CN111117928B

CN111117928B - 一株内生金黄短杆菌ct-a16及其应用

Info

Publication number: CN111117928B
Application number: CN202010057488.7A
Authority: CN
Inventors: 袁宗胜; 刘芳; 谢宝贵; 张国防
Original assignee: Minjiang University
Current assignee: Minjiang University
Priority date: 2020-01-19
Filing date: 2020-01-19
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2040-01-19
Also published as: CN111117928A

Abstract

本发明公开了一株内生金黄短杆菌CT‑A16及其应用，属于微生物技术领域。内生金黄短杆菌CT‑A16的分类命名为金黄短杆菌（Brevibacterium aureum）CT‑A16，已于2019年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19000。该菌株能有效地抑制食用菌病原菌菌丝生长及孢子萌发。该菌株的挥发性物质对病原菌菌丝生长具有强的抑制作用。该菌株在食用菌病原菌的的防治中有巨大应用价值。

Description

一株内生金黄短杆菌CT-A16及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株内生金黄短杆菌CT-A16及其应用。

背景技术

食用菌（Edible fungi）是一种可供人类食用的大型真菌的统称，或是形成可食用子实体的大型真菌，俗称蘑菇。食用菌具有高蛋白、低脂肪，含人体所需多种氨基酸和微量元素，兼有荤食和素食的优势，同时在作为人类主粮、保健和药用方面前景广泛。

食用菌如同我们所熟知的栽培植物一样，都要求适宜的生长环境，在其所能适应的环境条件下才能正常生长发育。如果在食用菌生长发育过程中遭受到了其它生物的侵害或遇到不良环境条件，就会发生病害，其生长发育就会受到影响，发病较轻时影响食用菌的外观口感等，发病严重时则造成食用菌彻底死亡。从食用菌病理性危害发病的原因来看可分成两大类:侵染性病害和非侵染性病害。非侵染性病害是在其生长发育所需要的条件不适宜或生长过程中遭受有害物质影响，并无病原物的侵染，不会在食用菌之间相互传染更不会造成大片污染。对食用菌造成严重影响的是侵染性病害，即因为别的生物寄生或侵染而引发的病害。

中国食用菌产业发展的较早，在最近30年发展迅速，食用菌产业进入了产业转型的关键时期，在食用菌栽培过程中，由于病虫的危害导致减产10%-30%，严重的情况下甚至会颗粒无收。近年来研究发现有关食用菌侵染性真菌病害的病原物包括链孢霉（Fusarium）、疣孢霉(Mycogone)形成的病害表现常见的有蘑菇褐腐病、湿泡病、白腐病等；轮枝霉（Verticillium）形成的病害常见的有蘑菇褐斑病、蘑菇干泡病等；树枝状轮枝孢霉（Dactlium denoides）形成的病害常见的有蘑菇软腐病、蛛网病等。食用菌竞争性真菌病害的病原物包括有毛霉(Mucor)、青霉（Penicillium）、木霉（Trichoderma）、曲霉（Aspergillus）、根霉（Rhizopus）等。侵染性细菌病害的主要病原物包括有欧文氏菌（Erwinia）和假单胞杆菌（Pseudomonas），形成的病害常见的有蘑菇细菌性斑点病、蘑菇细菌凹点病、蘑菇干腐病等。

食用菌病害的防治是食用菌生产成败的关键，目前主要的防治方法有抗病菌株的筛选、化学防治、物理防治及生物防治。最常见的方法就是化学防治，但长时间使用单一的化学药剂会使病原菌的抗性增强，防治效果下降，而且药品的残留量大会对人的身体健康造成威胁，也会导致严重的环境污染。生物防治则具有许多优点，因此近些年来受到了世界各地的普遍重视。其中生物防治所用的微生物菌剂能够促进作物生长，增强抗病性，提高产量，改善品质，在许多农作物生产上已取得较好的应用效果。微生物菌剂具有无毒、安全、高效的特点，符合发展生态农业的方向。但微生物菌剂在食用菌栽培中的应用还很少，因此，针对食用菌病害开展生物防治，探索微生物菌剂在食用菌病害防治上的应用是确保食用菌产业良性、健康发展的重要方向之一，应加以大力鼓励与支持。

