CN112574894B - 一种伊氏杀线虫真菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种伊氏杀线虫真菌及其应用，具体地，本发明提供了一种伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)Fxy120。本菌株在不同营养条件下均产生大量的具有杀线虫效果的粘性新月形孢子(90％以上)，可大大提高松材线虫病防治效果。

Description

一种伊氏杀线虫真菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物科学领域，具体地，本发明提供了一株伊氏杀线虫真菌(Esteyavermicola)及其应用

背景技术

松材线虫病，即松树萎蔫病(Pine Wilt Disease，PWD)，是一种以松材线虫为病原，综合人为参与、媒介昆虫、寄主松树、相关伴生菌和环境因素互作的复杂病害系统。自1982年松材线虫在我国首次报道后，松材线虫病已蔓延至我国西南、华南、华中、华东、华北以及东北地区等18个省、市、自治区，2019年新增县、区级疫区共85个，每年造成经济损失达数十亿元，严重威胁着我国林业和生态安全。

利用微生物农药等防治松材线虫具有环保、持续和高效等特点，Esteyavermicola是已报到的松材线虫主要内寄生真菌。该菌能产生新月形和杆状两种不同类型的孢子，其中只有新月形的孢子对松材线虫具有粘附性，能附着在松材线虫体表，并寄生到松材线虫体内从而杀死线虫。因此，提供一株能产生大量具有杀线虫活性的新月形孢子的菌株是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一株能产生大量具有杀线虫活性的新月形孢子的菌株。

本发明的第一方面，提供了一种伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)，其为伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)Fxy120，保藏编号为CGMCCNo.20215。

本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)的应用，其用于防治松材线虫病。

在另一优选例中，所述的应用包括：将所述的伊氏杀线虫真菌Fxy120与防治对象接触，从而防治松材线虫病。

在另一优选例中，所述应用包括：该含有所述的伊氏杀线虫真菌Fxy120的发酵的带孢子的分散体喷洒于防治对象。

在另一优选例中，所述的分散体选自下组：悬浮剂、粉剂、水剂。

在另一优选例中，所述的分散体还包括展布剂。

在另一优选例中，所述的分散体还包括选自下组的组分：分散剂，载浮剂，湿润剂，粘着剂，增效剂，或其组合。

在另一优选例中，所述的伊氏杀线虫真菌Fxy120的发酵的带孢子的分散体是通过以下方法制备的：将所述的伊氏杀线虫真菌Fxy120接种于培养基，培养至菌丝长满培养容器后，得到所述的分散体。

在另一优选例中，所述的培养基为PDA培养基。

在另一优选例中，所述的PDA培养基包括：马铃薯180-220g/L，葡萄糖18-22g/L，琼脂18-22g/L。

在另一优选例中，所述的PDA培养基是通过以下方法制备的：将马铃薯去皮切碎，加水煮沸10-15分钟，纱布过滤，收集滤液。加入葡萄糖、琼脂，定容；

将定容后的溶液于高温高压下灭菌后分装，凝固后得到所述的PDA培养基。

在另一优选例中，所述的培养包括：20-30℃黑暗培养7-8d。

在另一优选例中，所述的培养基包括：酵母粉0.2-0.8wt％，蛋白胨0.8-1.2wt％，葡萄糖3-5g/L，氯化钙0.5wt％，消泡剂0.1wt％的水溶液。

在另一优选例中，所述的培养包括：20-30℃，80-120转/分钟，无菌空气流0.8-1.2L/h下发酵2-3天。

本发明的第三方面，提供了一种农药组合物，所述的组合物包括：如权利要求1所述的伊氏杀线虫真菌Fxy120。

在另一优选例中，所述的组合物还包括展布剂。

在另一优选例中，所述的组合物还包括选自下组的组分：分散剂，载浮剂，湿润剂，粘着剂，增效剂，或其组合。

在另一优选例中，所述的组合物用于防治松材线虫病。

本发明的目的是提供一株伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)及其应用。

本发明的一株伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)Fxy120，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期是2020年06月30日，保藏编号为CGMCCNo.20215。

本发明的伊氏杀线虫真菌的应用是指伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)Fxy120可产生大量具有粘性并致死松材线虫的新月形孢子在防治松材线虫病上的应用。

