度为32℃时其酶活最高，酶活达到39.21U/mL，随着海藻酸钠浓度的升高，其酶活性先升后降。

实施例8

pH对褐藻胶裂解酶的影响：

挑取固体平板筛选培养基上黄杆菌B2接种于装有2216E的液体培养基中，培养温度为28℃，转速为180rpm，放在摇床中培养12-16h至对数中后期，得到菌株的种子液。然后以3%的接种量将种子液接种至装有产酶培养基的锥形瓶中，分别将pH调为7.0、7.2、7.4、7.6、7.8，转速为180rpm，培养36h，得到褐藻胶裂解酶液，分别测其酶活性。

培养pH对黄杆菌B2产褐藻胶裂解酶的影响见图7。图7结果表明 pH为7.2时其酶活最高，酶活达到34.6U/mL，随着pH的升高，其酶活性先升后降。

实施例9

利用黄杆菌B2所产的褐藻胶裂解酶生产褐藻寡糖：

取2g海藻酸钠溶于100mL 磷酸盐缓冲溶液(20mM pH 7.2)中，加入20mL黄杆菌（sp.B2）所产褐藻胶裂解酶粗酶液于32℃水浴中，酶解24h后，取出，在沸水浴下，灭酶活20min，11800rpm下离心10min，取上清，经过旋转蒸发浓缩后，加入20wt%的无水乙醇醇沉，4℃下放置过夜。取出11800rpm下离心10min，取上清浓缩，冷冻干燥，得到聚合度1-5的褐藻寡糖，所得产物的薄层层析图如图8所示。图8结果表明酶解过后的海藻酸钠主要产物组分为单糖、二糖、三糖，含有少量的四糖和五糖。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 产褐藻胶裂解酶的黄杆菌及其应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> M13F

<400> 1

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> M13R

<400> 2

aacagctatg accatg 16

<210> 3

<211> 1000

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.1

<400> 3

caagccttgc cgcggctaca catgcagtcg aggggtaaca tggtagcttg ctaccgatga 60

cgaccggcgc acgggtgcgc aacgcgtata caatctgccc cctactgtgg gatagcccag 120

agaaatttgg attaatacca catggtacca tattacggca tcgtatttat ggttaaaggt 180

tacggtaggg gatgagtatg cgtcccatta gttagttggt gaggtaacgg ctcaccaaga 240

ccgcgatggg taggggccct gagaggggga tcccccacac tggtactgag acacggacca 300

gactcctacg ggaggcagca gtgaggaata ttggacaatg ggcgggagcc tgatccagcc 360

atgccgcgtg caggaagaat gccctatggg tagtaaactg cttttatacg ggaagaaaaa 420

gggctacgtg tagcctactg acggtaccgt aagaataagg accggctaac tccgtgccag 480

cagccgcggt aatacggagg gtccgagcgt tatccggaat tattgggttt aaagggtccg 540

taggcgggcc gataagtcag gggtgaaagt ttgcagctca actgtaaaat tgcctttgat 600

actgtcggtc ttgagttata gtgaagttgc cggaatatgt agtgtagcgg tgaaatgcat 660

agatattaca tagaacaccg attgcgaagg caggtgacta actatatact gacgctgatg 720

gacgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780

gatactagct gtccgggtcc ttgagacctg ggcggccaag cgaaagtgat aagtatccca 840

cctggggagt acgttcgcaa gaatgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg 900

gtggagcatg tggtttaatt cgatgatacg cgaggaacct taccagggct taaatgcatt 960

ttgacagggg tagagatacc ttttccttcg ggcaatttgc 1000

Claims

1.产褐藻胶裂解酶的黄杆菌B2，其特征在于，所述的黄杆菌B2的分类命名为Zobelliasp. B2，于2019年03月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.17354。

2.如权利要求1所述的产褐藻胶裂解酶的黄杆菌B2在产褐藻胶裂解酶中的应用。

3.根据权利要求2所述产褐藻胶裂解酶的黄杆菌B2在产褐藻胶裂解酶中的应用，其特征在于：黄杆菌B2产褐藻胶裂解酶的方法，包括以下步骤：

挑取平板上的黄杆菌进行三区划线，将三区划线后的平板放置28℃生化培养箱中培养24h；挑取平板上的黄杆菌接种于装有2216E液体培养基的锥形瓶中进行培养，在28℃，转速为180rpm的摇床上培养12-16h至对数中后期，得到种子液；

（2）将步骤（1）制备的种子液接种于装有发酵培养基的锥形瓶中进行培养，在28℃，pH7.2，转速为180rpm的摇床上培养36h，得到褐藻胶裂解酶发酵液。

4.根据权利要求3所述产褐藻胶裂解酶的黄杆菌B2在产褐藻胶裂解酶中的应用，其特征在于：步骤（1）中所述2216E固体平板培养基配方为：蛋白胨5g/L、酵母粉1g/L、六水合氯化铁0.0018g/L，氯化钠 26.5g/L、氯化钾0.9g/L、氯化钙1.03g/L、七水硫酸镁4.2g/L，琼脂20g/L；2216E固体平板培养基配方中不添加琼脂为2216E液体培养基。

5.根据权利要求3所述产褐藻胶裂解酶的黄杆菌B2在产褐藻胶裂解酶中的应用，其特征在于：步骤（2）中所述发酵培养基配方为：海藻酸钠5g/L、蛋白胨2g/L、磷酸氢二钾 1g/L、氯化钠 26.5g/L、氯化钾0.9g/L、氯化钙1.03g/L、七水硫酸镁4.2g/L。

6.根据权利要求3所述产褐藻胶裂解酶的黄杆菌B2在产褐藻胶裂解酶中的应用，其特征在于：所述步骤（2）中以3%的接种量将种子液接种至发酵培养基中。