植物内生细菌生活史的一定阶段或全部阶段均生活在健康植物的各种组织和器官内部, 并且与植物建立了和谐联合关系。植物内生菌能够引起广泛关注主要是由于它能够产生多种多样的具有农药活性的次生代谢产物，研究表明，含有内生菌的植物宿主一般都具有生长快、抗逆境、抗病害等优势；对作物生长发育、抵抗疾病以及不良环境具有广泛的生物学作用，是非常难得的天然生物资源，在农业生产中具有良好的研究和开发潜力。人们已经从富贵竹、辣椒、柑橘、杨树、烟草、铁皮石斛等多种植物中分离到多种内生细菌^[11-17]，针对植物组织内生且对植物病原菌具有较强拮抗效果的功能细菌也进行了相应的研究，Sheng等从植物体内分离到能降解有机污染物或具有重金属抗性的内生细菌。何红等也证明分离自辣椒的内生芽孢杆菌对辣椒炭疽病菌有拮抗活性。用植物内生的枯草芽孢杆菌处理辣椒苗，然后再接种病原菌，能够将发病率降低到81.49%-93.34%。但目前对食用菌主要病原物具有较强拮抗效果生防功能内生细菌方面尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于针对食用菌生防菌稀缺的问题，提供一株内生金黄短杆菌CT-A16及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株内生金黄短杆菌CT-A16，其分类命名为金黄短杆菌（Brevibacterium aureum）CT-A16，已于2019年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19000，保藏地址为：中国北京。

所述内生金黄短杆菌CT-A16的菌落特征及菌体形态为：

将CT-A16在NA平板上培养24h后形成菌落颜色为白色，无光泽，菌落呈圆形、边缘光滑整齐，无流动性，菌落4-5mm。菌体短杆状，革兰氏染色阳性，无芽孢，有荚膜。

所述内生金黄短杆菌CT-A16的生理生化特征：

CT-A16接触酶反应呈阳性，V．P测定呈阴性，甲基红测定呈阴性，葡萄糖产酸试验阴性，葡萄糖产气试验阴性，柠檬酸盐试验阳性，硝酸盐还原反应呈阳性，淀粉水解呈阳性，需氧性测定呈阴性，吲哚试验呈阴性，丙二酸呈阳性，产H2S试验呈阳性。

将所述内生金黄短杆菌CT-A16的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明: CT-A16与Brevibacterium aureum 同处于一个分支上，其16S rDNA序列与Brevibacterium aureum（KF002253）的相似度达99%。结合菌落形态，生理生化特征和16SrDNA序列分析，鉴定为金黄短杆菌（Brevibacterium aureums）。

所述内生金黄短杆菌CT-A16对食用菌病原菌具有强的拮抗效果，能有效地抑制食用菌病原菌菌丝生长及孢子萌发，内生拮抗细菌挥发性物质对病原菌菌丝生长具有较强的抑制作用。

上述内生金黄短杆菌CT-A16在食用菌病原菌防治中的应用。

一种含上述内生金黄短杆菌CT-A16的生物制剂。

一种含上述内生金黄短杆菌CT-A16过滤液的生物制剂，所述过滤液的制备方法为：取内生金黄短杆菌菌株CT-A16，用无菌接种环挑取单菌落，接种于装液量为 100 mL 的LB液体培养基的 250 mL 三角瓶中，在28 ℃，180r/min的条件下培养3d，４℃，10000 r/min离心15 min取得上清液，在无菌条件下，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤后制得过滤液。

一种含上述内生金黄短杆菌CT-A16灭菌液的生物制剂；所述灭菌液的制备方法为：取内生金黄短杆菌菌株CT-A16，用无菌接种环挑取单菌落，接种于装液量为 100 mL 的LB液体培养基的 250 mL 三角瓶中，在28 ℃，180r/min的条件下培养3d，菌液放入高压灭菌锅，121℃条件下灭菌30min，制得灭菌液。

上述含内生金黄短杆菌CT-A16，或内生金黄短杆菌CT-A16过滤液，或内生金黄短杆菌CT-A16灭菌液的生物制剂在食用菌病原菌防治中的应用。

本发明的有益效果：

本发明的内生金黄短杆菌CT-A16能有效地抑制食用菌病原菌菌丝生长及孢子萌发，内生金黄短杆菌CT-A16挥发性物质对病原菌菌丝生长具有较强的抑制作用。内生金黄短杆菌CT-A16对6种食用菌病原菌菌丝生长的抑制效果均在“++”以上；20%的内生金黄短杆菌CT-A16过滤液对油疤病菌的抑制率为83.26%，对疣孢病菌的抑制率达到66.27%，对蛛网病菌的抑制率为62.17%。浓度为40%内生金黄短杆菌CT-A16过滤液对病原菌孢子萌发抑制率为92.46%-100%。内生金黄短杆菌CT-A16挥发性物质对病原菌菌丝生长表现出较强的抑制作用。因此，本发明为将来开发食用菌病害生物防治的微生物菌剂提供了良好的菌株资源。

