CN115851453A - 用于制备伊氏杀线真菌孢子粉的培养基及伊氏杀线真菌孢子粉的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于制备伊氏杀线真菌孢子粉的培养基及伊氏杀线真菌孢子粉的制备方法。本发明用于制备伊氏杀线真菌孢子粉的培养基，按重量百分比包括如下组分：葡萄糖2‑3％，酵母浸粉0.5‑1％，蛋白胨0.1‑0.5％，无机盐0.4‑0.8％，余量为水。本发明提供的培养基及制备方法可获得高浓度的孢子悬浮液和高活性的孢子粉，同时获得的孢子粉便于储存和运输，且可以进一步加工成不同类型的剂型用于松材线虫病的防治。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种用于制备伊氏杀线真菌孢子粉的培养基及伊氏杀线真菌孢子粉的制备方法。
背景技术
松材线虫是全球重大检疫性有害生物，自1982年入侵我国，发生范围不断扩大，年发生面积超2000万亩，累计引起死树6亿多株，造成的直接经济损失数千亿元，间接经济损失和生态破坏更是难以计数。目前松材线虫病的防治措施主要以疫木清理为主，对疫木进行粉碎、烧毁、熏蒸等处理，其次是喷洒化学药剂杀灭媒介昆虫，树干注射甲维盐等防治松材线虫，以及选育抗性树种等，虽然取得了一定的成果，但是存在化学药剂污染环境、树干注射方法不宜大规模应用，抗病树种选育进程慢，媒介昆虫控制应急性差等问题。
伊氏杀线真菌Esteya vermicola是世界上第一个被报道的松材线虫内寄生真菌，对松材线虫表现出高侵染性和寄生率，在林间也被证明具有一定的预防效果，具有作为松材线虫病生物防治剂的前景和潜力。
目前，制约伊氏杀线真菌大规模应用的主要问题在于现有培养方法产孢量低，孢子悬浮液保存时间短，易受到污染。因此，提供一种提高Esteya vermicola产孢量并延长孢子悬浮液保存时间的制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足，提供一种用于制备伊氏杀线真菌孢子粉的培养基及伊氏杀线真菌孢子粉的制备方法，可获得高浓度的孢子悬浮液和高活性的孢子粉，同时孢子粉易于储存和运输，对松材线虫病的防治具有广阔的应用前景。
为解决以上技术问题，本发明采取的技术方案是：
一种用于制备伊氏杀线真菌孢子粉的培养基，按重量百分比包括如下组分：葡萄糖2-3％，酵母浸粉0.5-1％，蛋白胨0.1-0.5％，无机盐0.4-0.8％，余量为水。
优选地，无机盐选自氯化钠、氯化钾、碳酸钙、硫酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁的一种或多种；优选地，培养基的pH为6-7，优选为6.5。
优选地，按重量百分比由如下组分组成：葡萄糖2-3％，酵母浸粉0.5-1％，蛋白胨0.1-0.5％，氯化钙0.4-0.6％，磷酸氢二钾0.01-0.05％，硫酸镁0.03-0.06％，硫酸亚铁0.01-0.05％，余量为水。
优选地，按重量百分比由如下组分组成：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨0.1％，氯化钙0.5％，磷酸氢二钾0.01％，硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.01％，余量为水。
优选地，伊式杀线真菌的菌株编号为Fxy121，保藏编号为CGMCCNo.20215。
为解决以上技术问题，本发明采取的又一技术方案是：
一种伊氏杀线真菌孢子悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
(1)活化：将保存的伊氏杀线真菌菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化培养，获得该菌株的菌饼；
(2)培养：将权利要求1-5的培养基灭菌，接种步骤(1)获得的菌饼，在温度为25-28℃，转速为180-220rpm/min的条件下无光照培养5-7天，获得孢子悬浮液。
优选地，步骤(2)中将权利要求1-5的培养基装入三角瓶灭菌，接种步骤(1)获得的菌饼，容量为1L的三角瓶中装液量为400mL，接种量为直径5mm的菌饼4-5块；
优选地，灭菌条件为温度105-135℃，压强90-120KPa，时间10-30min。
为解决以上技术问题，本发明采取的又一技术方案是：
一种伊氏杀线真菌孢子粉的制备方法，包括以下步骤：
冷冻干燥：将上述步骤(2)获得的孢子悬浮液经低速离心后得到孢子浆，将孢子浆与预先灭菌的保护剂溶液混匀，平衡后在真空度为130-180mTorr，温度为-70至-90℃的条件下冷冻干燥，得到伊氏杀线真菌孢子粉。
