CN116218720A - 一株绿针假单胞菌pck02及其获取方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株绿针假单胞菌PCK02及其获取方法与应用，其命名为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)PCK02菌株，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.20524。菌株PCK02可在浓度高达10g/L的几丁质为唯一碳源的培养基中正常生长；其接种于甘油酪素培养基发酵48小时，与载体混合后可制备10‑1000亿/g绿针假单胞菌PCK02的固体制剂。本发明绿针假单胞菌PCK02浓度为1.0亿个/mL对南方根结线虫致死率为86.6％，对农业作物根结线虫病害具有较好防控作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物基因工程，特别涉及一株绿针假单胞菌PCK02及其获取方法与应用。
背景技术
本发明中的绿针假单胞菌能利用几丁质唯一碳源生长，产生一种降解几丁质的水解酶即几丁质酶。在植物抗病原真菌和重寄生微生物抑真菌过程中，该酶起着重要的作用。线虫卵壳中含有厚约1μm的几丁质层，人们推测几丁质对线虫卵的存活和发育可能产生一定的影响。绿针假单胞菌是一种重要的生防菌种，由该菌产生的几丁质酶能显著增加根结线虫卵的孵化率，并引起孵出幼虫死亡。利用微生物技术筛选高效产几丁质酶的绿针假单胞菌PCK02为有效成分进行根结线虫防治，在植物寄生线虫防治应用上，具有杀虫活性高，作用时间长，使用安全等优点。本发明推进农业病虫害绿色防控，促进生态环境可持续发展具有重要意义。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的，是提供一株绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)PCK02及其获取方法与应用，菌种PCK02可产较高几丁质酶，对南方根结线虫致死率为86.6％，对农业作物根结线虫病害具有较好防控作用。
本发明所提供的绿针假单胞菌PCK02来源于根结线虫侵染的病害作物根部土壤中，经过人工富集、筛分及纯化所得。PCK02菌落呈圆形，边缘光滑，中心隆起，菌落呈桔红黄色，半透明，产生橙色荧光色素，革兰氏染色呈阴性，短杆状，无芽孢，好氧，28℃下生长良好，有苦杏仁气味。经对该菌株的16S rDNA的鉴定与序列分析，结合生理生化检测，表明该菌株为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)。命名为绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis)PCK02，于2020年8月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.20524。
为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：
一株绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)，命名为PCK02，其保藏编号为CGMCC No.20524。上述绿针假单胞菌的16S rDNA片段的序列如SEQ ID NO.1所示。
上述绿针假单胞菌的获取方法，包括以下步骤：
A、采集感染根结线虫病害的黄瓜、西红柿根，抖落收集根部土壤于无菌袋中作为分离样源；
B、以几丁质为单一碳源，制备含有10.0g/L几丁质无机盐培养基用稀盐酸调pH值至7.2-7.4，500mL三角瓶分装100mL，121℃灭菌32min备用；
C、待培养基灭菌后温度降低到30-40℃左右时，在超净台下按照5％的质量比加入病根土，三角瓶置于35℃、200rpm的恒温摇床中进行富集培养48h；
D、之后重复5％接种培养5次代后，取样在固体几丁质培养基A平板上反复划线分离出单菌株，挑起透明圈较大的菌株接种入上述液体几丁质无机培养基A内驯化，再将上述操作重复多次，划线接入固体几丁质无机培养基A培养,挑选产桔红色菌落之后纯化得到绿针假单胞菌菌株，命名为PCK02。上述的绿针假单胞菌PCK02的获取方法，其所述几丁质无机盐培养基的配方(g/L)为：几丁质10.0，K2HPO4 0.8，KH2PO40.4，NaNO33.0，MgS04·7H2O0.45，ZnSO40.02，调节pH7.2-7.4；
上述的绿针假单胞菌PCK02制备固体制剂，其特征在于：将绿针假单胞菌PCK02活化后接种于甘油酪素培养基，发酵培养48h获得菌液，将菌液与含有羟丙基环糊精、几丁质、凹凸棒、维生素C的混合物按1:5的质量比例混合，烘干水份至10％，既得含有10-1000亿/g绿针假单胞菌PCK02的固体制剂。
所述甘油酪素培养基(g/L)的配方为：
