CN111154673B

CN111154673B - 一株灵菌红素产生菌及其生产方法与应用

Info

Publication number: CN111154673B
Application number: CN202010016487.8A
Authority: CN
Inventors: 刘伟杰; 孙地; 刘聪; 田雁宁; 杨静; 朱静榕; 蒋虹
Original assignee: Jiangsu Normal University
Current assignee: Jiangsu Normal University
Priority date: 2020-01-08
Filing date: 2020-01-08
Publication date: 2021-03-26
Anticipated expiration: 2040-01-08
Also published as: CN111154673A

Abstract

本发明公开了一株灵菌红素产生菌及其生产方法与应用，该灵菌红素产生菌为粘质沙雷氏菌Serratia marcescens BWL1001，保藏编号：CGMCC No.18953，生产灵菌红素的方法包括：种子液的制备；将种子液按1％(v/v)的比例转接到以大豆油作为碳源的发酵培养基中，28℃恒温摇床培养24‑48小时获得发酵液；将发酵液离心，收集上层油相，向油相中加入1～3倍体积pH＝3的酸性甲醇，振荡混匀，静置30min后，离心，收集酸性甲醇相，去除溶剂后得到灵菌红素产品，该灵菌红素对铜绿微囊藻的生长表现出良好的抑制效果。本发明所用的菌株生长速度快，发酵周期短，灵菌红素产量高、生产成本低，对于促进灵菌红素的产业化应用具有重要的推动作用。

Description

一株灵菌红素产生菌及其生产方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一株灵菌红素产生菌及其生产方法与应用。

背景技术

灵菌红素（Prodigiosin）是一种含有三吡咯环结构的天然红色素，具有多种生物活性：它能够选择性地有效抑制多种癌细胞的生长，而对正常细胞的毒性较弱；灵菌红素可以有效抑制器官移植引起的排异反应，可用于治疗自身免疫疾病；灵菌红素及其衍生物对疟原虫和锥虫具有较强的杀灭效果；具有广谱的杀菌作用，能够有效杀灭多种有害细菌和真菌；灵菌红素具有高效的抑藻活性，能杀死引起赤潮和水华的浮游藻类，在水体污染治理上表现出巨大的潜力；此外灵菌红素还可以作为天然染料，用于纺织品和日用品的染色，因此灵菌红素有较高的经济价值和良好的应用前景。

灵菌红素可以通过化学合成和微生物发酵的方法进行生产。化学合成法具有反应步骤多，控制难度大，产率低等缺点，因此不利于大规模生产。而微生物发酵法生产灵菌红素具有条件温和，环境友好和易于大规模工业化生产等优点，因此近年来在国内外研究中受到越来越多的重视。灵菌红素可以由沙雷氏菌属、河氏菌属、假单胞菌属、弧菌属和链霉菌属等多种微生物产生，其中沙雷氏菌属的灵杆菌（Serratia marcescens）因其产生灵菌红素产量相对较高，生物活性较好而成为目前用于生产的主要菌株。

从自然环境中分离获得的原始菌株灵菌红素产量普遍不高，且灵菌红素在产生后大部分与产生菌的菌体相结合，少部分分泌到培养基中，因此提取和纯化较为困难。较低的产量和复杂的提取工艺导致灵菌红素价格昂贵，难于实际应用。因此降低灵菌红素的生产成本成为了限制灵菌红素大规模生产和应用的瓶颈问题。目前科研人员主要通过选育高产菌株、改进培养基配方、优化发酵工艺参数和改善提取工艺等手段来提高灵菌红素的产量和质量。例如，El-Bialy等人通过使用EMS诱变灵菌红素生产菌株，液体发酵分析发现灵菌红素产量由88.4 mg/L提升至658.0 mg/L，提升了6.44倍 (Annals of Microbiology,2015, 65(1): 59-68)；Giri等人使用花生粉培养基替代营养肉汤培养基，将灵菌红素产量由0.52 g/L提升至39 g/L (BMC Microbiology, 2004, 4: 11-18)；de Araujo等人改良了Serratia marcescens UCP 1549的培养基，通过添加6%的木薯废水和2%甘露醇，使得灵菌红素产量达到49.5 g/L (Molecules, 2010, 15: 6931-6940)；Liang等人将发酵容器由普通锥形瓶更换为带有挡板的锥形瓶，将Serratia marcescens TKU011的灵菌红素产量由0.84 g/L提升至2.48 g/L (Journal of Food Science, 2013, 78(11): 1743-1751)。Chen等人通过将Serratia marcescens C3包埋在海藻酸钙凝胶小球中进行固定化发酵，将灵菌红素产量提高至15.6 g/L (Biochemical Engineering Journal, 2013, 78: 93-100)。然而目前的已经报道的生产方法均难以解决灵菌红素提取困难的问题。传统方法提取灵菌红素时，需使用有机溶剂，如丙酮、氯仿、甲醇等抽提培养基，再通过减压蒸馏以获得灵菌红素产品。以上步骤需耗费的有机溶剂量大，操作复杂，能耗较高。有机溶剂的使用不仅会污染环境，而且还会杀死菌体，使得灵菌红素的连续发酵难以实现，降低了灵菌红素的发酵生产效率。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株灵菌红素产生菌。

