CN114457000B - 木酢液在促进Esteya vermicola芽生孢子萌发产生新月形孢子中的应用 - Google Patents
木酢液在促进Esteya vermicola芽生孢子萌发产生新月形孢子中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明适用于微生物技术领域，提供了木酢液在促进Esteya vermicola芽生孢子萌发产生新月形孢子中的应用，在Esteya vermicola芽生孢子萌发阶段施用木酢液，可以显著提高该菌产新月形孢子的数量，具体的是，在灭菌后的水琼脂培养基中加入木酢液后倒板，待凝固后涂布Esteya vermicola的芽生孢子悬浮液，放入恒温培养箱中在25℃条件下培养5d，即可获得大量的新月形孢子。通过添加木酢液可使Esteya vermicola芽生孢子萌发产生更多的新月形孢子，便于开展新月形孢子杀死松材线虫的机制研究，提高科研人员的工作效率，而且木酢液本身具有诱导抗性功能，在野外与Esteya vermicola芽生孢子悬浮液一起施用的话对松材线虫病的防控有增效作用，未来具有很大的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及木酢液在促进Esteya vermicola芽生孢子萌发产生新月形孢子中的应用。
背景技术
松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是全球森林生态系统中最具危险性、毁灭性的有害生物之一，具有极强的扩散性和破坏性，自1982年入侵我国后，先后在亚热带、热带、暖温带、中温带以及秦岭等高海拔地区造成松林大面积枯死，造成了巨大的经济和生态损失，而且疫区仍在不断增加
疫木处置、树干注射和防治媒介昆虫是目前松材线虫病防控的主要方法，但由于树干注射很难全覆盖，媒介昆虫的物理防治成本较高且持效短，媒介昆虫天敌寄生率低，作用效果缓慢，疫木处理效果相对滞后，利用微生物农药防治松材线虫病是当前的研究热点。
Esteya vermicola是世界上第一个报道的能寄生松材线虫的真菌，对松材线虫表现出高侵染性和寄生率，在林间也被证明具有一定的预防效果，具有作为抗松材线虫病的生物防治剂的前景和潜力。目前，关于该菌的培养主要是通过改进固体或液体培养基配方缩短生长周期，提高产孢量，固定培养条件下可产生杆状孢子和新月形孢子，液体培养条件下主要产生芽生孢子，还有少量的杆状孢子和新月形孢子，在实际应用中主要是利用该菌株液体发酵产生的芽生孢子悬浮液通过喷洒或注射施用到松树上进行松材线虫病防治。芽生孢子萌发可以产生杆状和新月形两种类型的孢子，其中只有新月形孢子具有粘附性，可粘附到松材线虫体表并杀死线虫。因此，芽生孢子萌发产生新月形孢子的数量对于防治效果具有决定性意义，提高芽生孢子萌发产生新月形孢子的数量可提高该菌的防治效果。提供一种促进Esteya vermicola芽生孢子萌发产生更多新月形孢子的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
本发明提供木酢液在促进Esteya vermicola芽生孢子萌发产生新月形孢子中的应用，旨在解决上述背景技术中的问题。
本发明是这样实现的，木酢液在促进Esteya vermicola芽生孢子萌发产生新月形孢子中的应用，其特征在于在Esteya vermicola芽生孢子萌发阶段施用木酢液，木酢液的用量为100mL培养基中加入200μL木酢液。
按上述方案，在灭菌后的水琼脂培养基中加入木酢液后倒板制成培养基。
按上述方案，所述Esteya vermicola芽生孢子悬浮液的制备方法为：
a.将活化的Esteya vermicola菌种接种到PDA培养基上培养7d，获得该菌的菌饼；
b.将菌饼接种到PDB液体培养基中，并在25℃，200r/min的条件下培养 7d，获得培养液；
c.将培养液经3层无菌纱布过滤后得到Esteya vermicola菌的芽生孢子悬浮液。
按上述方案，在培养基上涂布Esteya vermicola芽生孢子悬浮液，放入25℃恒温培养箱培养3-5天即可获得大量新月形孢子。
