CN109423463A - 防治根结线虫病的假单胞菌菌株Jdn1及其菌剂 - Google Patents

防治根结线虫病的假单胞菌菌株Jdn1及其菌剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株防治根结线虫病的假单胞菌新种，该菌株为假单胞菌；保藏名称为假单胞菌Jdn1；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2017年06月09日；保藏编号：14226。所述假单胞菌单菌落淡黄色，近圆形，透明，边缘整齐，表面光滑；所述假单胞菌菌株革兰氏染色呈红色，为革兰氏阴性菌，假单胞菌菌株在需氧型试验结果为沿培养基表面生长，为好氧菌。本发明为防治根结线虫病效果好，且不污染环境的假单胞菌菌株及其菌剂。

Description

防治根结线虫病的假单胞菌菌株Jdn1及其菌剂
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种能防治根结线虫病的假单胞菌(Pseudomonas sp.)新种及其菌剂。
背景技术
自Berkeley于1855年在英国的一间温室中，发现发病番茄植株的根部具有根结。此后，由于交通运输的便捷、贸易的全球化、经济的快速发展，根结线虫病害的传播与危害跨越空间，遍布世界各地。由根结线虫引起的病害每年给世界造成的经济损失高达1000多亿美元。根结线虫属的种类很多，对农作物造成严重危害的主要有四种，即南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、爪哇根结线虫(Meloidogyne javcmica)和北方根结线虫(Meloidogyne hapla)。
根结线虫侵染植株，在寄主根部形成根瘤，植株表现出地上部分矮小、生长发育不良、产量及品质下降等特征。根结线虫是一种土传病原物，可以随流水、种子、苗木运输等方式传播，线虫繁殖量大且寄主广泛，难以根除。
目前根结线虫病主要是通过化学防治。虽然化学防治效果显著，但易导致根结线虫抗药性增加，此外化学防治的选择性差，破坏农作物的生态环境，不易降解，对人畜极不安全。这些因素使得化学防治的试剂使用范围受到的限制。因此，非化学防治措施目前已成为根结线虫治理的重点，而生物防治是其中最有前途的方法。利用根结线虫拮抗微生物对该病害进行防控是根结线虫病害综合防控的重要方面。
目前，缺乏不易使根结线虫产生抗性、不污染环境的防治根结线虫病的假单胞菌菌株及其菌剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了不易使根结线虫产生抗性、不污染环境的防治根结线虫病的假单胞菌菌株及其菌剂。
为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：防治根结线虫病的假单胞菌菌株，该菌株为假单胞菌(Pseudomonas sp.)；保藏名称为假单胞菌Jdn1；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2017年6月9日；保藏编号：14226。
进一步地，所述假单胞菌菌株的单菌落淡黄色，近圆形，透明，边缘整齐，表面光滑。
进一步地，所述假单胞菌菌株革兰氏染色呈红色，为阴性；假单胞菌菌株在需氧型试验结果为沿培养基表面生长，为好氧菌。
本发明所述的防治根结线虫病的假单胞菌菌剂。
进一步地，所述的防治根结线虫病的假单胞菌菌剂，其活性成分为如下(a)、(b)和(c)中的至少一种：
(a)权利要求1所述假单胞菌的发酵培养物；
(b)权利要求1所述假单胞菌；
(c)权利要求1所述假单胞菌的发酵上清。
本发明所述的防治根结线虫病的假单胞菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述假单胞菌菌株Jdn1为假单胞菌属，假单胞菌菌种在LB培养基中上生长，温度为28℃，在转速为150-180r/min下振荡进行培养，培养时间为16-20h，然后在超净工作台中分别取样测OD600值，测定过程中以未接菌的LB培养基来进行比对；