本发明的目的之二是提供利用上述灵菌红素产生菌原位萃取发酵生产灵菌红素的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一株灵菌红素产生菌，为粘质沙雷氏菌Serratia marcescens BWL1001，该菌株分离自江苏省徐州市铜山区的农田土壤样品，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年11月18日，保藏编号：CGMCC No. 18953，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

所述的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens BWL1001的16S rRNA碱基序列长度为1383 bp，如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供利用上述灵菌红素产生菌原位萃取发酵生产灵菌红素的方法，具体步骤如下：

步骤1、将菌种Serratia marcescens BWL1001接种于种子液培养基中，置于28 ℃恒温摇床内，200 rpm，恒温培养12-16 小时获得种子液；

步骤2、将步骤1中获得的种子液按体积比1%的比例转接到以大豆油作为碳源的发酵培养基中，置于28 ℃恒温摇床内，200 rpm，恒温培养24-48小时获得发酵液；

步骤3、将步骤2中获得的发酵液在6000-10000 rpm转速下离心5 min，收集上层油相，向获得的油相中加入1~3倍体积pH=3的酸性甲醇，振荡混匀，静置30 min后，在6000-10000 rpm转速下离心5 min，收集酸性甲醇相，去除溶剂后得到灵菌红素粗品；

步骤4、再向下层发酵液水相中补加一定比例的新鲜发酵培养基和大豆油，实现后续的连续发酵。

进一步的，步骤1中所述的种子液培养基为酵母膏 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，氯化钠10 g/L。

进一步的，步骤2中所述的发酵培养基为蛋白胨10 g/L，氯化钠 10 g/L，七水硫酸镁 0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.3 g/L，大豆油10% w/v。

本发明的目的之三是提供上述生产得到的灵菌红素在制备抑藻剂方面的应用。

实验表明，将灵菌红素加入含有藻类的水体中，能够抑制藻类的生长，尤其是对铜绿微囊藻的抑制效果明显。因此，灵菌红素可以用来制备抑藻剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明所用的菌株Serratia marcescens BWL1001生长速度快，发酵周期短，灵菌红素产量高；

2.本发明所用的粘质沙雷氏菌可以利用廉价的大豆油作为发酵碳源，有利于提高灵菌红素的产量，降低发酵生产成本，同时大豆油与发酵液水互不相溶，多余的大豆油还可以作为灵菌红素的萃取相，将发酵产生的灵菌红素及时从发酵液水相转移至大豆油相，从而解除了反馈抑制，提高了灵菌红素的发酵产量；该原位萃取发酵方法只需要收集含有灵菌红素的油相，用于提取灵菌红素，可以减少发酵培养基成分对灵菌红素产物的影响，提高灵菌红素产品的纯度；灵菌红素提取过程中只需要回收油相，没有影响菌体的生长，因此可以通过后续向原培养基中补加一定比例的新鲜培养基和大豆油来连续发酵，有利于进一步提高灵菌红素的产量，降低产灵菌红素的生产成本；

3.本发明生产的灵菌红素对铜绿微囊藻的生长表现出良好的抑制效果，该灵菌红素产物可以用于防控水体微藻引起的富营养化。

附图说明

图1是基于16S rRNA基因序列构建的菌株BWL1001系统发育树；

图2是菌株BWL1001的菌落图；

图3是对提取的发酵产物的质谱分析图；

图4是灵菌红素产品对铜绿微囊藻的抑制效果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1菌株BWL1001的分离、鉴定