附图说明

图1 CT-A16对黄色霉菌的拮抗效果图。

图2不同温度对内生金黄短杆菌CT-A16的影响。

图3不同pH对内生金黄短杆菌CT-A16的影响。

图4内生金黄短杆菌CT-A16的生长曲线。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

一株内生金黄短杆菌CT-A16，其分类命名为金黄短杆菌（Brevibacterium aureum）CT-A16，已于2019年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19000。

实施例1 毛竹内生金黄短杆菌CT-A16的筛选

（1）筛选过程：

通过梯度稀释法，从福建省武夷山市、长汀县、将乐县毛竹中心产区I度毛竹中分离出82株分离物。通过三区划线法对分离到的内生细菌进行纯化，并通过镜检判断菌株是否纯化，对纯化后的细菌进行编号，挑取单菌落，转移到NA斜面培养基上保存备用。通过平板对峙法对6种食用菌病原菌（油疤病菌（Scytalidium lignicola）、蛛网病菌（Cladobotryum semicirculare）、粘菌病菌（Comatrichapulchell(C.Bab)Rost sp.）、绿色木霉（Trichoderma pleuroticola）、青霉（Penicillium cyclopium）、黄色霉菌（Disporotrichum dimorphosporum））进行对峙培养，初步筛选对食用菌病原菌具有拮抗作用的内生细菌。并通过平板对峙法、滤纸片法、牛津杯法等不同处理方法对食用菌病原菌的拮抗效果进行复筛。最终筛选出一株具有良好拮抗效果的内生细菌，标记为CT-A16。

（2）菌落特征及菌落形态：

将CT-A16在NA平板培养基上培养24h后形成菌落颜色为白色，无光泽，呈圆形、边缘不整齐，无流动性，革兰氏染色阳性，无芽孢，有荚膜；菌落4-5mm。

（3）生理生化特征：

CT-A16接触酶反应呈阳性，V．P测定呈阴性，甲基红测定呈阴性，葡萄糖产酸试验阴性，葡萄糖产气试验阴性，柠檬酸盐试验阳性，硝酸盐还原反应呈阳性，淀粉水解呈阳性，需氧性测定呈阴性，吲哚试验呈阴性，丙二酸呈阳性，产H₂S试验呈阳性。

（4）拮抗能力测定：

拮抗能力初筛：

利用已分离的82株内生细菌，通过平板对峙法对6种食用菌病原菌（油疤病菌、蛛网病菌、粘菌病菌、绿色木霉、青霉、黄色霉菌）进行对峙培养，筛选对食用菌病原菌具有拮抗作用的内生细菌。

平板对峙法：将溶化好的PDA培养基冷却到 55℃左右，倒平板，平板冷凝后，在平板中央接入病原菌琼脂块，在距中央 2.0 cm-2.5 cm 处接入内生细菌菌株，以单独接种病原菌琼脂块为对照，然后将平板置于培养箱 28℃培养，每个处理3次重复，观察有无抑菌圈并判定拮抗作用的强弱。

拮抗作用强弱的判定：

“+++”表示强抑菌效果，内生细菌菌落周围有明显的抑菌圈；

“++”表示中等抑菌效果，内生细菌菌落周围有抑菌圈，细菌与病原菌或食用菌对峙生长，病原菌不能覆盖内生细菌菌落继续生长；

“+”表示较弱抑菌效果，但病原菌或食用菌能覆盖细菌菌落继续生长；

“-”表示无抑菌效果；内生细菌对病原菌或食用菌的生长无任何影响。

拮抗能力复筛：

选取平板初筛过程中对食用菌病原菌具有拮抗效果的内生细菌，通过平板对峙法、滤纸片法、牛津杯法对食用菌病原菌的拮抗效果进行复筛。

将平板初筛过程中具有拮抗效果的内生细菌接种于装液量为100 mL 的NA液体培养基的250 mL三角瓶中，每个处理3 次重复。在28 ℃，180r/min的条件下培养72 h，通过离心（4℃，10000 r/min，15 min）取得上清液，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤后将所得滤液用于滤纸片法和牛津杯法的测定。