本发明人在2019年冬季从云南省盘龙区小河乡公路33号，云南切稍小蠹危害的云南松树皮分离得到伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)Fxy120；该菌在PDA固体培养基上25℃培养7-8天后，菌落边缘光滑，气生菌丝致密，菌丝起初为白色，逐渐变为灰色，最后变为墨绿色；菌丝分化产生安剖瓶形产孢细胞，产孢细胞基部膨大，顶部较细；分生孢子新月形或长椭圆形，内部有一卵圆形孢子结构；该菌β-tubulin序列接收号为MT323207，与GeneBank中其他E.vermicola菌株β-tubulin序列同源性为100％或99.75％，其系统发育树聚集在同一分支，且进化距离为0.00；因此，经形态学鉴定和β-tubulin分子鉴定将该菌鉴定为E.vermicola,最终命名为伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)Fxy120。

与现有技术相比，本发明的优点是：

本菌株在不同营养条件下均产生大量的具有杀线虫效果的粘性新月形孢子(90％以上)，可大大提高松材线虫病防治效果。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了实施例1中E.vermicola形态特征.(A)寄主；(B,C)小蠹虫危害坑道；(D,E)PDA培养8天后正反面培养形态；(F,G)新月形产孢细胞形态；(H)两种分生孢子；(I)液体PDA培养形态.Scale bars:100μm(F)；10μm(G)；20μm(H)；50μm(I)；

图2显示了实施例1中PDA培养8天后棒状孢子和新月形孢子比例；

图3显示了本发明中E.vermicolaβ-tubulin序列信息；

图4显示了实施例1中E.vermicolaβ-tubulin序列最大似然树；

图5显示了实施例3中E.vermicola侵染松材线虫过程。图5A：新月形孢子粘附线虫体表；图5B新月形孢子侵入线虫体表；图5C、图5D：菌丝在线虫体内繁殖定殖；图5E,图5F：菌丝再次产生新月形孢子同时降解线虫.标尺：20μm(A,C,E,和F)；10μm(B)；100μm(D)；

图6显示了本发明实施例3中E.vermicola对松材线虫的粘附率和致死率。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

1.1材料与方法

1.1.1样品采集及分离纯化

2020年1月，采集云南昆明市盘龙区和安宁市以及大理祥云县等地区云南松枝条和树干样品，放入无菌信封中，带回实验室4℃保存备用。通过组织分离法分离其内生真菌：首先将云南松树干和枝条样本剪成大小为5×5×3cm样品块，在超净工作台内用0.5％的NaCLO溶液表面消毒60s，无菌水清洗3次；再用75％酒精处理30s，无菌水清洗3次后，无菌吸水纸吸干样品块表面水分。用无菌枝剪将样品块接触处理液表面去除，再将样品块剪成5×5×1mm大小组织块，置于WA(琼脂20g，蒸馏水1000ml)和PDA(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml)培养基上，25℃黑暗培养2-5d后，挑取含菌丝先端培养基置于PDA培养基上，25℃黑暗培养7d得到纯化菌株。纯化菌株通过10％甘油水溶液-4℃保存于中国林业科学研究院林业新技术研究所森林病原整合生物学研究室(F_XY:Fungi of Xingyao Zhang‘s Lab.)用于后续研究。

1.1.2形态学鉴定

纯化后的菌株在PDA培养基上25℃黑暗培养7-8d后，观察其气生菌丝状态，菌落颜色等培养特征，其中颜色描述参考(Rayner,1970)。同时通过正置DIC显微镜(Zeiss，imagerA2)观察代表性菌株的菌丝、分生孢子梗、产包细胞、分生孢子等显微特征。以无菌水为浮载剂制作玻片标本，每个微观结构测量50次，并计算其平均值、标准差(SD)，最小(min)和最大(max)测量值。结合其培养形态和分生孢子相关形态对其进行形态学鉴定。

