CN100404664C - 一株作物青枯病生防枯草芽孢杆菌菌株 - Google Patents

Abstract

本发明为“一株作物青枯病生防枯草芽孢杆菌菌株”，属生物技术领域。本发明涉及一株作物青枯病生防枯草芽孢杆菌菌株，其生物保藏号为：CGMCC1732。该菌株能够抑制青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的生长，生防实验表明能够防治烟草青枯病。同时本发明还提供了一种从该菌株中得到的拮抗蛋白混合物，在作物青枯病防治方面，具有很高的应用价值。

Description

一株作物青枯病生防枯草芽孢杆菌菌株

技术领域

本发明属于生物技术领域。进一步，本发明涉及一株作物青枯病生防枯草芽孢杆菌菌株。更进一步，本发明涉及应用枯草芽孢杆菌菌株SH7防治烟草青枯病。

背景技术

烟草细菌性青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种典型的维管束病害，最显著的症状是枯萎，且枯萎的速度很快，一旦发病即可造成全株死亡，是烟草上一大毁灭性病害。目前在我国长江流域及其以南烟区普遍发生；在多发病区旱地烟田的发病率为30％-50％，特别是旱地重茬连作烟田的发病率为50％以上；尤以华南烟区为害严重，个别年份暴发流行。近几年来，该病的发病和为害范围有向北方烟区扩展的趋势，在山东、河南、陕西及辽宁等省都有发生，局部地区为害较重。目前该病造成的损失已居各类病害的第四位，必须重视该病的防治工作。尤其近年以来由根结线虫造成的伤口引起的青枯病、黑胫病复合侵染的危害呈上升趋势，造成烟田严重减产。鉴于化学防治对环境的污染和生态平衡的破坏，因此烟草青枯病的生物防治越来越被重视。

烟草是我国重要的经济作物，中国烤烟的主要产区分布在云南、贵州、四川、湖北、湖南、陕西、河南、安徽、山东、辽宁、吉林、黑龙江等20多个省区的近900个县市。其中，云南省是我国烟草种植面积最大的省。中国烟叶的质量在不断提高，全国良种化面积达到90％以上，是世界上最大的烟草生产国。

在烟草生产上病害是严重影响产量和质量的重要因素。烟草细菌性青枯病又称“烟瘟”，是由Ralstonia solanacearum引起的一种维管束病害，主要侵染烟草根部和茎，也可侵染叶片；在苗床和大田均能发生，常造成烟株大片枯萎死亡，是一种毁灭性的土传病害。1864年印度尼西亚首先报道在烟草上引起毁灭性的损失；在美国，1880年首次发现此病，1910年大面积流行，随后美国一些农场被迫停止种烟。此病广泛分布于世界热带、亚热带及温带等湿热地区；我国烟草青枯病菌的地理分布长江以南发生居多，依发病高低可划分为4个区，多发病区包括广东、江西、福建、湖南、四川、浙江、安徽等省区；次发病区包括贵卅、湖北；偶发病区包括云南、河南、山东、陕西、辽宁；其余为无病区，各区的划分是相对的，区间存在过渡带；呈现出西向东、由北向南逐渐增加的趋势。

烟草细菌性青枯病菌的寄主范围很广，可侵染50多个科200余种植物，是番茄、马铃薯、烟草、花生、甘薯、茄子、生姜香蕉以及一些贵重药品和花卉等植物生产的重要限制因素。大多数禾本科植物及棉花、甘薯和麻类作物不受侵染。病菌主要在土壤和堆肥中越冬，也可以潜伏在种子、根际或生长着的寄主体内越冬；一般条件下，是从根部伤口侵入，不能从气孔侵入。青枯病的主要初次侵染来源是土壤、病残组织和肥料中的病菌，这些病原菌靠雨水、排灌水、病土、带菌苗、疫苗、人畜、生产工具及昆虫进行扩散远距离传播。