平板对峙法：将溶化好的PDA培养基冷却到 55℃左右，倒平板，平板冷凝后，在平板中央接入病原菌琼脂块，在距中央 2.0 cm-2.5 cm 处接入内生细菌菌株，以单独接病原菌琼脂块为对照，然后将平板置于培养箱 28℃培养，每个处理3次重复，观察抑菌圈情况并测量抑菌圈直径的大小。

滤纸片法：溶化好的PDA培养基冷却到 55℃左右，倒平板，平板冷凝后，将活化好的病原菌用无菌水稀释后涂布到培养基上，在待检测平板上接上蘸有内生菌过滤液的滤纸片（直径10mm），然后将平板置于培养箱 28℃培养，每个处理3次重复，观察有无抑菌圈并测量抑菌圈直径的大小。

牛津杯法：将已灭菌的琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿10ml，待其凝固（下层）。此外，将融化的PDA培养基冷却到50℃左右混入病原菌菌液，将混有菌液的培养基15ml加到已凝固的培养基上待凝固（上层）。以无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯（内径6mm、外径8mm、高10 mm），轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入内生细菌过滤液，加满后将平板置于培养箱 28℃培养，每个处理3次重复，观察有无抑菌圈并测量抑菌圈直径的大小。

采用平板对峙法测定内生细菌对食用菌病原菌的拮抗效果，结果表明，82株内生细菌中有8株内生细菌对6种食用菌病原菌均表现出较好的拮抗效果。

通过平板对峙法、滤纸片法、牛津杯法等三种不同处理方法对平板初步筛选出的8株内生细菌的拮抗效果进行复筛，其中平板对峙法的测定是采用内生细菌菌株直接对食用菌病原菌菌丝生长的抑菌影响，从拮抗效果来看，各内生细菌菌株的拮抗效果与平板初筛时基本一致。滤纸片法和牛津杯法的测定时采用内生细菌发酵过滤液对食用菌病原菌菌丝生长的抑菌影响。从抑菌强度上来看，滤纸片法和牛津杯法测定的抑菌效果稍弱于平板对峙法的测定。通过三种处理方法测定8株内生细菌对食用菌病原菌的拮抗效果，筛选出了对主要食用菌病原菌均具有较好拮抗效果的金黄短杆菌CT-A16。CT-A16对黄色霉菌的拮抗效果见图1。金黄短杆菌CT-A16对食用菌病原菌的拮抗初筛、复筛效果见表1和表2，这为后续内生拮抗细菌抗病机理研究及防病微生物菌剂的制备奠定了基础。

表1 内生金黄短杆菌CT-A16对食用菌病原菌的拮抗初筛效果

注：“-”表示没有抑菌效果；“+”表示弱抑菌效果；“++”表示中等抑菌效果；“+++”表示强抑菌效果。下同。

表2 不同处理方法测定内生金黄短杆菌CT-A16对食用菌病原菌的拮抗复筛效果

注：1.“-”表示抑菌效果弱。

2.表中“a、b”代表同一种处理方法下，内生金黄短杆菌CT-A16对不同病原菌抑菌效果的差异。

（5）内生金黄短杆菌CT-A16生长最适温度的测定

取洁净试管，分别加入10ml LB液体培养基，灭菌冷却后将内生金黄短杆菌CT-A16种子液（将CT-A16菌株在LB液体培养基中，28 ℃，180 r/min 条件下振荡培养 3d，用无菌水稀释制成含1× 10⁸cfu/mL 的菌悬液）按 1%分别接种于液体培养基试管中，分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃， 6 个温度梯度下、180 r/min 振荡培养24 h，以不接种内生金黄短杆菌CT-A16的LB液体培养基作为对照，每个处理三个重复，测定 OD₆₀₀值，以确定其生长的最适温度。

如图2所示，内生金黄短杆菌CT-A16随着培养温度的逐步升高OD₆₀₀值也逐步升高，培养温度达到30℃时OD₆₀₀值最大。在30℃-40℃时，随着培养温度的增加OD₆₀₀值呈下降趋势。从以上数据可以看出内生金黄短杆菌CT-A16的最适生长温度为30℃。