(2)当假单胞菌菌种培养至OD600值为0.5-0.8时，将假单胞菌菌种溶液与培养基按照1∶100的体积比加入LB培养基中，温度为28℃、转速为150-180r/min下振荡培养20-24h，
然后在转速为6000-8000r/min下进行离心分离9-11min，制得假单胞菌菌剂。
进一步地，在步骤(2)中，将假单胞菌菌剂的浓度稀释至1×108-1×1010CFU/ml。
进一步地，在步骤(1)中，所述LB培养基由胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母粉5g组成；pH为7.0，用蒸馏水将上述组分定容至1000ml，在温度为120℃下灭菌20min。
本发明所述假单胞菌菌剂在防治根结线虫病的应用。
有益效果：本发明不易使根结线虫产生抗性、不污染环境的防治根结线虫病的假单胞菌菌株及其菌剂。假单胞菌菌剂属于生物制剂，完全没有因化学药剂的使用所带来的化学抗药性等问题，因而有利于农作物的无公害生产。农民可以不用或减少其他防治根结线虫病的农药的用量，使农民节省开支。同时，该假单胞菌菌剂能够显著降低番茄根结数，根结数降低了26％；假单胞菌菌剂处理后显著降低了番茄单位根重的卵块数，卵块数减少了38％。
附图说明
图1为假单胞菌Jdn1菌株的系统发育树。
具体实施方式
下面将通过具体实施例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。
实施例1
菌株的生理生化试验以及16S rRNA分子的鉴定
如图1所示，假单胞菌菌株Jdn1在NA平板上在温度为28℃下进行活化培养，NA培养基：牛肉浸膏(Beef Extract)3g，蛋白胨(Peptone)10g，氯化钠(NaCl)5g，琼脂粉(Agar)15g，pH7.0。
培养时间为20-24h后观察发现，Jdn1的单菌落淡黄色，近圆形，透明，边缘整齐，表面光滑。菌株Jdn1革兰氏染色呈红色，为革兰氏阴性菌。菌株Jdn1在需氧型试验结果为沿培养基表面生长，表明菌株Jdn1为好氧菌。生理生化试验为氧化酶、接触酶、丙酸、乙酸、甲酸、L-乳酸、L-苹果酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、α-D-葡萄糖、D-甘露糖、蔗糖、甘油均呈阳性反应；明胶液化、D-苹果酸、α-丁酮酸、乙酰乙酸、纤维二糖呈阴性反应。
假单胞菌菌株Jdn1能生长的NA培养液中含有的氯化钠含量为1％、4％，含8％氯化钠的培养液中无法生长。在pH为5和6的液体NA培养基中均可以生长。菌株Jdn1的形态特征和生理生化特征与常见细菌系统鉴定手册中假单胞菌属细菌(Pseudomonas sp.)最为相似。
以Jdn1基因组总DNA为模板，PCR扩增16S rRNA得到长度约1.5Kb的扩增产物，这与16S rRNA在所有细菌中大多高度保守并且长度恒定为1.5Kb左右的报道吻合。将测序结果在NCBI网站GenBank数据库中Blast搜索，与已登录的16S rRNA序列进行核苷酸同源性比较，发现菌株Jdn1的16S rRNA序列与多株假单胞菌属细菌(Pseudomonas sp.)相似度较高，下载与假单胞菌菌株Jdn1的16S rRNA序列同源性较高的序列，选取15株相似度最高的构建系统进化树，发现菌株Jdn1与Pseudomonas sp.DSM_13194(LHVE01000021)处于同一分支上，同源性最高，结合培养特性及生理生化特征鉴定结果，将假单胞菌菌株Jdn1初步鉴定为假单胞菌属细菌(Pseudomonas sp.)。