按上述方案，水琼脂培养基的成分比例是100mL蒸馏水中加入1.5g琼脂粉，置于灭菌锅中121℃下灭菌20分钟。
按上述方案，使用的木酢液应提前用滤膜孔径为0.2μm的细菌过滤器过滤除菌。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的木酢液在促进Esteyavermicola芽生孢子萌发产生新月形孢子中的应用，通过添加木酢液可使Esteyavermicola芽生孢子萌发产生更多的新月形孢子，便于开展新月形孢子杀松材线虫的机制研究，提高科研人员的工作效率，而且木酢液本身具有诱导抗性功能，在野外与Esteyavermicola芽生孢子悬浮液一起施用的话对松材线虫病的防控有增效作用，未来具有很大的应用价值。
附图说明
图1是实施例1中不加木酢液的水琼脂培养基上FXY121菌株芽生孢子生长5天的情况展示图；
图2是实施例1中加200μL木酢液的水琼脂培养基上FXY121菌株芽生孢子生长5天的情况展示图；
图3是实施例2中不加木酢液的水琼脂培养基上Cxy1839菌株芽生孢子生长5天的情况展示图；
图4是实施例2中加200μL木酢液的水琼脂培养基上Cxy1839菌株芽生孢子生长5天的情况展示图；
图5添加不同浓度木酢液对Esteya vermicola FXY121菌株产新月形孢子的影响
图6添加不同浓度木酢液对Esteya vermicola Cxy1839菌株产新月形孢子的影响。
图7是促进Esteya vermicola芽生孢子产生新月形孢子的方法步骤图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图7，本发明提供一种技术方案：木酢液在促进Esteya vermicola芽生孢子萌发产生新月形孢子中的应用，包括如下步骤：
步骤一：制备灭菌的水琼脂培养基：其中，水琼脂培养基的成分比例是100mL蒸馏水中加入1.5g琼脂粉，置于灭菌锅中121℃下灭菌20分钟。
步骤二：制备Esteya vermicola菌的芽生孢子悬浮液：
其中，包括如下步骤：
步骤S1：将活化的Esteya vermicola菌种接种到PDA培养基上培养7d，获得该菌的菌饼；
步骤S2：将菌饼接种到PDB液体培养基中，并在25℃，200r/min的条件下培养7d，获得培养液；其中，500mL的三角瓶中PDB液体培养基的装液量为200mL，接种的为4块直径为6mm菌饼。
步骤S3：将培养液经3层无菌纱布过滤后得到Esteya vermicola菌的芽生孢子悬浮液。
步骤三：制备木酢液：其中，使用的木酢液应提前用滤膜孔径为0.2μm的细菌过滤器过滤除菌。
步骤四：在步骤一制备的灭菌后的水琼脂培养基中加入步骤三制备的木酢液后倒板，待凝固，之后涂布步骤二制备的Esteya vermicola的芽生孢子悬浮液，放入恒温培养箱中培养即可获得大量的新月形孢子。
其中在本步骤中，优选的，在灭完菌的每100mL水琼脂培养基中分别滴加木酢液200μL(稀释倍数为500)后倒板。
通过添加木酢液可使Esteya vermicola芽生孢子萌发产生更多的新月形孢子，便于开展新月形孢子杀死松材线虫的机制研究，提高科研人员的工作效率，而且木酢液本身具有诱导抗性功能，在野外与Esteya vermicola芽生孢子悬浮液一起施用的话对松材线虫病的防控有增效作用，未来具有很大的应用价值。
在本实施方式中：
实施例1：
木酢液在促进Esteya vermicola芽生孢子萌发产生新月形孢子中的应用，包括以下步骤：
(1)将实验室保存的Esteya vermicola FXY121菌株转接到PDA培养基平板进行活化，置于25℃的恒温培养箱避光培养7d。
(2)在超净工作台用无菌打孔器从PDA平板的菌落边缘打取直径6mm的菌饼4块接种至PDB液体培养基中，放入25℃、200r/min的培养箱中培养7d。 7d后将培养液用3层无菌纱布过滤，得到Esteya vermicola芽生孢子悬浮液。调整孢子悬浮液浓度为1*105/mL备用。
(3)将木酢液(市场上购买)原液用0.2μm的无菌微孔滤膜进行过滤后备用。
