CN112175887B - 一种油短波单胞菌菌株及其应用 - Google Patents

一种油短波单胞菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种油短波单胞菌(Brevundimonas olei)菌株及其应用，该菌株为一种大丽轮枝菌内共生菌，其保藏号为CCTCC NO：M 2020392。采用形态学鉴定、多样性测序分析确定该菌株为Brevundimonas olei，通过共培养实验探究B.olei发酵液对大丽轮枝菌生长及微菌核的影响。扫描电镜观察，随培养时间及发酵液浓度增加大丽轮枝菌分生孢子形成减少，菌丝形态发生膨胀、破裂、异型，微菌核逐渐减少消失，该研究证明共生B.olei对大丽轮枝菌有较好抑菌活性。

Description

一种油短波单胞菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物种质资源的开发与利用技术领域。具体地说是一种油短波单胞菌菌株及其应用。
背景技术
微生物与其他个体之间存在着复杂的共生关系，这种共生现象广泛存在于微生物与微生物之间，微生物与植物、微生物与动物。共生菌是自然界中存在的普遍现象，且共生菌宿主类型多样，能与不同动物、植物、珊瑚、大型真菌、蚜虫、藻类等寄主共生，参与或者决定宿主某些特性。共生菌能为植物固氮、能为植物提供营养、能参与宿主次生代谢的合成、能协助宿主适应极端环境，共生菌分泌多种活性物质促进或破坏宿主生长，改变宿主的表型和代谢。
据相关文献报道，病原菌内共生菌与病原菌致毒致病性有一定关联，尤其是水稻立枯病的病原菌根霉菌，其毒素的产生是由其内共生菌-伯克霍尔德菌产生而导致水稻病害发生，Fusarium对尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)的拮抗作用不是其本身，而是Fusarium的共生体。
棉花黄萎病主要是由大丽轮枝菌引起的土传真菌维管束病害，严重影响连作棉田产量及棉花品质，制约了棉花产业健康持续发展，由大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病是否存在此类共生关系未见相关报道。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种油短波单胞菌菌株及其应用。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
一种油短波单胞菌(Brevundimonas olei)菌株，该菌株为一种大丽轮枝菌内共生菌，其保藏号为CCTCC NO：M 2020392。
一种微生物制剂，含权利要求1所述的油短波单胞菌菌株的无菌培养液。
上述微生物制剂，将所述油短波单胞菌菌株接种于LB培养基中，37℃，180r·min-1，培养16-24h，6000r·min-1离心10min，取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌2-3次，分装，置于4℃冰箱保存备用，得到微生物制剂。
上述微生物制剂，所述油短波单胞菌菌株加入LB培养基后，该油短波单胞菌菌株的质量浓度为10％-50％。
上述油短波单胞菌菌株在防治植物真菌病害中的应用，所述真菌为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)。
上述油短波单胞菌菌株在防治棉花黄萎病上的应用。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
采集南疆棉区发病棉田黄萎病株，从中分离大丽轮枝菌，通过破壁分离，从大丽轮枝菌中分离出一株内共生菌，鉴定为油短波单胞菌(Brevundimonas olei)菌株，油短波单胞菌菌株的存在是否对大丽轮枝菌的繁殖体和致病性产生影响，是本发明研究的主要目的。
采用形态学鉴定、多样性测序分析确定该菌株为Brevundimonas olei。
离体实验：取B.olei菌液及无菌发酵液通过共培养方式探究该菌株对大丽轮枝菌形态及抑菌率影响，研究发现不同浓度B.olei菌液、发酵液均对大丽轮枝菌产生抑制作用。共培养15d，50％浓度的B.olei菌液可以完全抑制微菌核产生，使得大丽轮枝菌由原来菌核型转变为菌丝型，其发酵液抑菌率最高达到61.30±0.54％。