本发明不易使根结线虫产生抗性、不污染环境的防治根结线虫病的假单胞菌菌株及其菌剂。假单胞菌菌剂属于生物制剂，完全没有因化学药剂的使用所带来的化学抗药性等问题，因而有利于农作物的无公害生产。农民可以不用或减少其他防治根结线虫病的农药的用量，使农民节省开支。同时，该假单胞菌菌剂能够显著降低番茄根结数，根结数降低了26％；假单胞菌菌剂处理后显著降低了番茄单位根重的卵块数，卵块数减少了38％。
实施例2
根结线虫二龄幼虫的制备方法步骤如下：
(1)将番茄根剪碎装入瓶中，加适量20％次氯酸钠溶液浸没，剧烈震荡3min。
(2)番茄根倒入筛孔密度由小到大依次罗列的标准筛上(30目、100目、300目、500目)，将卵粒冲至500目标准筛上并收集。
(3)收集的卵粒用10％次氯酸钠溶液消毒，用灭菌水清洗。
(4)将消毒后的线虫卵粒放入灭菌的装置中孵化，开始收集孵化的线虫备用。
本发明的防治根结线虫病的假单胞菌菌株，该菌株为假单胞菌(Pseudomonassp.)；保藏名称为假单胞菌Jdn1；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2017年06月09日；保藏编号：14226。
所述假单胞菌菌株的单菌落淡黄色，近圆形，透明，边缘整齐，表面光滑。所述假单胞菌菌株革兰氏染色呈红色，为阴性；假单胞菌菌株在需氧型试验结果为沿培养基表面生长，为好氧菌。
本发明所述防治根结线虫病的假单胞菌菌剂。其活性成分为如下(a)、(b)和(c)中的至少一种：
(a)权利要求1所述假单胞菌的发酵培养物；
(b)权利要求1所述假单胞菌；
(c)权利要求1所述假单胞菌的发酵上清。
本发明所述的防治根结线虫病的假单胞菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述假单胞菌菌株Jdn1为假单胞菌属，假单胞菌菌种在LB培养基中上生长，温度为28℃，在转速为150-180r/min下振荡进行培养，培养时间为16-20h，然后在超净工作台中分别取样测OD600值，测定过程中以未接菌的LB培养基来进行比对；所述LB培养基由胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母粉5g组成；pH为7.0，用蒸馏水将上述组分定容至1000ml，在温度为120℃下灭菌20min。
(2)当假单胞菌菌种培养至OD600值为0.5-0.8时，将假单胞菌菌种溶液与培养基按照1：100的体积比加入LB培养基中，温度为28℃、转速为150-180r/min下振荡培养20-24h，
然后在转速为6000-8000r/min下进行离心分离9-11min，制得假单胞菌菌剂。将假单胞菌菌剂的浓度稀释至1×108-1×1010CFU/ml。
本发明所述假单胞菌菌剂在防治根结线虫病的应用。
实施例3
盆栽防治效果测定
向3周苗龄的番茄幼苗根部灌OD600为1的假单胞菌菌剂，每株灌10ml。以根部位置灌入等体积灭菌水的幼苗为对照。1周后向番茄幼苗根部接种600头线虫。每处理8株幼苗，3次重复。25℃，16h：8h(光照：黑暗)培养2周后，统计根结数，计算防效。
防治效果(％)＝[(对照组根结数-处理组根结数)/对照组根结数]×100％
表1为假单胞菌Jdn1菌剂对根结线虫病的盆栽防治效果测定；
表1
如表1可以得出，在接种600头南方根结线虫2周后检测，盆栽实验结果表明经过假单胞菌Jdn1菌剂灌根处理后，可以显著降低番茄单位根重的根结数，防效达26％；表中不同的字母表示在0.05水平上差异显著。
实施例4
对南方根结线虫二龄幼虫早期侵染的影响
将OD600为1的Jdn1假单胞菌菌剂、灭菌水分别加入灭菌50ml离心管中，将番茄幼苗根部浸入其中，于摇床上150rpm，28℃振荡培养30min，在番茄根尖下2mm的位置接种20μl/200头线虫悬浮液，28℃避光培养12h后，每处理10株，3次重复，观察记录侵入的线虫头数。
表2对南方根结线虫二龄幼虫早期侵染的测定；
表2
处理 侵入的线虫头数
对照组 15±2
a
Jdn1 10±3
b
