CN112961817B

CN112961817B - 一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法

Info

Publication number: CN112961817B
Application number: CN202110367896.7A
Authority: CN
Inventors: 甘雨满; 高程海; 唐振洲; 刘锴; 黄炳耀; 刘永宏
Original assignee: Guangxi University of Chinese Medicine
Current assignee: Guangxi University of Chinese Medicine
Priority date: 2021-04-06
Filing date: 2021-04-06
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2041-04-06
Also published as: CN112961817A

Abstract

本发明公开了一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法，本发明以显著抑制野生海洋芽孢杆菌生长的50g/L海盐渗透压为初始筛选压力驯化目标菌株，经过多次传代培养使菌株适应该浓度海盐渗透压胁迫之后，将海盐浓度提高至60g/L开始新一轮驯化，以此类推。当海盐浓度提高至Ng/L时菌株无法生长，终止驯化过程。取(N‑10)g/L海盐胁迫的驯化菌液涂布含(N‑10)g/L海盐的ISP2固体培养基，即可获得高比例的高产Macrolactins突变菌株。本发明以适当浓度的海盐渗透压胁迫作为筛选压力结合适应性驯化策略，高效选育高产Macrolactins海洋芽孢杆菌突变菌株，解决这类菌株在选育优良菌种资源的过程中缺乏高效筛选标记的困境。

Description

一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法

技术领域

本发明属于微生物育种技术领域，具体来说涉及一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法。

背景技术

Macrolactins为24元大环内酯类化合物，主要来源于海生Bacillus sp.和Actinomadura sp.，包含超过32种单体化合物，表现抗病毒、抗肿瘤和抗病菌等多种生物抑制活性，是一类具有广谱生物抑制活性的化合物，在疾病治疗、农业病虫害生物防治等领域具有广阔的应用潜力。Borriss研究团队通过分析Bacillus amyloliquefaciens FZB42基因组，首次确认了PKS I型基因簇参与Macrolactins的合成。整个基因簇大小约54kb，共由11个模块组成，每个模块至少包括酰基转移酶、酮基合成酶和酰基载体蛋白三个元件。每个元件在Macrolactins碳骨架的合成过程中承担着不同的生物功能，酰基转移酶负责底物的激活和运转；酮基合成酶负责延伸聚酮链；酰基载体蛋白负责将完成延伸二个碳原子的聚酮链运转到下一模块，具体合成过程与脂肪酸碳骨架的合成过程类似。

尽管Macrolactins生物合成过程基因簇已经被成功解析，但其合成的分子调控机理和关键基因至今仍没有得到系统的解析，一定程度上限制了利用现代分子生物学技术来改善海洋芽孢杆菌的Macrolactins代谢性能。传统微生物育种技术包括理化诱变、Genomeshuffling、适应性驯化等可在遗传背景不清晰的条件下提升微生物代谢性能，但利用这类育种技术在选育优良Macrolactins代谢突变菌株时，仍需要面临不少障碍，最大问题是至今尚无高效的筛选标记应用于筛选优良Macrolactins代谢突变菌株。Yi X等人利用常压室温等离子体诱变技术(Atmospheric Room Temperature Plasma，ARTP)处理海洋芽孢杆菌，提高其Macrolactins代谢性能(Yi X,Gan Y,Jiang L,et al.Rapid improvement in themacrolactins production ofBacillus sp.combining atmospheric room temperatureplasma with the specific growth rate index[J].Journal ofBioscience andBioengineering,2020,130(1).)。具体操作过程如下：利用ARTP诱变技术处理菌株后涂布平板，根据平板上单菌落形态差异挑选出具有特异性菌落形态的菌株，进一步比较这部分菌株的生长速率差异，筛选出生长较快的突变菌株，最后通过发酵结合HPLC检测挑选出最佳突变菌株。虽然作者最终获得一株Macrolactins产量提升约50％的突变菌株，但整个筛选过程较为繁琐，可靠性不高，最终的筛选效率也仅为6.67％。简单而言，利用该策略选育优良海洋芽孢杆菌主要包括三个筛选指标：菌落形态、生长和代谢，可见利用该策略完成微生物育种工作强度较大、效率低，且由于菌落形态不再发生变化的原因育种工作最终只能实现第一轮诱变，不利于菌株代谢性能的进一步提升。

综上所述，对于遗传背景不清晰的产Macrolactins海洋芽孢杆菌而言，传统微生物育种策略是理想的手段，而无法确定有效的筛选标记一定程度上阻碍了该类菌种资源的育种进程。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法，按照下述步骤进行：