烟草青枯病在苗床和大田均能发生。主要侵染烟株根、茎，也可侵染叶片，染病叶片初期仍为绿色悬挂在茎上，故称“青枯病”；天气炎热时，病株的叶片呈不规则的灼伤，叶片变干，边缘脱落。病株的茎呈直立状，茎上垂着死亡的叶片。土壤湿度大时，根软腐发粘，致使全株枯死。

利用有益微生物防治植物病害，已成为一个十分活跃并开始显示良好应用前景的领域。许多论著报道(Cook，K.J.and Baker K.F.The nature and practice of biological controlof plant pathogens.1984，APS press USA)认为生物防治在未来农业中具有重要地位。大量的研究表明，生防细菌在其生长发育中产生多种拮抗性或竞争性的代谢产物，通过直接或间接作用，达到阻碍或杀死病原菌的效果。无论是自然发生的生物防治现象还是人们用于生物防治的生物类型中，细菌的作用是非常明显的。其主要优势在于：1)细菌的种类和数量众多，在植物根际和地上部大量存在；2)细菌对病原菌的作用方式较广，可以通过竞争、拮抗和诱导植物产生抗性等方式对病原菌产生影响；3)具有惊人的繁殖速度；4)许多细菌存在于植物根际和地上部，对植物的生态比较适宜；5)细菌大多可以人工培养，便于控制，在实践中易于操作；6)有些细菌不仅能防治病害而且可以增加作物产量(程亮等，拮抗细菌的研究进展[J].江西农业大学学报，2003，25(5)：732～736)。表现出或被认为有生防潜力的有益细菌种类众多(Dviad M.Biological Control of Soilbrone Plant Pathogens in the Rizhospherewith Bacteria.Ann.Rev.Phytopathol.1988，26：379～407)；包括了许多属的细菌，目前成功应用的植物病害生防细菌有Agrobacterium、Bacillus、Pseudomonas，Erwinia、Xanthomonas等属的一些菌株。

生防细菌防治植物病害发生发展的一个重要机制是产生拮抗物质，大致包括以下几类：细菌素(bacteriocins)、荧光素(fluorescein)、土壤杆菌素(agrocin)、酚类物质、多肽类抗生素(polypeptides)、蛋白质类抗真菌素及挥发性抑制物质等，在植物病害生物防治中起着关键的作用。由生防细菌产生的拮抗物质种类多，作用范围广谱，同一种拮抗物质可以由多种细菌菌株产生，而同一种细菌菌株也可以产生多种不同结构的拮抗物质。

了解拮抗菌的抑菌机理是增强拮抗菌生防效力和确定拮抗菌筛选标准的重要前提，拮抗菌主要有3种作用机制：即拮抗作用、竞争作用(包括营养、物理位点、生态位点及氧气等的竞争)、诱导抗性和超寄生，生防细菌的作用机制主要为前三者。由于寄主-致病菌-拮抗菌三者的交互作用，每一种拮抗菌拮抗效果的产生往往是多重机理共同作用的结果。也有研究报道，有的拮抗菌株以一种机制为主，有的同时依赖多种机制。

因此本试验将从生物防治方面进行探索，筛选防效促生效果好的拮抗细菌菌株，并对其抑菌机理进行研究，为将来通过常规和分子生物学途径，利用这些拮抗细菌及其抗菌物质防治烟草青枯病提供研究基础和实验材料。

在植物的根围、叶围及其它微生态区系中，拮抗细菌广泛存在，且由于培养方便、生长周期短、作为新拮抗菌来源具有很大的开发潜力。烟草青枯病是烟草生产中最严重的病害之一，每年都造成烟叶产量的严重损失和品质下降，是烟草生产中一个很重要的制约因素。如何有效地防治和减轻烟草青枯病的危害一直是许多科研工作者的目标。至今人们没有找到理想的防治药剂，选育抗病品种很难，且抗性容易丧失。因此不断寻找新的烟草青枯病防治方法是一项长期的任务。