优选地，在步骤(3)中，在冷冻干燥前先进行预冻；
优选地，预冻温度为-70至-90℃，预冻时间为1-4小时。
优选地，在步骤(3)中，保护剂为蔗糖，蔗糖溶液的质量浓度为5-10％，优选为10％，蔗糖溶液经高温高压定时灭菌后再加入；
优选地，保护剂溶液与孢子浆的体积比为1-3：1，优选为2：1；
优选地，低速离心的转速为3000-4000rpm/min；
优选地，冷冻干燥的时间为24-60小时。
为解决以上技术问题，本发明采取的再一技术方案是：
如上所述的制备方法制备得到的孢子悬浮液或孢子粉在控制松材线虫病中的应用。
由于以上技术方案的采用，本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、与现有技术相比，本发明培养基能够获得高浓度的孢子悬浮液；
2、与现有技术相比，本发明孢子粉的制备方法能够获得高活性的孢子粉，孢子的存活率大大提高；
3、与现有技术相比，本发明在孢子粉的制备中，加入对孢子冷冻干燥起保护作用的保护剂，显著提高冷冻干燥后的孢子存活率；
4、与现有技术相比，本发明获得孢子粉便于储存运输和后续的剂型研发，用于松材线虫病的防治。
附图说明
图1为本发明实施例1制备方法得到的伊氏杀线真菌孢子粉；
图2为本发明实施例1孢子粉应用于松材线虫病防治的效果图。
具体实施方式
为使本发明的技术方案和有益效果能够更加明显易懂，下面通过结合附图及列举具体实施例的方式进行详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
本发明一种用于制备伊氏杀线真菌孢子粉的培养基，按重量百分比包括如下组分：葡萄糖2-3％，酵母浸粉0.5-1％，蛋白胨0.1-0.5％，无机盐0.4-0.8％，余量为水。
在某些实施例中，无机盐选自氯化钠、氯化钾、碳酸钙、硫酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁的一种或多种。无机盐的添加能够显著提高孢子量。
在某些实施例中，培养基的pH为6-7，优选为6.5。此处pH使用的调节剂为本领域常用调节剂，不是本发明的发明点，在此不再赘述。
在某些实施例中，按重量百分比由如下组分组成：葡萄糖2-3％，酵母浸粉0.5-1％，蛋白胨0.1-0.5％，氯化钙0.4-0.6％，磷酸氢二钾0.01-0.05％，硫酸镁0.03-0.06％，硫酸亚铁0.01-0.05％，余量为水。
在某一具体的实施例中，按重量百分比由如下组分组成：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨0.1％，氯化钙0.5％，磷酸氢二钾0.01％，硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.01％，余量为水。
在某些实施例中，伊式杀线真菌的菌株编号为Fxy121，保藏编号为CGMCCNo.20215。
本发明一种伊氏杀线真菌孢子悬浮液的制备方法，包括以下步骤：
(1)活化：将保存的伊氏杀线真菌菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化培养，获得该菌株的菌饼；
(2)培养：将权利要求1-5的培养基灭菌，接种步骤(1)获得的菌饼，在温度为25-28℃，转速为180-220rpm/min的条件下无光照培养5-7天，获得孢子悬浮液。
在某些实施例中，步骤(1)中马铃薯葡萄糖琼脂培养基的组分为：1L水中200g土豆、20g葡萄糖、15g琼脂。将菌株于25℃培养箱中黑暗培养7d。
在某些实施例中，步骤(2)中将培养基装入三角瓶灭菌，接种步骤(1)获得的菌饼，容量为1L的三角瓶中装液量为400mL，接种量为直径5mm的菌饼4-5块。装液量太多会影响进气量，装液量太少，营养不够。
在某些实施例中，灭菌条件为温度105-135℃，压强90-120KPa，时间10-30min。
在某一具体的实施例中，灭菌条件为121℃、105KPa下灭菌20min。
在某些实施例中，步骤(2)中的培养时间具体的可以为7天、6天、5天。
在某些实施例中，步骤(2)中的培养温度具体的可以为28℃、27℃、26℃、25℃。
在某些实施例中，步骤(2)中的培养转速具体的可以为220rpm/min、210rpm/min、200rpm/min、190rpm/min、180rpm/min。
本发明一种伊氏杀线真菌孢子粉的制备方法，包括以下步骤：
冷冻干燥：将上述步骤(2)获得的孢子悬浮液经低速离心后得到孢子浆，将孢子浆与预先灭菌的保护剂溶液混匀，平衡后在真空度为130-180mTorr，温度为-70至-90℃的条件下冷冻干燥，得到伊氏杀线真菌孢子粉。