步骤一、实验器材及培养基准备

实验器材包括培养基瓶A、驯化瓶B和废液瓶C，将培养基瓶A和驯化瓶B之间、驯化瓶B与废液瓶C之间分别利用硅胶管相连通并借助于蠕动泵导流，驯化瓶B置于磁力搅拌水浴锅内、瓶内放置磁力转子；向培养基瓶A内倒入初始驯化培养基，将25-35mL初始驯化培养基转移至驯化瓶B；

步骤二、第一轮驯化

取海洋芽孢杆菌野生菌株接种于ISP2种子培养基，200rpm、37℃培养至对数生长期，取1mL种子菌液接种至驯化瓶B中，于100rpm、37℃培养，当驯化瓶B中菌液OD₆₀₀达到0.8-1.2后，将驯化瓶B中菌液排至废液瓶C并留约1mL作为下次驯化的种子液，从培养基瓶A导入25-35mL初始驯化培养基进行下一次驯化，直至用完培养基瓶A中培养基即完成第一轮驯化，取5mL菌液-80℃保存；

步骤三、迭代驯化

在完成上一轮驯化后，按10g/L梯度提高驯化培养基中海盐浓度并以上一轮经活化后的菌株作为种子细胞进行下一轮驯化，以此类推直至菌株无法在N g/L海盐渗透压胁迫条件下生长，终止驯化过程；

步骤四、优良突变菌株富集

将(N-10)g/L海盐渗透压胁迫驯化菌液重新在(N-10)g/L海盐渗透压胁迫条件下驯化一轮，避免菌株发生回复突变；再将菌液接种于正常ISP2发酵培养基传代20代(12h/代)，排除因胁迫条件下基因差异表达而形成的假阳性菌株；之后取100mL细胞光密度为0.9×10^-5菌液涂布含(N-10)g/L海盐的ISP2发酵固体培养基，37℃培养即可根据菌落形态获得高比例的优良突变菌株。

在上述技术方案中，在步骤一中，所述初始驯化培养基的配方如下所述：酵母膏10g/L，麦芽提取物6g/L，葡萄糖50g/L，海盐50g/L，121℃灭菌20min。

在上述技术方案中，在步骤二中，所述ISP2种子培养基的配方如下所述：酵母膏2g/L，麦芽提取物2g/L，葡萄糖2g/L，海盐30g/L，121℃灭菌20min。

在上述技术方案中，在步骤四中，所述ISP2发酵培养基的配方如下所述：酵母膏10g/L，麦芽提取物6g/L，葡萄糖50g/L，海盐30g/L，121℃灭菌20min。

在上述技术方案中，在步骤四中，所述ISP2发酵固体培养基的配方如下所述：酵母膏10g/L，麦芽提取物6g/L，葡萄糖50g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min。

在上述技术方案中，所述海盐是以海水(北方有的是用地下卤水)为原料制成的盐，主要成分为氯化钠，含有氯化镁等杂质，用以为海洋芽孢杆菌的生长提供不同的渗透压。

在上述技术方案中，所述一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法还包括：步骤五、平板划线：将步骤四中长出的单菌落划线分离，之后置于生化培养箱培养，得到纯菌株。

在上述技术方案中，所述一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法还包括：步骤六、活化：取长出的菌落接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，之后置于摇床中振荡培养。

在上述技术方案中，所述一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法还包括：步骤七、测序鉴定：将步骤六中的菌液进行总DNA提取，并用细菌16SrDNA通用引物进行扩增，进而进行测序鉴定。

本发明的优点和有益效果为：

本发明以显著抑制野生海洋芽孢杆菌生长的50g/L海盐渗透压为筛选压力驯化目标菌株，经过多次传代培养使菌株适应该浓度海盐渗透压胁迫之后，将海盐浓度提高至60g/L开始新一轮驯化，以此类推。当海盐浓度提高至N g/L时菌株无法生长，终止驯化过程。取(N-10)g/L海盐胁迫的驯化菌液涂布含(N-10)g/L海盐的ISP2固体培养基，即可获得高比例的高产Macrolactins突变菌株。

本发明以适当浓度的海盐渗透压胁迫作为筛选压力结合适应性驯化策略，高效选育高产Macrolactins海洋芽孢杆菌突变菌株，解决这类菌株选育优良菌种资源的过程中缺乏高效筛选标记的困境。本发明的创新点在于将海洋芽孢杆菌的海盐渗透压胁迫耐受性与Macrolactins代谢性能相偶联，以海盐渗透压胁迫为筛选标记高效富集、筛选高性能海洋芽孢杆菌突变菌株。