盆栽实验：接种15-30d处理组棉花黄萎病病指差异较大。不含共生菌的大丽轮枝菌发酵液施加到棉苗中，病情指数为69.75，接种B.olei 30d棉苗与其他处理组相比无发病症状，病指统计结果为0，即B.olei无致病力。由温室盆栽实验结果可知，B.olei对棉花黄萎病的致病性有较好抑制作用。
电镜观察：随培养时间及发酵液浓度增加大丽轮枝菌分生孢子形成减少，菌丝形态发生膨胀、破裂、异型，微菌核逐渐减少消失。大丽轮枝菌微菌核减少或不产生都会降低其致病力，黄萎病害相应减轻，该研究证明共生B.olei对大丽轮枝菌有较好抑菌活性。
附图说明
图1A真菌引物鉴定4株黄萎病菌4株黄萎病菌PCR扩增结果；(M marker 2KPlusII；lane1空白对照；lane2 10-4；lane3 36928；lane4 29-16；lane5 JZ708)；
图1B细菌引物鉴定4株黄萎病菌4株黄萎病菌PCR扩增结果；(M marker 2KPlusII；lane1空白对照；lane2 10-4；lane3 36928；lane4 29-16；lane5 JZ708；lane6阳性对照)；
图2棉花黄萎病菌株物种组成及丰度分析(A10-4；B 29-16；C 36928；D JZ708)；
图3共生菌形态学鉴定(A共生菌菌落形态；B光学显微镜；C扫描电镜；D革兰染色)；
图4基于16S rDNA基因序列构建的4株内生菌与其相邻菌株的neighbour-joining系统进化树；
图5共生菌与大丽轮枝菌摇瓶共培养；(50％、20％和10％稀释后的内共生菌菌液加入Czapek液体培养基中分别培养5天、10天和15天大丽轮枝菌生长状态，其中对照CK为不加B.olei菌液)；
图6共生菌与大丽轮枝菌共培养菌落形态；50％、20％和10％稀释后的内共生菌菌液接种到棉花黄萎病菌菌饼后观察大丽轮枝菌形态图，A为5天观察时的固体平板的正反面照片；B为10天观察时的固体平板的正反面照片；C为15天观察时的固体平板的正反面照片；D为抑菌圈面积统计图)；
图7扫描电镜观察B.oleid对大丽轮枝菌形态影响(A为B.olei菌液共培养电镜图，B为B.olei无菌发酵液共培养电镜图)；
图8盆栽实验棉株生长情况，(A.V.dahliae36928、B.symbiont-free36928抗生素除去共生菌、C.V.dahliae36928+symbiont-free36928、D.B.olei、E.无菌水空白对照)。
具体实施方式
实施例1：黄萎病原菌分子生物学鉴定
黄萎病原菌DNA的提取：取黄萎病菌丝，液氮速冻破壁，研磨成粉，转移到1.5mL离心管中；加入700μL预热到65℃的CTAB缓冲液，65℃水浴50min，其间每隔10min将离心管上下颠倒，使菌丝粉末和缓冲液充分混匀；离心机提前预冷至4℃，12000rpm离心15min；取出离心管将上清液转移到新的离心管中，加入DNA抽提液Ⅰ600μL，混合均匀后12000rpm离心15min；吸取上清液转移到新的离心管中，重复上述步骤；将上清液转移到新的离心管中，加入DNA抽提液Ⅱ600μL，混合均匀后，12000rpm离心15min；取出离心管，吸取上清液到新的离心管中，加入预冷的异丙醇600μL，混合均匀后放置于-20℃冰箱中静置30min；取出离心管，12000rpm离心15min；去掉上清液，离心管中加入600μL 70％的乙醇溶液将沉淀洗涤两次；在无菌风中将沉淀吹干，加入30～50μL的ddH2O溶解所提取的DNA沉淀，-20℃保存备用。
真菌引物鉴定4株黄萎病菌(所用引物为真菌rDNA-ITS序列PCR扩增通用引物ITS1/ITS4)：
扩增体系：PCR mix 12.5μL，ITS1(10μmoL/L)1μL，ITS4(10μmoL/L)1μL，DNA模板(10ng/μL)1μL，ddH2O补至25μL。
PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸7min，4℃保存。
利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，凝胶成像系统分析，通过PCR验证，使用引物ITS1/ITS4扩增得到550bp单一目的条带(图1A)，PCR产物送至上海生工测序，所得序列进行BLAST同源性比对，即10-4、36928、29-16、JZ708黄萎病菌株为真菌。