甘油20，水解酪素4.5，K2HPO4·3H2O 5.8，(NH4)2SO4 2.4，FeSO4·7H2O 0.20，ZnCl20.04，赖氨酸0.01，调节pH7.4。
上述的绿针假单胞菌PCK02的应用，包括作为活性成分的绿针假单胞菌PCK02和载体用于猕猴桃、玉米、蔬菜等作物的根结线虫病害防治。
上述绿针假单胞菌PCK02的应用，其特征在于：所述活性成分的绿针假单胞菌PCK02和载体，稀释100-1000倍后，蘸根、拌种、喷洒使用，防治包含南方根结线虫、北方根结线虫或爪哇根结线虫引起的病害。
依据本发明，由于绿针假单胞菌PCK02菌株具有高效产几丁质酶特性，可应用于根结线虫病害防治。本发明与现已发现的绿针假单胞菌相比，产几丁质酶特征明显，根结线虫防治效果也显著提高。
本发明的特点可参阅本案图式及以下较好实施方式的详细说明而获得清楚地了解。
附图说明
图1为本发明根结线虫病害土壤微生物在几丁质无机盐培养基生长形态；
图2为本发明的绿针假单胞菌PCK02的菌落和显微镜形态图；
图3为本发明的绿针假单胞菌PCK02利用甘油酪素培养基发酵的生长曲线；
图4为本发明的绿针假单胞菌PCK02制剂对根结线虫杀虫效果试验。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
一、绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis PCK02菌株的获取与保藏
采集感染根结线虫病害的黄瓜、西红柿根，抖落收集根部土壤于无菌袋中，冷藏保存带回实验室作为分离样源；制备含有5.0g/L几丁质无机盐培养基A用稀盐酸调pH值至7.2-7.4，500mL三角瓶分装100mL，(所述几丁质无机盐培养基的配方(g/L)为：几丁质5.0，K2HPO4 0.8，KH2PO40.4，NaNO33.0，MgS04·7H2O 0.45，ZnSO40.02)；121℃灭菌32min备用；待培养基灭菌后温度降低到30-40℃左右时，在超净台下按照5％的质量比加入病根土，三角瓶置于35℃、200rpm的恒温摇床中进行富集培养48h；之后重复5％接种培养5次代后，取样在固体几丁质培养基平板上反复划线分离出单菌株，土壤微生物生长如图1所示，挑起透明圈较大的菌株接种入上述液体几丁质无机培养基内驯化，再将上述操作重复多次，划线接入固体几丁质无机培养基,挑选呈桔红色菌落之后纯化得到绿针假单胞菌菌株，命名为PCK02。PCK02菌落呈圆形，边缘光滑，中心隆起，菌落呈桔红黄色，半透明，产生橙色荧光色素，革兰氏染色呈阴性，短杆状，无芽孢，好氧，28℃下生长良好，有苦杏仁气味，菌株平板划线及显微形态如图2所示。
二、绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis PCK02菌株的鉴定与保存
将分离出的PCK02菌株进行16SrDNA序列的扩增、二代测序与数据库比对。利用细菌基因组提取试剂盒(TIANGEN，北京)提取PCK02菌株的基因组DNA，之后，利用16S rDNA片段扩增与检测试剂盒(TIANGEN，北京)扩增该菌株的16S rDNA片段并利用二代测序技术(北京奥科生物公司)进行序列测定、拼接。PCK02菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。与NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对，结合菌种理化特征鉴定结果(表1)，表明该PCK02菌株为绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis。命名为绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)PCK02，于2020年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.20524。
表1菌种PCK02理化特征鉴定表
| 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 |
| 革兰氏染色 | - | 荧光色素 | + |
| 过氧化氢酶 | + | H2S的产生 | - |
| 葡萄糖利用 | + | 淀粉水解 | - |
| 蔗糖利用 | + | 明胶液化 | + |
| 柠檬酸盐利用 | + | 4％NaCl | + |
| 蔗糖利用 | + | 8％NaCl | - |
| 硝酸盐还原 | + | pH 6 | + |
三、绿针假单胞菌Pseudomonas chlororaphis PCK02菌剂制备及对南方根结线虫的杀虫应用效果。