国内对烟草青枯病生物防治已有报道，但多数仅限于对生防菌的筛选和盆栽试验阶段，而对其产生抗菌物质的提取、生理生化特性和生防菌的防病机制等诸多方面国内尚未深入研究，

发明内容

针对上述领域的缺陷，本发明提供一株作物青枯病生防枯草芽孢杆菌菌株，用于作物青枯病的生物防治，为青枯病的防治提供了新的微生物资源。

一株作物青枯病生防枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株SH7，其生物保藏号为：CGMCC1732。

所述的菌株SH7在防治作物青枯病中的应用。

所述作物为烟草。

所述的菌株SH7在抑制青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)中的应用。

所述菌株分泌的抗菌蛋白物质混合物，其特征在于：从菌株SH7发酵液中提取，并含有一在碱性条件下稳定的35kDa的蛋白。

所述抗菌蛋白混合物在防治作物青枯病中的应用。

本发明针对烟草青枯病菌(Ralstonia solanacearum以下简称R.S)，通过室内抑菌圈法和活体温室防效测定，筛选出在温室条件下对R.S具有良好防病作用的拮抗菌株SH7，测定其16s rDNA全序列如附录中SEQ ID NO1，应用其中的BLAST软件和DNAMAN软件进行分析，SH7菌株的序列与枯草芽孢杆菌16s rDNA部分序列相同，同源性100％)(如图7)，因此鉴定SH7菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌株的培养条件为30℃，普通牛肉汁培养基，pH7.0。该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)、枯草芽孢杆菌种，并已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2006年6月7日，保藏编号为：CGMCC1732。经鉴定，关于该菌株的信息包括：能形成芽孢；分泌的蛋白混合物对热稳定(见附图10)，对蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感(见附图14、15)，对氯仿部分敏感(见附图16)；SDS-PAGE电泳表明其作用蛋白之一约为35kDa(见附图18)；生物学测定表明，在牛肉汁平板上能够抑制青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的生长(见附图1)，盆栽防治实验表明防效为65.99％(见表3)。

本发明通过室内平板扩散抑菌法，获得了平板拮抗能力强的SH7菌株(抑菌带宽12.2mm)，SH7除菌发酵液对烟草青枯病的防治效果(温室盆栽)表明，经单独除菌发酵液处理和除菌发酵液与青枯病菌作用30min后处理与NB培养基对照相比，两种处理方式均能推迟烟草青枯病的发病时间；在接种后第29d时，与NB培养液对照相比，防效达到65.99％和53.2％，说明SH7菌株分泌的抗菌物质是其防病作用的主要机制。接种SH7除菌发酵液后的烟苗叶色浓绿且肥厚，长势好。

SH7菌株分泌的拮抗物质可用70％饱和度硫酸铵提取。粗提的拮抗物质对热稳定，经100℃和121℃高压处理20min后样品的抑菌率分别为90％和70％(假设未处理样品的抑菌率为100％)；它对蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶不敏感，对氯仿部分敏感。作用活性在pH7.0-9.0最好。经紫外扫描和SDS-PAGE电泳，拮抗物质在274.00nm处有典型的蛋白吸收峰，SH7分泌多种的蛋白质，组分之一的分子量大小为35KD左右。

本发明获得的拮抗青枯病菌的生防枯草芽孢杆菌菌株SH7可应用于对作物青枯病的防治，生物学测定表明，在牛肉汁平板上能够抑制青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的生长(见附图1)，盆栽防治实验表明防效为65.99％(见表3)。具有实际的应用价值。