在某些实施例中，在步骤(3)中，在冷冻干燥前先进行预冻。进行预冻可以避免孢子悬浮液在冷冻干燥的时候直接升华，避免液体沸腾。
在某些实施例中，预冻温度为-70至-90℃，预冻时间为1-4小时。
在某些具体的实施例中，预冻温度可以为-70℃、-80℃、-90℃，优选为-80℃，预冻时间可以为1小时、2小时、3小时、4小时。
在某些实施例中，在步骤(3)中，保护剂为蔗糖，蔗糖溶液的质量浓度为5-10％，具体的可以为10％、9％、8％、7％、6％、5％，优选为10％，蔗糖溶液经高温高压定时灭菌后再加入。在某一具体的实施例中，高温高压定时灭菌的条件为121℃、105KPa下灭菌20min。
在某些实施例中，保护剂溶液与孢子浆的体积比为1-3：1，具体的可以为1：1、2：1、3：1，优选为2：1。
在某些实施例中，低速离心的转速为3000-4000rpm/min，具体的可以为4000rpm/min、3000rpm/min、3500rpm/min。
在某些实施例中，冷冻干燥的真空度优选为140-160mTorr，更具体的可以为160mTorr、150mTorr、140mTorr。
在某些实施例中，冷冻干燥的温度具体的可以为-70℃、-80℃、-90℃。
在某些实施例中，冷冻干燥的时间为24-60小时，优选为36-50小时，更具体的可以为36小时、40小时、45小时、48小时、50小时。
本发明如上所述的制备方法制备得到的孢子悬浮液或孢子粉在控制松材线虫病中的应用。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件。
下列实施例中使用的产品，如无特殊说明，均通过购买市售产品获得。
实施例1
伊氏杀线真菌Esteya vermicola孢子粉的制备方法，具体步骤如下：
步骤(1)：将保存的伊氏杀线真菌菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化培养，获得该菌株的菌饼，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的组分为：1L水中200g土豆、20g葡萄糖、15g琼脂，将菌株于25℃培养箱中黑暗培养7d；
步骤(2)：向纯水中加入葡萄糖20g，酵母浸粉5g，蛋白胨1g，氯化钙5g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.1g，配置成1L液体培养基；将液体培养基分装入1L的三角瓶，每瓶装液量400mL，于121℃、105KPa下灭菌20min，冷却至室温，将步骤(1)获得的菌饼接种至三角瓶，接种量为直径5mm的菌饼4-5块，在温度为25℃，转速为200rpm/min的条件下培养6天，获得孢子悬浮液；
步骤(3)：将孢子悬浮液经低速离心后得到孢子浆，转速为4000rpm/min，将孢子浆与预先灭菌的10％的蔗糖溶液混匀(蔗糖溶液在121℃、105KPa下灭菌20min)，加入蔗糖溶液与孢子浆的体积比为2：1，平衡30分钟，在-80℃冰箱预冻2小时，再通过冷冻干燥机冷冻干燥48h，冷冻干燥的条件为真空度150mTorr，温度-80℃，得到伊氏杀线真菌孢子粉。
将步骤(2)获得的孢子悬浮液经三层纱布过滤后用血球计数板在普通光学显微镜下确定孢子浓度，经计数后孢子浓度为6*108cfu/mL。
将步骤(3)获得的孢子粉取0.01g加入1mL无菌水溶解，采用稀释平板菌落计数法测定样品中的活孢子数，计数后活孢子数为5*107cfu/mL。
实施例2
伊氏杀线真菌Esteya vermicola孢子粉的制备方法，具体步骤如下：
步骤(1)：将保存的伊氏杀线真菌菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化培养，获得该菌株的菌饼，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的组分为：1L水中200g土豆、20g葡萄糖、15g琼脂，将菌株于25℃培养箱中黑暗培养7d；
步骤(2)：向纯水中加入葡萄糖3g，酵母浸粉0.5g，蛋白胨0.5g，氯化钙0.5g，磷酸氢二钾0.01g，硫酸镁0.05g，硫酸亚铁0.01g，配置成100ml液体培养基；将培养基于121℃、105KPa下灭菌20min，将步骤(1)获得的菌饼接种至三角瓶，接种直径5mm的菌饼1块，在温度为28℃，转速为200rpm/min的条件下培养7天，获得孢子悬浮液；