（6）内生金黄短杆菌CT-A16生长最适pH的测定

取洁净试管，分别注入10ml LB液体培养基，用 1 mol/L HCl或 1 mol/L NaOH 调整液体培养基的初始 pH，使培养基的 pH 梯度为 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，并且每个处理三个重复，按 1%分别接种内生金黄短杆菌CT-A16种子液，30℃下 180 r/min，振荡培养24 h，测定 OD₆₀₀值，以确定其生长的最适 pH 值。

如图3所示，内生金黄短杆菌CT-A16的OD₆₀₀值随PH的增加逐步升高，待pH为6时达到最高，随后OD₆₀₀随pH的增加呈下降趋势。即最佳生长pH值为6.0，生长范围pH5.0-pH7.0。

（7）内生金黄短杆菌CT-A16生长曲线的测定

取洁净试管，分别加入10ml LB液体培养基，灭菌冷却后，按 1%的接种量分别接种内生金黄短杆菌CT-A16，30℃下 180 r/min，振荡培养。以开始放摇床振荡培养开始进行第一次取样（零小时取样），测量其OD₆₀₀值。以后按每 2 个小时定时取样，测定菌液的 OD₆₀₀值。

如图4所示，由内生金黄短杆菌CT-A16不同时段内的OD₆₀₀值所反映出的生长曲线呈现出阶段性变化：第一阶段迟滞期：生长16h内，OD₆₀₀值呈现逐步增长的趋势，增长速度非常缓慢。第二阶段对数生长期：生长16-34h内，OD₆₀₀值呈现快速增长趋势，38h时OD₆₀₀值达到峰值。随后进入稳定期：生长34-40h（或40h以后）内OD₆₀₀值不再增加并出现降低现象。综上所述，在测定时间内内生金黄短杆菌CT-A16的生长阶段为：第一阶段迟滞期（生长16h内）细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程。第二阶段对数生长期（约16h-32h）细菌几乎均已完成营养生长，开始快速的繁殖增长，菌数显著增多；此时期活菌数直线上升，细菌以稳定的几何级数极快增长。第三阶段稳定期（34h-40h及以后），从测定时间来看，培养40h时内生金黄短杆菌CT-A16基本上是处于稳定期的阶段，尚未进入衰退阶段。

（8）16S rDNA序列分析

金黄短杆菌CT-A16的16S rDNA基因序列，其核苷酸序列见SEQ ID NO.1所示。将所测的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明: CT-A16与Brevibacterium aureum 同处于一个分支上，其16S rDNA序列与Brevibacterium aureum（KF002253）的相似度达99%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，鉴定为金黄短杆菌（Brevibacterium aureums）。

实施例2 内生金黄短杆菌CT-A16发酵过滤液对病原菌菌丝生长抑制效果实验

取内生金黄短杆菌菌株CT-A16，用无菌接种环挑取单菌落，接种于装液量为 100mL 的LB液体培养基的 250 mL 三角瓶中，每个处理3 次重复。在28 ℃，180r/min的条件下培养3d，通过离心（４℃，10000 r/ min，15 min）取得上清液，在无菌条件下，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤后将所得滤液备用。

采用菌落生长法测定过滤液的抑菌活性，将上述内生金黄短杆菌CT-A16过滤液与PDA培养基按不同体积百分比(5%、10%、15%、20%)混合制成混合平板，以不加过滤液的PDA平板为对照。分别在平板中央接入病原菌菌原片,每个处理3次重复，置于28℃恒温培养，然后观察病原菌的菌丝生长状况，待对照CK满板时采用十字交叉法测量菌丝直径。

采用下公式计算抑制率：

相对抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%

通过对病原菌菌丝生长情况进行观察，统计不同比例内生菌过滤液对不同病原菌的抑制率，结果如表3，可以看出内生金黄短杆菌CT-A16对病原菌的抑制效果，菌液浓度为20%内生金黄短杆菌CT-A16对油疤病菌原菌的抑制效果最好。