本发明通过菌株SH7的发酵液提取得到了拮抗蛋白，并证实SH7产生的主要抑菌性物质为该拮抗蛋白。该拮抗蛋白热稳定性好，对蛋白酶不敏感，是优质的生物农药。

菌种保藏信息：

菌种名称：芽孢杆菌属、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏日期：2006年6月7日

保藏编号：CGMCC 1732

附图说明

图1为SH7菌株对烟草青枯病菌的抑菌活性。

图2为SH7菌株发酵液上清对烟草青枯病菌抑菌活性。

图3为除菌发酵液处理烟苗14d的防效。

其中，1为SH7除菌发酵液处理烟苗；CK为对照。

图4为除菌发酵液与青枯病菌作用30min后处理烟苗14d的防效。

其中，2为除菌发酵液与青枯病菌作用30min后处理烟苗；CK为对照。

图5为除菌发酵液处理烟苗20d的防效。

其中，1为SH7除菌发酵液处理烟苗；CK为对照。

图6为除菌发酵液与青枯病菌作用30min后处理烟苗20d的防效。

其中，2为除菌发酵液与青枯病菌作用30min后处理烟苗；CK为对照。

图7为SH7PCR产物序列在Genbank数据库中搜索比对的结果。

图8为70％(NH4)2SO4饱和度沉淀对青枯菌菌株抑菌活性。

其中，左侧为pH值7.6的PBS缓冲液处理；右侧为透析后粗提液。

图9为去除70％(NH4)2SO4饱和度所得沉淀的上清抑菌活性。

图10为不同温度处理后的SH7粗提蛋白液对烟草青枯病菌的抑菌活性。

其中，1为未处理样品；2为100℃处理20min；3为121℃处理20min；4为PBS缓冲液(pH7.6)。

图11为不同pH值处理后SH7粗提蛋白对烟草青枯病的抑菌活性。

图12为酸性条件和碱性条件下SH7粗提蛋白活性的稳定性。

其中，1为原样品；2为pH5.0沉淀；3为pH5.0上清；4为pH3.0沉淀；5为pH3.0上清

图13为酸性条件和碱性条件下SH7粗提蛋白活性的稳定性。

其中，1为原样品(pH7.0)；2为pH9.0处理；3为pH8.0处理；4为pH10.0处理；5为pH11.0处理。

图14为蛋白酶K处理后抑菌蛋白的稳定性。

其中，左侧为蛋白酶K处理；右侧为原样品。

图15为胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后的稳定性。

其中，1为未处理样品；2为胃蛋白酶处理；3为胰蛋白酶处理。

图16为经氯仿处理后蛋白粗提液对烟草青枯病菌的抑菌活性

其中，1为氯仿处理；2为未处理样品；3为水相部分；4为PBS缓冲液。

图17为不同有机溶剂萃取粗提蛋白液后对烟草青枯病菌的抑菌活性。

其中，1为乙醚萃取SH7粗提蛋白的有机相；2为乙醚萃取SH7粗提蛋白的水相；3为二甲苯萃取SH7粗提蛋白的有机相；4为二甲苯萃取SH7粗提蛋白的水相；5为乙酸乙酯萃取SH7粗提蛋白的有机相；6为乙酸乙酯萃取SH7粗提蛋白的水相；7为未处理粗提蛋白。

图18为SH7粗提拮抗蛋白SDS-PAGE电泳图。

其中，1为氯仿处理的粗提蛋白；2为未处理粗提蛋白；3为Marker。

图19为粗提蛋白的吸光值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1、

1、1防治烟草青枯病拮抗细菌SH7的筛选、温室盆栽控病实验及促生作用

在灭菌培养皿中均匀加入100μl浓度为1×107cfu/ml青枯菌(Ralstonia solanacearum)菌悬液，倒入冷却到50℃左右的熔化NA培养基20ml充分混匀。待培养基完全凝固后，用接种环点接种供试的拮抗菌，每皿点8-10个待测细菌菌株，30℃温箱中培养48小时后，检测抑菌圈的有无及大小。经初次测试有拮抗作用的菌株划线纯化后进行重复测试，基本方法同上，每平板点接3个菌株，各三次重复。从平板抑菌效果看，SH7菌株的室内平板抑菌效果好，抑菌带宽度达12.2mm，拮抗作用显著，生防细菌在生长代谢过程中产生了具有抑菌活性的抗生物质。(见表1和图1)