1.1菌株BWL1001的分离

从江苏省徐州市铜山区的农田采集土壤样品。

将采集的土壤样品用0.9%的无菌生理盐水梯度稀释，然后将稀释液依次涂布在R2A固体培养基上（R2A固体培养基的组成如下：可溶性淀粉0.5 g/L，葡萄糖0.5 g/L，酵母粉0.5 g/L，胰蛋白胨0.5 g/L，酸水解酪蛋白0.5 g/L，MgSO₄•7H₂O 0.05 g/L，K₂HPO₄ 0.3g/L，琼脂粉20 g/L），将涂布好的培养基倒置放入28℃恒温培养箱中，培养24 h后观察发现一株红色菌落。通过四区划线分离法对该菌株经行纯化后，用20%的甘油溶液保存于-80℃冰箱。

1.2菌株鉴定

(1)菌株形态学鉴定：菌株接种在LB固体平板上，30℃培养3天后观察菌落特征，发现菌落呈红色、圆形、表面光滑、边缘整齐、湿润且具有粘性（如图2）。

(2) 16S rRNA基因测序与系统发育分析：从LB固体平板上刮取菌体并提取菌体基因组DNA，用细菌通用引物27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO.2)和1492r：5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'(SEQ ID NO.3)进行16S rRNA基因PCR扩增。PCR反应体系为：模板DNA 2μL，10×buffer 5μL，MgCl₂ (25mmol) 3μL，dNTP(10mmol/L) 1μL，27f(10μmol/L)1μL，1492r(10μmol/L) 1μL，Taq酶(5u/μL)0.5μL，PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工(上海)有限公司测序。测序结果在NCBI上比对初步鉴定具体的属，然后在EzBioCloud网站上调取该属相似性最接近的典型种进行进化树的构建，用Mega 6.0软件进行序列比对及分析，最后用邻接法构建系统进化树并进行系统发育分析。

经测序，菌株BWL1001的16S rRNA碱基序列长度为1383bp，如SEQ ID NO.1所示。16S rRNA基因序列比对发现该菌株属于沙雷氏菌属(Serratia marcescens)的成员，EzBioCloud网站上调取该属相似性最接近的典型种，比对发现与该属有效发表种沙雷氏菌Serratia marcescens ATCC13880的相似性最高，为99.86％，且聚在一个独立的进化分支上（如图1）。因此，综合形态观察以及16S rDNA序列分析，鉴定菌株BWL1001属于沙雷氏菌属的成员，为粘质沙雷氏菌，命名为粘质沙雷氏菌BWL1001 (Serratia marcescensBWL1001)，已于2019年11月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 18953。

实施例2 转化大豆油生产并原位萃取灵菌红素

具体实施方式如下：

步骤1、种子液制备：将菌株Serratia marcescens BWL1001接种至种子液培养基中，种子液培养基组分如下：蛋白胨 10 g/L，氯化钠 10 g/L，七水硫酸镁 0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.3 g/L；然后28℃，200 rpm摇床恒温培养12-16 h；

步骤2、发酵生产灵菌红素：将步骤1获得的种子液按1%(v/v)比例接种至发酵培养基中，发酵培养基组分如下：蛋白胨 10 g/L，氯化钠 10 g/L，七水硫酸镁 0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.3 g/L，大豆油10% (w/v)；然后28℃，200 rpm摇床恒温发酵培养24-48小时；

步骤3、灵菌红素的原位萃取：将发酵液在6000-10000 rpm条件下离心5 min，收集上层油相，向获得的油相中加入1~3倍体积pH=3的酸性甲醇，振荡混匀，静置一段时间，在6000-10000 rpm条件下离心5 min，取上层油相，用旋转蒸发仪蒸发得到灵菌红素粗品。再向下层发酵液水相中补加一定比例的新鲜发酵培养基和大豆油，实现后续的连续发酵。

对所提取的发酵产品粗品的结构鉴定，液质联用分析结果（图3）表明，所提取的发酵产物与灵菌红素标准品的质谱图相符，确定发酵产物为灵菌红素产品。

本方法利用大豆油作为发酵碳源，大豆油与发酵液水互不相溶，多余的大豆油可以作为灵菌红素的萃取相，将发酵产生的灵菌红素及时从发酵液水相转移至大豆油相，而菌体仍保留在发酵液水相中，提取灵菌红素时不会对菌体产生影响。采用本实施例提供的制备方法，灵菌红素的产量可达到27g/L以上。