如表2可以得出，采用假单胞菌Jdn1菌体检测其对南方根结线虫二龄幼虫早期侵染的影响，进一步明确，Jdn1菌体对南方根结线虫寄生抑制作用是否发生在侵染初期。与灭菌水处理相比，细菌Jdn1能显著降低南方根结线虫二龄幼虫侵染番茄幼根的数量，减少了33％。表中不同的字母表示在0.05水平上差异显著。
实施例5
对根结线虫产生卵块数的测定
向3周苗龄的番茄幼苗根部灌OD600为1的假单胞菌菌剂，每株灌10ml。以根部位置灌入等体积灭菌水的幼苗为对照。1周后向番茄幼苗根部接种500头线虫。接种后6周，卵块染色后统计卵块数。每个处理8株苗，重复3次。
表3对根结线虫产生卵块数的测定；
表3
处理 单位根重卵块数
对照组 14±7
a
Jdn1 9±6
b
如表3可以得出，采用假单胞菌Jdn1菌体检测其对南方根结线虫产生卵块数的影响，结果显示：与灭菌水处理相比，假单胞菌Jdn1能够显著降低番茄根部卵块数，减少南方根结线虫的产卵块的数目，Jdn1菌液处理后单位根重的卵块数减少了38％。根据以上各实施例可以证明：以本发明所述的假单胞菌菌剂为有效成分的药剂是一种新型的农业杀菌剂。这种药剂特别是对根结线虫病显示出卓越的效果，而且对环境污染小，抗药性低的特点。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (9)

1.防治根结线虫的假单胞菌Jdn1菌株，其特征在于：该菌株为假单胞菌(Pseudomonassp.)；保藏名称为假单胞菌Jdn1；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2017年06月09日；保藏编号：14226。
2.根据权利要求1所述的防治根结线虫病的假单胞菌菌株，其特征在于：所述假单胞菌菌株的单菌落淡黄色，近圆形，透明，边缘整齐，表面光滑。
3.根据权利要求2所述的防治根结线虫病的假单胞菌菌株，其特征在于：所述假单胞菌菌株革兰氏染色呈红色，为革兰氏阴性菌；假单胞菌菌株在需氧型试验结果为沿培养基表面生长，为好氧菌。
4.根据权利要求1所述的制备防治根结线虫病的假单胞菌菌剂。
5.根据权利要求4所述的防治根结线虫病的假单胞菌菌剂，其活性成分为如下(a)、(b)和(c)中的至少一种：
(a)权利要求1所述假单胞菌的发酵培养物；
(b)权利要求1所述假单胞菌；
(c)权利要求1所述假单胞菌的发酵上清。
6.制备权利要求1或2所述防治根结线虫病的假单胞菌菌剂的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将所述假单胞菌菌株Jdn1为假单胞菌属，假单胞菌菌种在LB培养基中上生长，温度为28℃，在转速为150-180r/min下振荡进行培养，培养时间为16-20h，然后在超净工作台中分别取样测OD600值，测定过程中以未接菌的LB培养基来进行比对；
(2)当假单胞菌菌种培养至OD600值为0.5-0.8时，将假单胞菌菌种溶液与培养基按照1∶100的体积比加入LB培养基中，温度为28℃、转速为150-180r/min下振荡培养20-24h，然后在转速为6000-8000r/min下进行离心分离9-11min，制得假单胞菌菌剂。
7.根据权利要求6所述的假单胞菌菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，将假单胞菌菌剂的浓度稀释至1×108-1×1010CFU/ml。
8.根据权利要求4所述的假单胞菌菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述LB培养基由胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母粉5g组成；pH为7.0，用蒸馏水将上述组分定容至1000ml，在温度为120℃下灭菌20min。
9.权利要求4～5所述假单胞菌菌剂在防治根结线虫病的应用。
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