附图说明

图1为本发明一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法的流程图。

图2为本发明中一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法所采用的实验器材连接示意图。

图3A为经驯化含有突变型菌株的平板。

图3B为野生菌株的平板。

对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实施例

在下述实施例中，除另外说明外，仪器及试剂均为市售产品，其中值得特别说明的是，海盐是指以海水(北方有的是用地下卤水)为原料制成的盐，主要成分为氯化钠，含有氯化镁等杂质，用以为海洋芽孢杆菌的生长提供不同的渗透压，本实施例采用粤盐牌大粒盐未加碘日晒盐，购自广东盐业集团广州有限公司。

1、初始驯化培养基准备：以ISP2发酵培养基(酵母膏10g/L，麦芽提取物6g/L，葡萄糖50g/L，海盐50g/L)配制1L总海盐浓度为50g/L的驯化培养基(该浓度下显著抑制野生菌株生长)，倒入1000mL蓝盖瓶(A瓶)，通过硅胶管将A瓶与另一个100mL蓝盖瓶(B瓶)相连，121℃灭菌20min。待冷却后，以硅胶管为导管借助于蠕动泵将30mL驯化培养基转移至B瓶，并加入无菌磁力转子，如图2所示。

2、野生菌株第一轮驯化：海洋芽孢杆菌野生菌株接种于ISP2种子培养基(酵母膏2g/L，麦芽提取物2g/L，葡萄糖2g/L，海盐30g/L)，200rpm、37℃培养至对数生长期。取1mL种子细胞接种至B瓶，并置于恒温磁力搅拌水浴锅中100rpm、37℃培养。当B瓶中菌液OD₆₀₀达到1.0后，将B瓶中菌液排至废液瓶(C瓶)并留约1mL作为下次驯化的种子细胞，从A瓶导入约30mL驯化培养基进行下一次驯化，直至用完A瓶中培养基即完成第一轮驯化，取5mL菌液-80℃保存。

3、迭代驯化：在完成上一轮驯化后，按10g/L梯度提高驯化培养基中海盐浓度并以上一轮经活化后的菌株作为种子细胞进行下一轮驯化，以此类推直至菌株无法在80g/L海盐渗透压胁迫条件下生长，终止驯化过程。

4、优良突变菌株富集：将70g/L海盐渗透压胁迫驯化菌液重新在70g/L海盐渗透压胁迫条件下驯化一轮，避免菌株发生回复突变；再将菌液接种于正常ISP2发酵培养基传代20代(12h/代)，排除因胁迫条件下基因差异而形成的假阳性菌株；之后取100μL细胞光密度为0.9x10^-5菌液涂布含70g/L海盐的ISP2发酵固体培养基，37℃培养即可根据菌落形态获得高比例的优良突变菌株。

5、发酵评价：-80℃保存菌株接种于ISP2种子培养基200rpm、37℃活化，活化后的菌株于ISP2种子固体培养基(20g/L琼脂粉)划线分单菌落。挑单菌落接种于10mL ISP2种子培养基200rpm、37℃培养过夜(12h-16h)获得种子细胞。种子细胞按起始细胞光密度值为0.1接种量接种于200mL ISP2发酵培养基，200rpm、37℃发酵培养64h。

6、Macrolactins HPLC检测：试管中按体积比1:2比例分别加入发酵液和100％甲醇，室温静置，每隔10min手动震荡试管使溶液充分混匀。30min后EP管收集混合液12000rpm离心10min，收集上清液，用0.22μm有机滤膜过滤制备HPLC检测样品。HPLC检测检测条件：日本岛津高效液相色谱仪(Prominence LC-2030C 3D)，检测波长227nm，XB-C18型色谱柱(4.6×250mm)，进样量100μL，低压梯度洗脱(50％甲醇0-7min，65％甲醇7min-12min，80％甲醇12min-32min，100％甲醇32min-36min，50％甲醇36min-40min，50％甲醇40min-45min)。

结果与分析

1、图3A为涂布有经驯化含有突变型菌株的平板，图3B为野生菌株的平板。筛选平板中出现两种菌落形态，一种菌落形态扁平、表面粗糙、较干燥、边缘有不规则的锯齿状(图3A圆形标注)，这类菌落形态与野生菌株的菌落形态类似(图3B)；另一种菌落为乳白色，表面光滑、湿润、粘稠、凸起、边缘整齐(图3A三角形标注)。从菌落形态差异初步判断，图3A圆形标注的菌落为野生型菌株，三角形标注的菌落为突变型菌株，占比为89±4％。