实施例3

利用发酵获得的灵菌红素产物进行抑藻实验分析，其中铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）培养于TAP液体培养基中，添加不同浓度（0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1μg/mL、3 μg/mL）的灵菌红素，并在48 h后，测定培养液中藻细胞的浓度。抑藻率的计算方法如下：（C0-Cp）/C0*100%，其中C0表示不加入灵菌红素时培养液中藻细胞的浓度；Cp表示加入不同浓度灵菌红素的培养液中藻细胞的浓度。

结果如图4所示，可以看到该灵菌红素对铜绿微囊藻的生长表现出良好的抑制效果，当灵菌红素的产物用量达到1 μg/mL以上时，铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）的抑藻率达到80%以上，表明该灵菌红素产物可以用来制备抑藻剂，用于防控水体微藻引起的富营养化。

序列表

<110> 江苏师范大学

<120> 一株灵菌红素产生菌及其生产方法与应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1383

<212> DNA

<213> 粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)

<400> 1

cgagcggtag cacaggggag cttgctcccc gggtgacgag cggcggacgg gtgagtaatg 60

tctgggaaac tgcctgatgg agggggataa ctactggaaa cggtagctaa taccgcataa 120

cgtcgcaaga ccaaagaggg ggaccttcgg gcctcttgcc atcagatgtg cccagatggg 180

attagctagt aggtggggta atggctcacc taggcgacga tccctagctg gtctgagagg 240

atgaccagcc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 300

aatattgcac aatgggcgca agcctgatgc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggccttc 360

gggttgtaaa gcactttcag cgaggaggaa ggtggtgaac ttaatacgtt catcaattga 420

cgttactcgc agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg 480

tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcacgc aggcggtttg ttaagtcaga 540

tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact gcatttgaaa ctggcaagct agagtctcgt 600

agaggggggt agaattccag gtgtagcggt gaaatgcgta gagatctgga ggaataccgg 660

tggcgaaggc ggccccctgg acgaagactg acgctcaggt gcgaaagcgt ggggagcaaa 720

caggattaga taccctggta gtccacgctg taaacgatgt cgatttggag gttgtgccct 780

tgaggcgtgg cttccggagc taacgcgtta aatcgaccgc ctggggagta cggccgcaag 840

gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 900

gatgcaacgc gaagaacctt acctactctt gacatccaga gaactttcca gagatggatt 960

ggtgccttcg ggaactctga gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaaa 1020

tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttatcctt tgttgccagc ggttcggccg 1080

ggaactcaaa ggagactgcc agtgataaac tggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat 1140

catggccctt acgagtaggg ctacacacgt gctacaatgg catatacaaa gagaagcgac 1200

ctcgcgagag caagcggacc tcataaagta tgtcgtagtc cggattggag tctgcaactc 1260

gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gtagatcaga atgctacggt gaatacgttc 1320

ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgcaaaag aagtaggtag 1380

ctt 1383

Claims

1.一株灵菌红素产生菌，其特征在于：该菌为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）BWL1001，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年11月18日，保藏编号：CGMCC No. 18953，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2.一种利用权利要求1所述的灵菌红素产生菌生产灵菌红素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、将菌种粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）BWL1001接种于种子液培养基中，置于28 ℃恒温摇床内，200 rpm，恒温培养12-16 小时获得种子液；

步骤3、将步骤2中获得的发酵液在6000-10000 rpm转速下离心5 min，收集上层油相，向获得的油相中加入1~3倍体积pH=3的酸性甲醇，振荡混匀，静置30 min后，在6000-10000rpm转速下离心5 min，收集酸性甲醇相，去除溶剂后得到灵菌红素粗品；

步骤4、再向下层发酵液水相中补加新鲜发酵培养基和大豆油，实现后续的连续发酵。

3.根据权利要求2所述的灵菌红素产生菌生产灵菌红素的方法，其特征在于，步骤1中，所述的种子液培养基为：蛋白胨 10 g/L，氯化钠 10 g/L，七水硫酸镁 0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.3 g/L。

4.根据权利要求2所述的灵菌红素产生菌生产灵菌红素的方法，其特征在于，步骤2中，所述的发酵培养基为：蛋白胨 10 g/L，氯化钠 10 g/L，七水硫酸镁 0.5 g/L，磷酸氢二钾0.3 g/L，大豆油10% w/v。