步骤(3)：将孢子悬浮液经低速离心后得到孢子浆，转速为4000rpm/min，将孢子浆与预先灭菌的10％的蔗糖溶液混匀(蔗糖溶液在121℃、105KPa下灭菌20min)，加入蔗糖溶液与孢子浆的体积比为2：1，平衡30分钟，在-80℃冰箱预冻2小时，再通过冷冻干燥机冷冻干燥48h，冷冻干燥的条件为真空度150mTorr，温度-80℃，得到伊氏杀线真菌孢子粉。
将步骤(2)获得的孢子悬浮液经三层纱布过滤后用血球计数板在普通光学显微镜下确定孢子浓度，经计数后孢子浓度为5.2*108cfu/mL。
将步骤(3)获得的孢子粉取0.01g加入1mL无菌水溶解，采用稀释平板菌落计数法测定样品中的活孢子数，计数后活孢子数为3.5*107cfu/mL。
伊氏杀线真菌防治松材线虫病的温室试验
在温室环境下，选取长势均匀、健康状况良好的3年生马尾松苗30棵，随机分成3组，分别为A1-A3，其中A1使用实施例1所得孢子粉溶于水后进行喷洒处理，A2不做任何处理，A3为空白对照，14天后A1和A2接种同等数量的松材线虫，A3接种等量的无菌水。期间采取相同的管理方式，2个月后统计松苗死亡率。
2个月后统计松苗死亡率，其防治效果如图2所示，A1松苗死亡率为20％，A2松苗死亡率为60％，A3松苗死亡率为0，伊氏杀线真菌孢子粉的相对防治效果为66.7％。
对比例1
伊氏杀线真菌Esteya vermicola孢子粉的制备方法，具体步骤如下：
步骤(1)：将保存的伊氏杀线真菌菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化培养，获得该菌株的菌饼，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的组分为：1L水中200g土豆、20g葡萄糖、15g琼脂，将菌株于25℃培养箱中黑暗培养7d；
步骤(2)：向纯水中加入葡萄糖2g，马铃薯20g，配置成100mL液体培养基；于121℃、105KPa下灭菌20min，冷却至室温，将步骤(1)获得的菌饼接种至三角瓶，接种直径5mm的菌饼1块，在温度为25℃，转速200rpm/min的条件下培养7天，获得孢子悬浮液；
步骤(3)：将孢子悬浮液经低速离心后得到孢子浆，离心机转速为4000rpm/min，将孢子浆与预先灭菌的10％的蔗糖溶液混匀(蔗糖溶液在121℃、105KPa下灭菌20min)，加入蔗糖溶液与孢子浆的体积比为2：1，平衡30分钟，在-80℃冰箱预冻2小时，再通过冷冻干燥机冷冻干燥48h，冷冻干燥的条件为真空度150mTorr，温度-80℃，得到伊氏杀线真菌孢子粉。
将步骤(2)获得的孢子悬浮液经三层纱布过滤后用血球计数板在普通光学显微镜下确定孢子浓度，经计数后孢子浓度为8.5*107cfu/mL。
将步骤(3)获得的孢子粉取0.01g加入1mL无菌水溶解，采用稀释平板菌落计数法测定样品中的活孢子数，计数后活孢子数为5*106cfu/mL。
对比例2
伊氏杀线真菌Esteya vermicola孢子悬浮液的制备方法，具体步骤如下：
步骤(1)：将保存的伊氏杀线真菌菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化培养，获得该菌株的菌饼，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的组分为：1L水中200g土豆、20g葡萄糖、15g琼脂，将菌株于25℃培养箱中黑暗培养7d；
步骤(2)：向纯水中加入葡萄糖0.5g，酵母浸粉0.75g，蛋白胨1g，氯化钙0.5g，配置成100mL液体培养基；于121℃、105KPa下灭菌20min，冷却至室温，将步骤(1)获得的菌饼接种至三角瓶，接种直径5mm的菌饼1块，在温度为25℃，转速200rpm/min的条件下培养7天，获得孢子悬浮液。
将步骤(2)获得的孢子悬浮液经三层纱布过滤后用血球计数板在普通光学显微镜下确定孢子浓度，经计数后孢子浓度为1.7*108cfu/mL。
对比例3
伊氏杀线真菌Esteya vermicola孢子悬浮液的制备方法，具体步骤如下：
步骤(1)：将保存的伊氏杀线真菌菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化培养，获得该菌株的菌饼，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的组分为：1L水中200g土豆、20g葡萄糖、15g琼脂，将菌株于25℃培养箱中黑暗培养7d；
步骤(2)：向纯水中加入葡萄糖2g，酵母浸粉0.5g，蛋白胨0.1g，氯化钙0.5g，配置成100mL液体培养基；于121℃、105KPa下灭菌20min，冷却至室温，将步骤(1)获得的菌饼接种至三角瓶，接种直径5mm的菌饼1块，在温度为25℃，转速200rpm/min的条件下培养7天，获得孢子悬浮液。