表3不同浓度内生金黄短杆菌CT-A16过滤液对病原菌菌丝生长的抑制率

实施例3 内生金黄短杆菌CT-A16发酵灭菌液对病原菌菌丝生长抑制效果实验

采用菌落生长法测定灭菌液的抑菌活性，将实施例2 LB培养液中培养好的内生金黄短杆菌CT-A16 菌液放入高压灭菌锅，121℃条件下灭菌30min，然后将上述内生金黄短杆菌CT-A16灭菌液按照体积百分比为5%、10%、15%、20%四个比例与PDA培养基混合，制成混合培养基平板，以不加灭菌液的PDA平板为对照。分别在平板中央接入病原菌菌原片,每个处理3次重复，置于28℃恒温培养，然后观察病原菌的菌丝生长状况，待对照CK满板时采用十字交叉法测量菌丝直径。

采用下公式计算抑制率：

通过对病原菌菌丝生长情况进行观察，统计不同比例内生菌灭菌液对不同病原菌的抑制率，结果如表4，可以看出浓度为20%的内生金黄短杆菌CT-A16灭菌液对于病原菌的抑制效果最好，其次是疣孢病菌、再次之是蛛网病菌。

表4不同浓度内生金黄短杆菌CT-A16灭菌液对病原菌菌丝生长的抑制率

实施例4 内生金黄短杆菌CT-A16发酵过滤液对病原菌孢子萌发抑制效果实验

取实施例2制备的内生金黄短杆菌CT-A16过滤液，将过滤液按照体积百分比为20%、40%两个比例与PDA培养基混合，制成混合培养基平板。在生长成熟的三个病原菌的培养皿中加入无菌水，收集病原菌孢子，制成1×10⁷个/mL孢子悬浮液。然后用移液枪将100ul孢子悬浮液加入上述混合培养基平板上，用涂布棒涂抹均匀。每个处理3次重复，置于28℃恒温培养，然后观察病原菌的孢子萌发状况。

通过对病原菌孢子萌发生长情况进行观察，统计不同比例内生菌过滤液对不同病原菌的抑制率，结果如表5；可以看出内生金黄短杆菌CT-A16对于病原菌最好的抑制效果的浓度为40%，对疣孢病菌、油疤病菌都能100%的抑制孢子的萌发，对蛛网病菌孢子萌发的抑制效果相对较弱。

表5不同浓度内生金黄短杆菌CT-A16过滤液对病原菌孢子萌发的抑制率

实施例5 内生金黄短杆菌CT-A16发酵灭菌液对病原菌孢子萌发抑制效果实验

取实施例3内生金黄短杆菌CT-A16灭菌液，将灭菌液按照体积百分比为20%、40%两个比例分别与PDA培养基混合，制成混合培养基平板。在生长成熟的三个病原菌的培养皿中加入无菌水，收集病原菌孢子，制成1×10⁷个/mL孢子悬浮液。然后用移液枪将100 ul孢子悬浮液加入上述混合培养基平板上，用涂布棒涂抹均匀。每个处理3次重复，置于28℃恒温培养，然后观察病原菌的孢子萌发状况。

通过对病原菌孢子萌发生长情况进行观察，统计不同比例内生菌灭菌液对不同病原菌孢子萌发的抑制效果。结果如表6，可以看出浓度为40%内生金黄短杆菌CT-A16发酵灭菌液对病原菌的抑制效果最佳，对疣孢病菌和油疤病菌的抑制效果较好。

表6 不同浓度内生金黄短杆菌CT-A16灭菌液对病原菌孢子萌发的抑制率

实施例6 内生金黄短杆菌CT-A16挥发性物质对病原菌菌丝生长抑制效果实验

将三个病原菌菌株（油疤病菌、疣孢病菌、蛛网病菌）和内生金黄短杆菌CT-A16分别点种转接到不同的PDA平板上，并分别在适宜的温度条件下培养2 d后在无菌条件下，去掉平板盖，将接有病原菌的培养皿与接有内生金黄短杆菌CT-A16的培养皿相对扣合，并用封口膜沿边缘封口，防治挥发性物质漏出。以不接内生金黄短杆菌CT-A16的作为对照，置于28℃恒温培养，每个处理3个重复。观察病原菌的菌丝生长情况并计算抑菌率。

采用下公式计算抑制率：

通过观察病原菌与内生金黄短杆菌CT-A16对接密封的培养皿中病原菌的菌丝生长状况，结果表明内生金黄短杆菌CT-A16挥发性物质对病原菌菌丝生长具有一定的抑制作用。从表7可以看出内生金黄短杆菌CT-A16挥发性物质对于油疤病菌、蛛网病菌的抑制效果比较好，对于疣孢病菌的抑制效果相对较弱。