1.1.3分子生物学鉴定

纯化菌株在PDA培养基上25℃黑暗培养7-8d后，在超净工作台中用无菌手术刀刮取代表菌株菌丝和孢子至1.5ml无菌离心管中，利用植物DNA提取试剂盒(天根，中国)提取其DNA。利用BTF(GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC)和BTR(ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC)为引物，实验菌株DNA为模板，扩增合成其β-Tublin序列。扩增体系为：2×Taq PCR Mix(天根，中国)25ul，BTF/BTR各1ul，DNA模板2ul,ddH₂O 21ul。扩增程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，送华大基因生物有限公司进行双向测序拼接。测序结果通过NCBI进行Blast比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)鉴定实验菌株种类，同时将实验菌株序列提交至NCBI数据库中。参考相关研究(Wang et al.,2014)，从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下载E.vermicola相关菌株β-tubulin序列，用MEGA6.0构建最大似然系统发育树(Maximum likelihood tree)，研究本实验菌株与其他相关菌株之间的关系，本实验使用菌株信息如表1所示：

表1菌株鉴定中所使用的菌株信息表

*：实验菌株，待检测

1.1结果：

1.2.1形态学特征：

本实验从云南切梢小蠹危害的云南松树干中分离到了1株E.vermicola(图1A-C)。该菌在PDA培养基上25℃黑暗培养1天后，产生白色菌丝，第3天分泌墨绿色色素，菌株背面由绿色变为墨绿色，呈绒毛状，菌落边缘光滑，生长速度较快，第8-10天能铺满6cm培养皿(图1D-E)。在固体PDA培养基上，会产生两种分生孢子。其中，1型分生孢子透明，单包，杆状，不具有粘附性，(3.72–)4.94–6.85(–7.58)×(1.38–)2.03–2.67(–3.04)μm(图1H)2型分生孢子梗单生，直立，基部安瓿瓶形，向顶端渐细，整体弯曲(图1F-G)；分生孢子单生，透明，半月形或椭圆形，向内凹陷，末端稍尖，具粘性，大小为(6.27–)7.34–9.94(–11.65)×(2.90–)3.15–4.12(–4.79)μm(图1H)，分生孢子内有一明显卵原型孢子结构(图1G)。在PDA培养基上，带有粘性的分生孢子比例是90％左右(图2)。在PDA液体培养基中震荡培养后，会产生大量圆形、卵形或长椭圆形的芽生孢子，芽生孢子萌发形成菌丝，菌丝特化形成安瓿瓶形产孢细胞，产生新月形粘性孢子(图1I)。根据其形态学特征，将实验菌株鉴定为E.vermicola。

1.2.1分子生物学特征：

本实验扩增合成了Fxy121菌株β-tublin序列，其大小为413bp(图3)，将该序列提交到NCBI数据库中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，序列接收号为MT323207。通过NCBIBlast核酸序列比对后，发现该菌株β-tublin序列与分离自巴西进口到中国台湾包装箱中的伞华刃线虫B.rainulfi的NKF13222菌株相似率为100％，覆盖率为100％。同时与分离自韩国土壤中腐生线虫的CNU120806菌株β-tublin序列相似率为100％，覆盖率为100％。与分离自云南祥云县云南切稍小蠹坑道中的CXY1839菌株β-tublin序列相似率为99.75％，覆盖率为100％。根据实验菌株β-tublin序列系统发育树分析研究发现，实验菌株与其他E.vermicola菌株聚集在同一分支，且进化距离为0.00，说明该实验菌株与其他E.vermicola在遗传进化上无差异，是同一个种(图4)。基于上述分子特征，将本实验菌株鉴定为E.vermicola。

基于该菌形态学和分子生物学特征，将本实验菌株鉴定为E.vermicola(Liuo etal.,1999)。

实施例2伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)Fxy120菌液的制备

该菌株实验室主要通过PDA培养基培养，PDA培养基配方及制作过程：配置PDA培养基，具体组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L。具体操作如下：将马铃薯去皮切碎，加水煮沸10-15分钟，纱布过滤，收集滤液。加入葡萄糖、琼脂，定容。将定容后的溶液于121℃，1.05×10⁵Pa下高压灭菌21min后，分装到6cm培养基，凝固后得到PDA培养基。将伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)Fxy120在无菌条件下接种到6cm PDA培养基上，25℃黑暗培养7-8d直至菌丝长满整个培养皿后，即可使用。