将步骤(2)获得的孢子悬浮液经三层纱布过滤后用血球计数板在普通光学显微镜下确定孢子浓度，经计数后孢子浓度为2.5*108cfu/mL。
对比例4
伊氏杀线真菌Esteya vermicola孢子粉的制备方法，具体步骤如下：
步骤(1)：将保存的伊氏杀线真菌菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化培养，获得该菌株的菌饼，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的组分为：1L水中200g土豆、20g葡萄糖、15g琼脂，将菌株于25℃培养箱中黑暗培养7d；
步骤(2)：向纯水中加入葡萄糖20g，酵母浸粉5g，蛋白胨1g，氯化钙5g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.1g，配置成1L液体培养基；将液体培养基分装入1L的三角瓶，每瓶装液量400mL，于121℃、105KPa下灭菌20min，冷却至室温，将步骤(1)获得的菌饼接种至三角瓶，接种量为直径5mm的菌饼4-5块，在温度为25℃，转速为200rpm/min的条件下培养6天，获得孢子悬浮液；
步骤(3)：将孢子悬浮液经低速离心后得到孢子浆，转速为4000rpm/min，将孢子浆与预先灭菌的质量浓度为10％的脱脂奶粉溶液混匀(脱脂奶粉溶液在121℃、105KPa下灭菌20min)，加入脱脂奶粉溶液与孢子浆的体积比为2：1，平衡30分钟，在-80℃冰箱预冻2小时，再通过冷冻干燥机冷冻干燥48h，冷冻干燥的条件为真空度150mTorr，温度-80℃，得到伊氏杀线真菌孢子粉。
将步骤(3)获得的孢子粉取0.01g加入1mL无菌水溶解，采用稀释平板菌落计数法测定样品中的活孢子数，计数后活孢子数为4*105cfu/mL。
对比例5
伊氏杀线真菌Esteya vermicola孢子粉的制备方法，具体步骤如下：
步骤(1)：将保存的伊氏杀线真菌菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化培养，获得该菌株的菌饼，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的组分为：1L水中200g土豆、20g葡萄糖、15g琼脂，将菌株于25℃培养箱中黑暗培养7d；
步骤(2)：向纯水中加入葡萄糖20g，酵母浸粉5g，蛋白胨1g，氯化钙5g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.1g，配置成1L液体培养基；将液体培养基分装入1L的三角瓶，每瓶装液量400mL，于121℃、105KPa下灭菌20min，冷却至室温，将步骤(1)获得的菌饼接种至三角瓶，接种量为直径5mm的菌饼4-5块，在温度为25℃，转速为200rpm/min的条件下培养6天，获得孢子悬浮液；
步骤(3)：将孢子悬浮液经低速离心后得到孢子浆，转速为4000rpm/min，将孢子浆在-80℃冰箱预冻2小时，再通过冷冻干燥机冷冻干燥48h，冷冻干燥的条件为真空度150mTorr，温度-80℃，得到伊氏杀线真菌孢子粉。
将步骤(3)获得的孢子粉取0.01g加入1mL无菌水溶解，采用稀释平板菌落计数法测定样品中的活孢子数，计数后活孢子数为2*105cfu/mL。
通过比较实施例和对比例中液体培养获得的孢子悬浮液浓度，可见本发明液体培养的产孢量明显增多，经过冷冻干燥后孢子粉的活孢子数也明显增多。因此，本发明提供的培养基及制备方法可获得高浓度的孢子悬浮液和高活性的孢子粉，同时获得的孢子粉便于储存和运输，且可以进一步加工成不同类型的剂型用于松材线虫病的防治。
应当理解，以上实施例均为示例性的，不用于包含权利要求所包含的所有可能的实施方式。在不脱离本公开的范围的情况下，还可以在以上实施例的基础上做出各种变形和改变。同样的，也可以对以上实施例的各个技术特征进行任意组合，以形成可能没有被明确描述的本发明的另外的实施例。因此，上述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，不对本发明专利的保护范围进行限制。
Claims (10)
1.一种用于制备伊氏杀线真菌孢子粉的培养基，其特征在于，按重量百分比包括如下组分：葡萄糖2-3％，酵母浸粉0.5-1％，蛋白胨0.1-0.5％，无机盐0.4-0.8％，余量为水。
2.根据权利要求1所述的用于制备伊氏杀线真菌孢子粉的培养基，其特征在于，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、碳酸钙、硫酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁的一种或多种；