表1  不同菌株对烟草青枯病的抑制作用

注：抑菌带宽为拮抗菌生长边缘到致病菌的边缘，各数据为室内平板扩散初测和复测的平均值。

SH7菌株发酵液的抑菌活性测定是将活化的SH7菌株接种于NB培养基中，30℃恒温，150rpm振荡培养48小时，4℃离心10min去菌体，用孔径为0.22μm微孔滤膜过滤除菌，取100μl在平板上检测其抑菌活性。(如图2)

从图2可知，SH7菌株发酵液对烟草青枯病菌的平板抑菌活性很强，抑菌圈透明而清晰。

用平板测定获得的拮抗细菌进行盆栽测试。每次试验设空白对照CK1(仅接清水)和发病对照CK2(仅接青枯病菌)每处理，设三次重复，每重复5株苗。具体实验过程如下：

(1)幼苗浸根：取5-6片真叶烟苗于盆钵中拔出，浸根于预先配制好的供试生防菌菌悬液(浓度为1×108cfu/ml)中，30-40min后取出并移栽于装有灭菌土的花盆中。对照浸根于清水中。其它按照温室常规管理。

(2)再次灌菌：缓苗后，每隔5d于根际接种拮抗菌菌悬液，具体方法如下：

利用枪头在烟株根际土壤呈正方形钻穴，(深约5cm)，每株共4个。将菌悬液注入穴中，1ml/穴，另取1ml淋于茎基部，充分保护烟株根际。如上述方法重复接种两次。对照接入等量清水。

(3)：接种发病：1d后，将提前大量繁殖的青枯菌配制成5×107cfu/ml的菌悬液，接种方法同上，接种部位相同，接种量为5ml/株；CK1接等量清水。完成后，将烟株用适量清水保湿，以利发病。

(4)：观察记录：见病株后，每日观察记录发病株数。植株可见明显青枯病症状，即为发病株。以接种病原菌日为起点日，共观察25-30d。(见表2)

防效计算公式：

病情分级：0级为无症状；1级为1-2片叶萎蔫；2级为1/3-1/2叶片萎蔫或茎杆基部变黑；3级为2/3-3/4叶片萎蔫、坏死且茎杆变黑坏死；4级为整株死亡。

表2  SH7盆栽测试结果(20d)

注：病情指数为三次重复的平均值。

经盆栽防效检测，SH7进行测定，结果较对照CK2发病严重，

SH7除菌发酵液对烟草青枯病的防效测定：选用于无菌土种植的烟苗，除对照外设二个处理，处理一用经热处理杀死菌体后的SH7发酵液灌根，50ml/株，隔3d处理一次，连续2次后，接种青枯病菌R.S；处理二用热处理杀死菌体后的SH7发酵液与Ralstonia solanacearum菌悬液(浓度为105cfu/ml)作用30min后的混合液灌根(不再接种R.S)；50ml/株，隔3d处理一次，连续2次。对照用NB培养基灌根，处理方式同前。处理一和对照接种Ralstoniasolanacearum(R.S)，菌悬液浓度调整为106cfu/ml，50ml/株。每处理8株烟苗，3次重复，28℃-32℃保湿培养，见病株后，每日观察记录发病株数。植株可见明显青枯病症状，即为发病株。以接种病原菌日为起点日，共观察20-29d。防效计算公式和病情分级同上。(见表3和图3、4、5、6)。