2、随机挑取三株突变菌株即光滑单菌落，分别编号为IMD4001、IMD4002和IMD4003，经16S rRNA测序表明，以上三株菌株的16S rRNA与野生菌株的相似度为100％。三株菌株发酵培养64h后，其代谢性能如表1所示。在正常ISP2发酵培养基(无海盐渗透压胁迫)条件下，三株突变菌株Macrolactins代谢产量分别为78.89±2.81g/mL、69.47±0.49g/mL和70.81±3.15g/mL，代谢性能均优于野生菌株，其中IMD4001代谢性能比野生菌株提高30.46％。

表1突变菌株代谢活性评价

结合菌落形态差异、16S rRNA序列分析以及菌株代谢性能评价，确定光滑单菌落的菌株均为代谢性能获得提升的突变菌株，即经过不同浓度的海盐渗透压胁迫驯化后菌株的Macrolactins代谢活性获得显著增加，且有效突变菌的占比为89±4％，极大提高了育种过程中优良突变菌株的筛选效率。

3、本发明完成一次育种过程共历时约65天，尽管周期较长但借助于密闭的驯化系统和蠕动泵，有效降低了整个育种过程的劳动强度，操作上具有较高可行性和便捷性。

以上结果表明，本发明以海盐渗透压胁迫为筛选压力结合适应性驯化策略，可高效筛选获得Macrolactins代谢活性显著提升的海洋芽孢杆菌突变菌株。根据驯化后菌株的菌落形态差异(图3A)，以光滑菌落的菌株为筛选对象筛选优良突变菌株，其筛选效率值为100％(表1)，远高于Yi X等人建立的筛选策略(6.67％)，且本发明操作上更具可行性和便捷性。此外，本发明表明海洋芽孢杆菌Macrolactins代谢活性与该菌株对海盐渗透压胁迫耐受性相偶联，因此，海洋芽孢杆菌对海盐渗透压胁迫的耐受性可以作为其他传统微生物育种策略(理化诱变、Genome shuffling等)育种过程的筛选标记，实现迭代多轮突变并最终最大化提升海洋芽孢杆菌Macrolactins代谢水平。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用海盐渗透压胁迫筛选高产Macrolactins海洋芽孢杆菌的方法，其特征在于：按照下述步骤进行：

步骤一、实验器材及培养基准备

实验器材包括培养基瓶A、驯化瓶B和废液瓶C，将培养基瓶A和驯化瓶B之间、驯化瓶B与废液瓶C之间分别利用硅胶管相连通并借助于蠕动泵导流，驯化瓶B置于磁力搅拌水浴锅内、瓶内放置磁力转子；向培养基瓶A内倒入初始驯化培养基，所述初始驯化培养基的配方如下所述：酵母膏10g/L，麦芽提取物6g/L，葡萄糖50g/L，海盐50g/L，121℃灭菌20min；将25-35mL初始驯化培养基转移至驯化瓶B；

步骤二、第一轮驯化

取海洋芽孢杆菌野生菌株接种于ISP2种子培养基，所述ISP2种子培养基的配方如下所述：酵母膏2g/L，麦芽提取物2g/L，葡萄糖2g/L，海盐30g/L，121℃灭菌20min；200rpm、37℃培养至对数生长期，取1mL种子菌液接种至驯化瓶B中，于100rpm、37℃培养，当驯化瓶B中菌液OD₆₀₀达到0.8-1.2后，将驯化瓶B中菌液排至废液瓶C并留1mL作为下次驯化的种子液，从培养基瓶A导入25-35mL初始驯化培养基进行下一次驯化，直至用完培养基瓶A中培养基即完成第一轮驯化，取5mL菌液-80℃保存；

步骤三、迭代驯化

步骤四、优良突变菌株富集

将(N-10)g/L海盐渗透压胁迫驯化菌液重新在(N-10)g/L海盐渗透压胁迫条件下驯化一轮，避免菌株发生回复突变；再将菌液接种于正常ISP2发酵培养基传代20代，所述ISP2发酵培养基的配方如下所述：酵母膏10g/L，麦芽提取物6g/L，葡萄糖50g/L，海盐30g/L，121℃灭菌20min；排除因胁迫条件下基因差异而形成的假阳性菌株；之后取100mL细胞光密度为0.9×10^-5菌液涂布含(N-10)g/L海盐的ISP2发酵固体培养基，所述ISP2发酵固体培养基的配方如下所述：酵母膏10g/L，麦芽提取物6g/L，葡萄糖50g/L，琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min；37℃培养即可根据菌落形态获得高比例的优良突变菌株。