细菌引物鉴定4株黄萎病菌(引物为16S引物通用，27F/1492R)扩增体系：10×buffer 2.5μL，10μM dNTPs 0.5μL，10μM primer F 0.5μL，10μM primer R 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.1μL，模板DNA 0.5μL，ddH2O 20.4μL。
PCR反应条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，72℃总延伸8min，共35个循环，4℃保存。
1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，细菌引物检测出1500bp目的条带(图1B)，证明4株黄萎病菌株中存在与其共生的细菌，寄送PCR产物进行测序比对，分析其分类学地位。
实施例2：4株棉花黄萎病菌多样性检测
微生物组总DNA提取：采用DNeasy PowerWater Kit试剂盒进行抽提，使用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')对细菌16SrDNA V3-V4区进行PCR扩增。
PCR扩增子用Agencourt AMPure Beads(Beckman Coulter，Indianapolis,IN)纯化，并使用PicoGreen dsDNA分析试剂盒进行定量。进行单独的定量步骤后，将扩增子等量合并，并使用Illlumina MiSeq平台和MiSeq Reagent Kit v3进行双末端2×300bp测序。
生物信息学与统计分析：采用微生物生态学定量流程处理测序数据。低质量序列通过以下标准过滤：长度<150bp的序列，平均Phred得分<20的序列，包含不明确碱基，以及包含>8bp的单核苷酸重复序列。配对末端读取使用FLASH组装。在进行嵌合体检测后，UCLUST(Edgar 2010)将剩余的高质量序列以97％的序列同一性聚类为可操作的分类单位(OTU)。使用默认参数从每个OTU中选择一个代表性序列。
序列数据分析主要使用QIIME和R软件包(v3.2.0)进行。OTU级Alpha多样性指数，例如Chao1丰富度估算器，ACE指标(基于丰度的覆盖率估算器)，使用QIIME中的OTU表来计算Shannon多样性指数和Simpson指数。OTU级别生成了等级丰度曲线，以比较样品之间OTU的丰富度和均匀度。使用UniFrac距离度量标准进行了Beta多样性分析，以调查样品之间微生物群落的结构变化。还基于属水平的组成概况进行了主成分分析(PCA)(Ramette 2007)。通过PERMANOVA(方差的变异多元分析)和ANOSIM(相似性分析)评估各组之间微生物群落结构分化，结果显示4个样品均检测出Brevundimonas属(短波单胞菌属)，每个样品中Brevundimonas属含量为A(10-4)34％、B(29-16)80％、C(36928)31％、D(JZ708)30％(图2)，且含量最高的B样品为菌丝型不产微菌核，其余3个样品属于菌核型，由此可以推断黄萎病菌株中Brevundimonas含量与菌株的菌丝、菌核有关，且菌丝型黄萎菌株中Brevundimonas含量较多。
实施例3：4株棉花黄萎病内共生细菌分离鉴定
内共生细菌分离及形态学鉴定：培养7-10d的棉花黄萎病菌，接种针刮取火柴头大小的黄萎病菌，采用一般机械破壁法，放入冷冻的研钵中，液氮速冻研磨破壁。梯度稀释，取30μL不同浓度梯度菌液涂布与于LA培养基中，37℃，培养16-24h，通过形态特征对分离得到的共生菌菌株进行初步鉴定，在LB培养基上生长，共生细菌菌落乳黄色、中心凸起、表面有光泽、粘稠(图3A所示)。
用接种针挑取内共生菌菌落，置于载玻片上，加2μL无菌水将菌落分散，显微镜下观察菌株的形态，40倍显微镜下观察，呈短小杆状形态(图3B)。取LB培养基中培养16h内共生菌液，离心，弃上清液，收集菌体；前固定，取500-1000μL 5％戊二醛固定液加入内共生菌体中，4℃过夜固定；梯度脱水，30％乙醇，300-500uL，抽吸混匀，脱水15-20min，离心，弃上清，50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇、95％乙醇脱水，重复上述步骤；100％乙醇，脱水两次，每次15-20min，离心，弃上清；100％乙醇：100％丙酮(1:1)，脱水15-20min，离心，弃上清；100％丙酮，脱水两次，每次15-20min，离心，弃上清；使用临界点干燥仪，干燥脱水；离子溅射仪进行溅射镀膜，扫描电镜观察，扫描电镜观察，菌体为短杆状(图3C)。革兰氏染色：涂片固定、草酸铵结晶紫染1min、蒸馏水冲洗、加碘液覆盖涂面染1min后水洗、95％脱色约20秒后水洗、蕃红染色液染1min后，蒸馏水冲洗。干燥，镜检，菌体呈红色，即革兰染色为阴性(图3D)。