表3  SH7菌株除菌发酵液对烟草青枯病的防效测定结果

*同栏的相同字母表示新复极差检测差异不显著(P＝0.05)。

从上述表3及图中可以看出，经单独除菌发酵液处理和除菌发酵液与青枯病菌作用30min后处理与NB培养基对照相比，前两个处理方式均能推迟烟草青枯病的发病时间，分别推迟9d和7d，在接种后第17d，两个处理的防效分别是84.6％和82.2％，至第29d时，与NB培养液对照相比，防效达到65.99％和53.2％。同时，预先用SH7除菌发酵液保护烟株根部比除菌发酵液与青枯病菌作用30min后处理的防效好。因此，本发明针对烟草青枯病菌(Ralstoniasolanacearum以下简称R.S)，通过室内抑菌圈法和活体温室防效测定，筛选出在温室条件下对R.S具有良好防病作用的拮抗菌株SH7。

SH7的促生作用，将大田壤土∶农家肥∶蛭石按照7∶2∶1比例配制基质，灭菌后填装于育苗钵中。小心挖出5-6片真叶的烟苗，小心抖落附着于根部的土壤，并将其浸泡于预选配制好的SH7生防菌菌悬液(浓度约为108cfu/ml)中，30-40min后取出，分别移栽于装有灭菌土的苗钵中。每处理20株，三次重复，随机排列，温室保湿培养。待烟苗长至30d后，随机选取10株烟苗，小心将苗整株挖出，洗去根部泥土，测量其株高、整株鲜重、根鲜重及干重和叶色等指标。然后180℃烘干至恒重，测整株干重。(见表4)

表4  SH7菌株对灭菌土中烟草的促生作用测定结果

实验结果表明，接种生防菌于灭菌土种植的烟草时，SH7菌株能促进烟草生长，整株鲜、干重，根鲜、干重，根长和株高显著高于清水对照，增长率为26.9％、35.5％、49.3％、132.3％、37.3％和53.7％，促生作用佳。同时，也说明SH7对烟草是安全的。

1、2  SH7的分类地位分子鉴定

参照文献(林万明主编细菌分子遗传学分类鉴定方法[M].上海，上海科学技术出版社1990)方法提取总体DNA，PCR扩增参照(C.W.迪芬巴赫，G.S.德维克斯勒著，黄培堂等译.PCR实验技术实验指南[M]，北京科学技术出版社，2000)方法进行。以SH7菌体基因组DNA为模板，经PCR反应扩增，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条1.0kb以上的特异性片段，测定该片段序列(PCR产物由北京华大中生生物科技有限公司测序)，结果表明，测得SH7菌株为1409bp。将测得的16s rDNA全序列(见附录SEQ ID NO1)提交Genbank(www.ncbi.nlm.nlh.gov)，应用其中的BLAST软件和DNAMAN软件进行分析，发现，SH7菌株测得的序列与枯草芽孢杆菌16srDNA部分序列相同(图7)。因此鉴定SH7菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

实施例2  SH7拮抗蛋白及其特性

粗提蛋白的提取及其活性检测：将活化的SH7菌株接种于NB培养基中，30℃恒温，150rpm振荡培养48小时，4℃离心10min，去菌体，制成胞外代谢物的发酵上清液。在发酵液中慢慢加入一定量的(NH4)2SO4达到70％的饱和度，搅拌均匀，置4℃条件静止过夜。

将盐析液于低温条件离心20min(12000r/min)，倒去上清液，沉淀物质用1/15体积的PBS缓冲液(pH7.6)悬浮，将上述悬浮液装入已预处理透析袋(截流分子量为5kD)，透析袋的两头用透析夹夹好，置于100倍体积PBS缓冲液(pH7.6)中，于磁力搅拌器上4℃透析24小时，更换透析液后再透析24小时。经透析处理后粗提物质冷冻抽干后溶解于PBS缓冲液中，用孔径为0.22μm微孔滤膜过滤除菌，在平板上检测其抑菌活性。(如图8、图9)