优选地，培养基的pH为6-7，优选为6.5。
3.根据权利要求2所述的用于制备伊氏杀线真菌孢子粉的培养基，其特征在于，按重量百分比由如下组分组成：葡萄糖2-3％，酵母浸粉0.5-1％，蛋白胨0.1-0.5％，氯化钙0.4-0.6％，磷酸氢二钾0.01-0.05％，硫酸镁0.03-0.06％，硫酸亚铁0.01-0.05％，余量为水。
4.根据权利要求3所述的用于制备伊氏杀线真菌孢子粉的培养基，其特征在于，按重量百分比由如下组分组成：葡萄糖2％，酵母浸粉0.5％，蛋白胨0.1％，氯化钙0.5％，磷酸氢二钾0.01％，硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.01％，余量为水。
5.根据权利要求1所述的用于制备伊氏杀线真菌孢子粉的培养基，其特征在于，所述伊式杀线真菌的菌株编号为Fxy121，保藏编号为CGMCCNo.20215。
6.一种伊氏杀线真菌孢子悬浮液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)活化：将保存的伊氏杀线真菌菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上活化培养，获得该菌株的菌饼；
(2)培养：将权利要求1-5所述的培养基灭菌，接种步骤(1)获得的菌饼，在温度为25-28℃，转速为180-220rpm/min的条件下无光照培养5-7天，获得孢子悬浮液。
7.根据权利要求6所述的伊氏杀线真菌孢子悬浮液的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中将权利要求1-5所述的培养基装入三角瓶灭菌，接种步骤(1)获得的菌饼，容量为1L的三角瓶中装液量为400mL，接种量为直径5mm的菌饼4-5块；
优选地，灭菌条件为温度121℃，压强105KPa，时间20min。
8.一种伊氏杀线真菌孢子粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
冷冻干燥：将权利要求6-7中任一项所述步骤(2)获得的孢子悬浮液经低速离心后得到孢子浆，将孢子浆与预先灭菌的保护剂溶液混匀，平衡后在真空度为130-180mTorr，温度为-70至-90℃的条件下冷冻干燥，得到伊氏杀线真菌孢子粉。
9.根据权利要求8所述的伊氏杀线真菌孢子粉的制备方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，在冷冻干燥前先进行预冻；
优选地，预冻温度为-70至-90℃，预冻时间为1-4小时；
优选地，在所述步骤(3)中，所述保护剂为蔗糖，蔗糖溶液的质量浓度为5-10％，优选为10％，蔗糖溶液经高温高压定时灭菌后再加入；
优选地，所述保护剂溶液与孢子浆的体积比为1-3：1，优选为2：1；
优选地，低速离心的转速为3000-4000rpm/min；
优选地，冷冻干燥的时间为24-60小时。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的制备方法制备得到的孢子悬浮液或孢子粉在控制松材线虫病中的应用。
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Cited By (1)
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| CN114457000A (zh) * | 2022-01-20 | 2022-05-10 | 中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所 | 木酢液在促进Esteya vermicola芽生孢子萌发产生新月形孢子中的应用 |
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2022
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| CN114457000B (zh) * | 2022-01-20 | 2024-05-24 | 中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所 | 木酢液在促进Esteya vermicola芽生孢子萌发产生新月形孢子中的应用 |
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