内共生细菌分子生物学鉴定：离心收集菌体，12000rpm 10min，弃上清。加150μLsolution I，混匀菌体。加300μL solution II，轻微晃动。加230μL solution III，震荡混匀，出现乳白色絮状物。取上清到新EP管中，加5μL RNAsa，加酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)100μL，离心12000rpm 10min，取上清，加100μL氯仿震荡混匀，12000rpm，10min。取上清到新EP管中，加等体积异丙醇，-20℃静置30min。12000rpm，10min，弃上清，70％乙醇洗涤2次，烘干后，加30μL ddH2O，-20℃保存备用。
内共生菌PCR验证：扩增体系10×buffer 2.5μL，10μM dNTPs 0.5μL，10μM primerF 0.5μL，10μM primer R 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.1μL，模板DNA 0.5μL，ddH2O 20.4μL。
PCR反应条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，72℃总延伸8min，共35个循环，4℃保存。
PCR扩增完成后，电泳检测。凝胶成像系统检测PCR产物，通过16S rDNA序列通用引物27F/1492R扩增，可以扩增出1500bp大小的目的条带。
测序后，在NCBI中进行Blast比对，利用软件MEGA邻接法(Neighbor-joining)聚类分析，并构建系统进化树(图4)，根据进化树初步判断大丽轮枝菌的4株共生菌为Brevundimonas olei。
将油短波单胞菌Brevundimonas olei菌株保藏于位于湖北武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心，邮编430072)，保藏日期为2020年8月3日，保藏号为：CCTCC NO：M2020392。
实施例4：B.olei与大丽轮枝菌共培养及抑菌效果
将PDA平板中活化好的V.dahliae打成7mm的菌饼(2-3个)，接种到100mL Czapek-Dox培养液中，120r·min-1 25℃培养3d，分别取50％、20％和10％稀释后的内共生菌菌液25mL加入100mL Czapek液体培养基，二者共培养15d，不加B.olei菌液为对照，观察不同处理摇瓶中大丽轮枝菌生长状态，摇瓶共培养大丽轮枝菌的生长状态随加B.olei菌液浓度不同差异明显。随培养时间增加，处理组与对照组摇瓶中菌液颜色发生变化，与对照组相比加入B.olei菌液的处理组摇瓶颜色较浅。共培养15d，三个不同浓度处理组中，10％B.olei菌液的摇瓶黑色素产生明显，20％B.olei菌液次之，加入50％菌液处理的摇瓶内菌液颜色无明显变化(图5)。处理组中加入的B.olei菌液浓度越大，液体摇瓶中黑色素产生越少。
制备内生细菌发酵液，将内生菌接种于LB培养基中，37℃，180r·min-1，培养16-24h，离心(6000r·min-1)20min，取上清液，微孔滤膜(0.22μm)过滤除菌2-3次，分装，置于4℃冰箱保存备用。
固体平板共培养对大丽轮枝菌生长形态的影响及抑菌效果：处理组(TM)：100mL灭菌后PDA培养基冷却至45℃左右，分别加入25mL50％、20％和10％稀释后的B.olei发酵液；对照组(CK)：以不加发酵液为对照，震荡混匀后倒板，得到对照组和处理组PDA平板，待平板凝固12h，分别取上述对照组、处理组PDA平板，平板中央接入棉花黄萎病菌菌饼，每隔5d拍照观察大丽轮枝菌形态。十字交叉法测量不同处理的菌落大小，根据菌落直径计算发酵液抑菌率(inhibitition rate，IR)，抑菌率(％)＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-7)]×100。三个不同培养时期，B.olei不同浓度发酵液对大丽轮枝菌形态均有影响。与对照组相比，处理组菌丝生长旺盛，施加50％发酵液共培养10d和15d，大丽轮枝菌菌落不产微菌核(图6B-C)，由原来的菌核型转变成菌丝型。B.olei共培养的处理组微菌核数量始终小于对照组(图6D)。通过扫描电镜观察，随培养时间及B.olei浓度增加大丽轮枝菌分生孢子形成减少，菌丝形态发生膨胀、破裂、异型，微菌核逐渐减少消失(图7)；利用B.olei菌液共培养，能观察到B.olei短杆状菌体附着在大丽轮枝菌菌丝体表面(图7B)。