(1)菌剂制备：将绿针假单胞菌PCK02菌株活化后接种于甘油酪素固体培养基(所述甘油酪素培养基(g/L)的配方为：甘油20，水解酪素4.5，K2HPO4·3H2O 5.8，(NH4)2SO42.4，FeSO4·7H2O 0.20，ZnCl2 0.04，L-天冬氨酸0.01，调节pH7.4)，35℃恒温摇床，200r/min发酵培养48h,获得含量有500亿个/mL绿针假单胞菌PCK02的发酵液(图3)，然后将发酵液按照20％加入到羟丙基环糊精、几丁质、凹凸棒、维生素C的混合物中，混合均匀后烘干水份至10％。即得100亿/g的绿针假单胞菌PCK02固体制剂。
(2)南方根结线虫悬浮液制备：从根结线虫发病较重的植株上挑取根结上的卵块，待根结线虫幼虫在常温下孵化后，用浅盘法分离幼虫，镜检后稀释线虫悬浮液，使每1mL悬浮液中含有400-500头二龄幼虫，常温存放备用。
(3)杀虫效果检测：采用浸渍法。根据预备实验的情况，绿针假单胞菌PCK02菌剂设置5个浓度处理，用水将其稀释成100倍、200倍、400倍、800倍、1600倍的稀释液。空白对照设置1个处理，每个处理均设置3个重复。取24孔生化测试板，各取1mL供试液置于小孔中，加入等体积的线虫悬浮液，空白处理加入等量的清水，处理24小时后检查南方根结线虫二龄幼虫的存活数量和死亡数量。死亡率和校正死亡率按如下公式计算：
死亡率＝(线虫死亡数/线虫总数)*100％
相对致死率＝(处理死亡率-对照死亡率死亡率)/(1-空白组死亡率)*100表2绿针假单胞菌PCK02对南方根结线虫的杀虫效果
绿针假单胞菌PCK02对南方根结线虫毒力测定结果见表2。从结果可以看出，绿针假单胞菌对南方根结线虫不同倍数都有致死效果(图4)，稀释1600倍有致死效果，稀释100倍效果最好，其最大的致死率为86.6％，浓度为1.0亿个/mL绿针假单胞菌。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施内容方式不收上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、代替、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一株绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)菌株，命名为PCK02，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.20524。
2.根据权利要求1所述的绿针假单胞菌PCK02，其特征在于，所述绿针假单胞菌的16SrDNA片段的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的绿针假单胞菌PCK02的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、采集感染根结线虫病害的黄瓜、西红柿根，抖落收集根部土壤于无菌袋中作为分离样源；
B、以几丁质为单一碳源，制备含有5.0g/L几丁质无机盐培养基A用稀盐酸调pH值至7.2-7.4，500mL三角瓶分装100mL，121℃灭菌32min备用；
C、待培养基灭菌后温度降低到30-40℃左右时，在超净台下按照5％的质量比加入混合病根土，三角瓶置于35℃、200rpm的恒温摇床中进行富集培养48h；
D、之后重复5％接种培养5次代后，取样在固体几丁质培养基A平板上反复划线分离出单菌株，挑起透明圈较大的菌株接种入上述液体几丁质无机培养基内驯化，再将上述操作重复多次，划线接入固体几丁质无机培养基培养,挑选产桔红色菌落之后纯化得到绿针假单胞菌菌株，命名为PCK02。
4.根据权利要求3所述的绿针假单胞菌PCK02的获取方法，其特征在于：
所述几丁质无机盐培养基的配方(g/L)为：几丁质10.0，K2HPO4 0.8，KH2PO40.4，NaNO33.0，MnS04·7H2O 0.45，ZnSO40.02，调节pH7.2-7.4。
5.根据权利要求1所述的绿针假单胞菌PCK02制备固体制剂，其特征在于：将绿针假单胞菌PCK02活化后接种于甘油酪素培养基，发酵培养48h获得菌液，将菌液与含有羟丙基环糊精、几丁质、凹凸棒、维生素C的混合物按1:5的质量比例混合，烘干水份至10％，既得含有10-1000亿/g绿针假单胞菌PCK02的固体制剂。
特别地上述甘油酪素培养基(g/L)的配方为：
甘油20，水解酪素4.5，K2HPO4·3H2O 5.8，(NH4)2SO4 2.4，FeSO4·7H2O0.20，ZnCl20.04，赖氨酸0.01，调节pH7.4。
6.根据权利要求1所述的绿针假单胞菌PCK02的应用，包括作为活性成分的绿针假单胞菌PCK02和载体用于猕猴桃、玉米、蔬菜等作物的根结线虫病害防治。
7.根据权利要求6所述的绿针假单胞菌PCK02的应用，其特征在于：所述活性成分的绿针假单胞菌PCK02和载体，稀释100-1000倍后，蘸根、拌种、喷洒使用，防治包含南方根结线虫、北方根结线虫或爪哇根结线虫引起的病害。
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