(4)在灭完菌的100mL水琼脂培养基中分别滴加木酢液400、200、100μL (稀释倍数依次为250、500、1000倍)后倒板，待培养基风干后分别滴加30μL 浓度为1*105/mL的芽生孢子悬浮液进行涂布，每个处理3个重复，以不加木酢液作为对照。将平板放置在25℃的恒温培养箱避光培养5d。5d后在显微镜下统计新月形孢子的数量。
由图1可见，不加木酢液的水琼脂培养基上FXY121菌株芽生孢子生长5 天后杆状孢子居多，只有极少数新月形孢子，加入200μL木酢液的培养基上 FXY121菌株芽生孢子生长5天后可见大量的新月形孢子(图2)。由图5可见，木酢液稀释500倍可显著促进FXY121菌株新月形孢子的产生。
实施例2：
木酢液在促进Esteya vermicola芽生孢子萌发产生新月形孢子中的应用，包括以下步骤：
(1)将实验室保存的Esteya vermicola Cxy1839菌株转接到PDA培养基平板进行活化，置于25℃的恒温培养箱避光培养7d。
(2)在超净工作台用无菌打孔器从PDA平板的菌落边缘打取直径6mm的菌饼4块接种至PDB液体培养基中，放入25℃、200r/min的培养箱中培养7d。 7d后将培养液用3层无菌纱布过滤，得到Esteya vermicola芽生孢子悬浮液。调整孢子悬浮液浓度为1*105/mL备用。
(3)将木酢液(市场上购买)原液用0.2μm的无菌微孔滤膜进行过滤后备用。
(4)在灭完菌的100mL水琼脂培养基中分别滴加木酢液400、200、100μL (稀释倍数依次为250、500、1000倍)后倒板，待培养基风干后分别滴加30μL 浓度为1*105/mL的芽生孢子悬浮液进行涂布，每个处理3个重复，以不加木酢液作为对照。将平板放置在25℃的恒温培养箱避光培养5d。5d后在显微镜下统计新月形孢子的数量。
由图3可见，不加木酢液的水琼脂培养基上Cxy1839菌株芽生孢子生长5 天后杆状孢子居多，只有极少数新月形孢子，加入200μL木酢液的培养基上 Cxy1839菌株芽生孢子生长5天后可见大量的新月形孢子(图4)。由图6可见，木酢液稀释500倍可显著促进Cxy1839菌株新月形孢子的产生。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.木酢液在促进Esteya vermicola芽生孢子萌发产生新月形孢子中的应用，其特征在于：在Esteya vermicola芽生孢子萌发阶段施用木酢液，木酢液的用量为100mL培养基中加入200μL木酢液。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在灭菌后的水琼脂培养基中加入木酢液后倒板制成培养基。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在培养基上涂布Esteya vermicola芽生孢子悬浮液，放入25°C恒温培养箱培养3-5天即可获得大量新月形孢子。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述Esteya vermicola芽生孢子悬浮液的制备方法为：a.将活化的Esteya vermicola菌种接种到PDA培养基上培养7d，获得该菌的菌饼；b.将菌饼接种到PDB液体培养基中，并在25°C，200r/min的条件下培养7d，获得培养液；c.将培养液经3层无菌纱布过滤后得到Esteya vermicola菌的芽生孢子悬浮液。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于：水琼脂培养基的成分比例是100mL蒸馏水中加入1.5g琼脂粉，置于灭菌锅中121°C下灭菌20分钟。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于：使用的木酢液应提前用滤膜孔径为0.2μm的细菌过滤器过滤除菌。
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