B.olei不同稀释浓度发酵液对大丽轮枝菌生长均有抑制效果，不同处理抑制率差异较大(表1)。50％发酵液抑菌效果较好，共培养15d，抑菌率达到61.30±0.54％；发酵液浓度为10％和20％时，共培养5d、10d、15d二者抑菌率均低于50％B.olei发酵液。
表1 B.olei不同浓度发酵液对大丽轮枝菌抑菌率
Figure GDA0003489095010000091
实施例5：温室盆栽实验
棉种处理：70％乙醇洗去棉种包衣，55℃温水浸种30min，常温浸种8h，沥干，25℃催芽，露白，播种。棉苗培育：混合营养土(花卉营养土：自然田土1:1)灭菌，每个花盆播种3-5颗。处理组菌液制备：a.V.dahliae36928、b.symbiont-free36928(抗生素除去共生菌)、c.V.dahliae36928+symbiont-free36928、d.B.olei、e.无菌水空白对照。菌液浓度1×109cfu/mL。采用浇根法接种病原菌，棉苗长出两片真叶时接入病原菌，每盆接菌量10mL，接菌后每隔两天浇水并观察生长情况，接菌7d零星发病，15d左右普遍发病，发病后，采用棉花苗期叶片5级分级法进行病情调查，病级分级标准分别为0级：健株；1级1-2片子叶出现病状；2级1-2片真叶表现明显病状；3级3片及3片以上真叶表现病状；4级植株生长点死亡或全株枯死。统计病情指数，根据黄萎病菌在棉花上的病情指数将菌株发病程度划分为3个致病类型：Ⅰ型为强致病力菌株，平均病指35.1～100；Ⅱ型为中等致病性菌株，平均病指20.1～35.0；Ⅲ型为弱致病性菌株，平均病指0.1～20.0。
Figure GDA0003489095010000101
盆栽实验中施加菌液处理组均出现不同程度发病情况，棉株萎蔫灼烧状，叶片脱落。对棉株茎秆解剖，发现施加symbiont-free 36928菌液棉杆维管束为深褐色病变严重(图8B)，加入B.olei菌液和无菌水处理的棉株和茎秆维管束无明显发病症状(图8D-E)。棉苗生长30d时，加入symbiont-free36928菌液和V.dahliae36928菌液的病情指数分别为69.75和53.71，都属于强致病力菌株，从棉株外观和病指可知symbiont-free 36928菌液的致病力更强，B.olei无致病力(表2)。
表2 盆栽实验病情指数
Figure GDA0003489095010000102
注:表中数据为平均数±标准差
显然，上述实施例仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。

Claims (6)

1.一种油短波单胞菌(Brevundimonas olei)菌株，其特征在于，该菌株为一种大丽轮枝菌内共生菌，其保藏号为CCTCC NO：M 2020392。
2.一种微生物制剂，其特征在于，含权利要求1所述的油短波单胞菌菌株的无菌培养液。
3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，将所述油短波单胞菌菌株接种于LB培养基中，37℃，180r·min-1，培养16-24h，6000r·min-1离心10min，取上清液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌2-3次，分装，置于4℃冰箱保存备用，得到微生物制剂。
4.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述油短波单胞菌菌株加入LB培养基后，该油短波单胞菌菌株的质量浓度为10％-50％。
5.权利要求1所述油短波单胞菌菌株在防治植物真菌病害中的应用，所述真菌为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)。
6.权利要求1所述油短波单胞菌菌株在防治棉花黄萎病上的应用。
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