从图中可以看出，SH7菌株在NB培养液中振荡培养48h后，经70％(NH4)2SO4饱和度沉淀并透析后得到的粗蛋白液经平板抑菌活性检测，有很强的抑菌活性(如图8)，而去除70％(NH4)2SO4饱和度所得沉淀的上清抑菌活性很微弱(如图9)；其中一定浓度的盐也有杀菌作用。因此可以初步认定SH7产生的主要抑菌活性物质是蛋白类物质。

拮抗物质热稳定性：将得到的SH7粗提拮抗物于40℃、60℃、80℃、100℃及121℃(高压湿热灭菌)各处理20min，取100μl检测其以青枯病菌为指示菌的抑菌活性，以来经任何处理的无菌体滤液和PBS缓冲液为对照；观察拮抗物质对温度的敏感程度。(见表5及图10)

表5  不同温度处理后的SH7粗提蛋白液对烟草青枯病菌的抑菌活性

按照70％硫酸铵饱和度沉淀法获得的粗提蛋白液分别在设定的不同温度下处理20min后，粗提液经40℃、60℃、80℃处理后活性保持不变；而将温度提高为100℃和121℃高压处理20min后，仍保持大部分对烟草青枯病菌的抑菌活性(如图10)，与未处理样品相比，抑菌圈直径分别减少了3mm和9mm。假设未处理样品的抑菌率为100％，则经100℃和121℃高压处理20min后样品的抑菌率分别为90％和70％。由此可推断此粗提蛋白为耐热蛋白，见表5。

拮抗物质pH值稳定性：取适量粗提拮抗物质，并分别将其调成3、5、9、11、13不同的pH值，静置10min后，再将体系调回pH7.0的条件，各取100μl测试其对烟草青枯病菌的抑菌活性。如图11、12、13)

结果表明，pH值为7.0-9.0时该抗菌蛋白的抑菌活性最强，抑菌圈直径为20mm，pH值为10.0和11.0时的抑菌圈直径为18mm，且在碱性条件下的抑菌活性比酸性条件下的活性强；在酸性条件下该拮抗蛋白会产生沉淀，在pH值为3.0左右时全部沉淀，离心后的上清无抑菌活性。由此可得出，拮抗蛋白在中性或偏碱性条件下都稳定。

拮抗物质对蛋白酶的稳定性：取适量粗提物质分别用蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶在最适酶促条件下反应40min(酶反应的终浓度为1mg/ml)，以不用酶处理为对照，取100μl测其对青枯病菌的抑菌活性。经不同蛋白酶处理后的粗提蛋白对烟草青枯病菌的抑菌活性与对照未处理样品活性一致(如图14、15)，结果说明该抗菌蛋白对蛋白酶不敏感。

拮抗物质对氯仿的稳定性：按照1∶1比例取粗提液与氯仿等量混合，反复颠倒几次，静置10-15min后离心，待残留氯仿挥发后，分别取100μl有机相部分和水相部分做活性检测，对照为等量氯仿和原样品。结果表明，经氯仿处理过的粗提液对烟草青枯病菌的抑菌活性弱于未处理粗提液(如图16)，水相部分无活性；说明氯仿能萃取出此蛋白粗提液中的抑菌物质，且对抑菌物质有一定影响。

拮抗物质不同有机溶剂萃取：取适量无菌粗提液并在其中加入等体积的有机溶剂(二甲苯、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、异丙醇和甲醇，极性依次增强)进行萃取，萃取液分层后，将有机相与水相分开，并将在室温条件下任有机溶剂挥发后的残液和水相过滤(过滤器孔径为0.22μm)除菌，各取100μl测定其抑菌活性，设原样品和有机溶剂为对照。(见表6、图17)

结果表明，SH7拮抗蛋白粗提液溶于强极性有机溶剂丙酮、异丙醇和甲醇中；应用相对弱极性有机溶剂二甲苯、乙醚和乙酸乙酯从粗提液中萃取到的物质对烟草青枯病菌有不同程度的抑菌活性，水相部分保留微弱的抑菌活性。该结果表明，由SH7产生的抑菌物质极性小的抑菌物质成分可以被弱极性有机溶剂萃取出来。对照各萃取溶剂均无抑菌活性。