实施例3伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)Fxy120对于松材线虫的杀灭实验

将伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)Fxy120接种到6cm PDA培养基上，25℃黑暗培养7-8d直至菌丝长满整个培养皿后，接种50ul(500头)混合虫态松材线虫悬浮液(松材线虫在9cm PDA灰葡萄孢培养基上25℃黑暗培养7d，用无菌水冲洗，调整浓度为10000头/ml)，接种6h、12h、24h、48h、96h后，倒扣浸泡于无菌水中60min，并用无菌水反复冲洗培养基，将线虫从培养皿中冲洗下来，通过倒置显微镜(Zeiss，Primo vert)检测孢子黏附率和线虫致死率。其中孢子黏附率＝已黏附的线虫/所有线虫总数×100％；线虫致死率＝死亡线虫/所有线虫总数×100％；死亡线虫是指在物理刺激条件下不运动的线虫。每个时间点进行5个生物学重复。

结果发现：松材线虫接种于E.vermicola菌株平板后，E.vermicola产生的新月形孢子黏附于松材线虫体表，并可侵入松材线虫体内，在线虫体内寄生，从而导致线虫死亡(图5)。松材线虫接种6h后，其粘附率为19.04％，随后逐渐增加，24h后粘附率增加至77.77％，48h后96.00％以上松材线虫均被该菌新月形性孢子粘附。该菌对松材线虫致死率也呈现逐渐上升趋势，接种第2d后，有57.80％的松材线虫死亡，第4天时，致死率达74.5％(图6)。结果显示，本发明的伊氏杀线虫真菌对于松材线虫具有良好的杀灭作用。

实施例4伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)Fxy120的发酵方法

取酵母粉0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖4g/L，氯化钙0.5％，0.1％消泡剂混合，将所述的菌株接种于混合物中进行发酵。发酵温度为26℃，转速为100转/分钟，无菌空气流速为1L/h，发酵2-3天，即得到适合野外使用的伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)Fxy120发酵液。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国林业科学研究院林业新技术研究所

<120> 一种伊氏杀线虫真菌及其应用

<130> 6111-2012-065I

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtaaccaaa tcggtgctgc tttc 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accctcagtg tagtgaccct tggc 24

<210> 3

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acccttggcc cagttgttgc cggcaccaga ctggccaaaa acaaagttgt cggggcggaa 60

gagctggcca aaggggccag cacgcacggc atccatggtg ccgggctcca ggtcaaccag 120

cacagcacgc ggcacgtact tgttgccagt agcctcgttg aagtacacgc tcatgcgctc 180

cagctggagc tcagacgtac cgttgtacct agagaaccag tcagatcaac agaaatgcaa 240

aatacagact cgtgcagtcg tctgaatgta aaagacgcgt aaaaaacata cacgccattg 300

ctgtcgagac cgtgctcgct ggaaatctgc tgcctgcaaa actgttagca taatttttca 360

tcttcctggt ctagaggaca actcaccaga aagcagcac 399

Claims (10)

1.一种伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)，其特征在于，其为伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)Fxy120，保藏编号为CGMCCNo.20215。

2.如权利要求1所述的伊氏杀线虫真菌(Esteya vermicola)的应用，其特征在于，用于防治松材线虫病。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用包括：将所述的伊氏杀线虫真菌Fxy120与防治对象接触，从而防治松材线虫病。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用包括：该含有所述的伊氏杀线虫真菌Fxy120的发酵液及其带孢子的分散体喷洒于防治对象。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的分散体选自下组：悬浮剂、粉剂、水剂。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的伊氏杀线虫真菌Fxy120的发酵的带孢子的分散体是通过以下方法制备的：将所述的伊氏杀线虫真菌Fxy120接种于培养基或培养液，培养发酵之后得到所述的分散体。

7.一种农药组合物，其特征在于，所述的组合物包括：如权利要求1所述的伊氏杀线虫真菌Fxy120。

8.如权利要求7所述的农药组合物，其特征在于，所述的组合物还包括展布剂。

9.如权利要求7所述的农药组合物，其特征在于，所述的组合物还包括选自下组的组分：分散剂，载浮剂，湿润剂，粘着剂，增效剂，或其组合。

10.如权利要求7所述的农药组合物，其特征在于，所述的组合物用于防治松材线虫病。

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