表7内生金黄短杆菌CT-A16挥发性物质对病原菌菌丝生长的影响

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 闽江学院

<120> 一株内生金黄短杆菌CT-A16及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1415

<212> DNA

<213> SEQ ID NO.1

<400> 1

gctggctcca taaaggttac ctcaccgact tcgggtgtta caaactctcg tggtgtgacg 60

ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag 120

cgattccagc ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc gaactgagaa cagatttgtg 180

ggattggctt aacctcgcgg tttcgctgcc ctttgttctg cccattgtag cacgtgtgta 240

gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac 300

cggcagtcac cttagagtgc ccaactgaat gctggcaact aagatcaagg gttgcgctcg 360

ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc 420

actctgcccc cgaaggggac gtcctatctc taggattgtc agaggatgtc aagacctggt 480

aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt 540

caattccttt gagtttcagt cttgcgaccg tactccccag gcggagtgct taatgcgtta 600

gctgcagcac taaggggcgg aaacccccta acacttagca ctcatcgttt acggcgtgga 660

ctaccagggt atctaatcct gttcgctccc cacgctttcg ctcctcagcg tcagttacag 720

accagagagt cgccttcgcc actggtgttc ctccacatct ctacgcattt caccgctaca 780

cgtggaattc cactctcctc ttctgcactc aagttcccca gtttccaatg accctccccg 840

gttgagccgg gggctttcac atcagactta agaaaccgcc tgcgagccct ttacgcccaa 900

taattccgga caacgcttgc cacctacgta ttaccgcggc tgctggcacg tagttagccg 960

tggctttctg gttaggtacc gtcaaggtgc cgccctattt gaacggcact tgttcttccc 1020

taacaacaga gctttacgat ccgaaaacct tcatcactca cgcggcgttg ctccgtcaga 1080

ctttcgtcca ttgcggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtctg ggccgtgtct 1140

cagtcccagt gtggccgatc accctctcag gtcggctacg catcgtcgcc ttggtgagcc 1200

gttacctcac caactagcta atgcgccgcg ggtccatctg taagtggtag ccgaagccac 1260

cttttatgtc tgaaccatgc ggttcaaaca accatccggt attagccccg gtttcccgga 1320

gttatcccag tcttacaggc aggttaccca cgtgttactc acccgtccgc cgctaacatc 1380

agggagcaag ctcccatctg tccgctcgac ttgca 1415

Claims

1.一株内生金黄短杆菌CT-A16，其特征在于：所述金黄短杆菌CT-A16的分类命名为金黄短杆菌（Brevibacterium aureum）CT-A16，已于2019年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19000。

2.如权利要求1所述一株内生金黄短杆菌CT-A16在食用菌病原菌防治中的应用，其特征在于：所述食用菌病原菌包括油疤病菌（Scytalidium lignicola）、蛛网病菌（Cladobotryum semicirculare）、粘菌病菌（Comatrichapulchell(C.Bab)Rost sp.）、绿色木霉（Trichoderma pleuroticola）、青霉（Penicillium cyclopium）、黄色霉菌（Disporotrichum dimorphosporum）。

3.一种含如权利要求1所述一株内生金黄短杆菌CT-A16的生物制剂。

4.一种含如权利要求1所述一株内生金黄短杆菌CT-A16过滤液的生物制剂，其特征在于：所述过滤液的制备方法为：取内生金黄短杆菌菌株CT-A16，用无菌接种环挑取单菌落，接种于装液量为 100 mL 的LB液体培养基的 250 mL 三角瓶中，在28 ℃，180r/min的条件下培养3d，４℃，10000 r/ min离心15 min取得上清液，在无菌条件下，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤后，制得过滤液。

5.一种含如权利要求1所述一株内生金黄短杆菌CT-A16灭菌液的生物制剂，其特征在于：所述灭菌液的制备方法为：取内生金黄短杆菌菌株CT-A16，用无菌接种环挑取单菌落，接种于装液量为 100 mL 的LB液体培养基的 250 mL 三角瓶中，在28 ℃，180r/min的条件下培养3d，菌液放入高压灭菌锅，121℃条件下灭菌30min，制得灭菌液。

6.如权利要求4至5任一项所述生物制剂在食用菌病原菌防治中的应用，其特征在于：所述食用菌病原菌包括：油疤病菌（Scytalidium lignicola）、蛛网病菌（Cladobotryumsemicirculare）。