表6  SH7粗提蛋白液中不同萃取物的抑菌活性

粗提抑菌物质SDS-PAGE电泳：电泳参照汪家政等的方法进行(汪家政范明主编，蛋白质技术手册.2000.科学出版社.ISBN7-03-008329-6)，采用12％分离胶，5％浓缩胶。考马司亮蓝R-250染色。70％硫酸铵盐析的SH7粗提蛋白液和经氯仿处理后的粗提蛋白12％SDS-PAGE电泳结果(如图18)表明，SH7分泌的粗提蛋白有多条电泳带，而经氯仿处理后的粗提蛋白与未处理蛋白样品相比，在35KD处的电泳带消失，说明此处的蛋白是SH7分泌抑菌蛋白的组分之一。

粗提蛋白吸光值测定：将粗提蛋白液稀释为适当的浓度即可比色，做样品的同时，做空白，比色时以空白调零。在日立UV-3010紫外分光光度计上，以全波段扫描并记录其吸收度。粗提蛋白在波长为220-340nm的吸光值测定结果显示(如图19)：SH7分泌的抗菌物质在274.00nm处有明显蛋白吸收峰，为典型的蛋白质吸收光谱。

总之，本发明获得的枯草芽孢杆菌菌株SH7的拮抗物质具有下列特性(1)拮抗细菌SH7菌株产生的拮抗物质可以被硫酸铵沉淀，不能通过5kD(截流分子量大于5kD)的透析袋，对蛋白酶类不敏感，氯仿处理后抑菌活性减弱，可以认为是蛋白类抗菌物质。(2)有机溶剂萃取结果表明，SH7菌株分泌抑菌物质能被弱极性有机溶剂萃取而不能被强极性有机溶剂萃取。(3)拮抗细菌SH7菌株产生的抑菌物质在碱性条件下稳定，在酸性条件下抑菌物质沉淀析出；当pH值为3.0时，抑菌物质全部沉淀，离心后上清无抑菌活性。(4)通过紫外吸收和SDS-PAGE电泳检测试验结果表明，进一步证明SH7分泌的拮抗物质为蛋白或多肽类物质，且是多组分的复合物，在35KD处有一抑菌蛋白组分。

附：本发明所涉及的核苷酸序列

SEQ ID NO1(SH7菌株16SrDNA全序列)：

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Claims (2)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株SH7分泌的抗菌蛋白质混合物，由下述方法制得：

(1)将SH7菌株在NB培养液中30℃恒温，150rpm振荡培养48h，4℃离心10min，去菌体，制成胞外代谢物的发酵上清液，

(2)在第(1)所得的发酵上清液中慢慢加入一定量的(NH₄)₂SO₄达到70％饱和度，搅拌均匀，置4℃条件静止过夜，然后于低温条件，12000rpm离心20min，倒去上清液，用1/15体积的pH7.6的PBS缓冲液悬浮沉淀物质，

(3)将第(2)步所得悬浮液装入已经预处理的截流分子量为5kD的透析袋，透析袋的两头用透析夹夹好，置于100倍体积pH7.6的PBS缓冲液中，于磁力搅拌器上4℃透析24h，更换透析液后再透析24小时，

(4)将第(3)步所得的透析袋内物质进行冷冻抽干，溶解于PBS缓冲液中，用孔径为0.22μm滤膜过滤除菌，

所述抗菌蛋白质混合物在pH7.0-9.0条件下稳定，并含有一35kDa的抑菌蛋白，所述菌株SH7的生物保藏号为CGMCC1732。

2.权利要求1所述菌株SH7分泌的抗菌蛋白质混合物在防治作物青枯病中的应用。

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