CN113817628B - 一种芒果蒂腐病菌杀菌剂及其应用 - Google Patents

一种芒果蒂腐病菌杀菌剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种芒果蒂腐病菌杀菌剂及其应用，将耐硼赖氨酸芽孢杆菌或其发酵液制备成芒果蒂腐病菌杀菌剂，不仅可以很大程度上降低芒果蒂腐病的发生和危害，而且对生态环境没有任何威胁，耐硼赖氨酸芽孢杆菌有望作为合成生物学研究的优质底盘微生物，为芒果蒂腐病的防治带来新的方向。

Description

一种芒果蒂腐病菌杀菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及农业微生物应用领域，特别地涉及一种芒果蒂腐病菌杀菌剂。
背景技术
芒果为著名热带水果之一，芒果果实含有糖、蛋白质、粗纤维，芒果所含有的维生素A的前体胡萝卜素成分特别高，是所有水果中少见的。其次维生素C含量也不低。矿物质、蛋白质、脂肪、糖类等，也是其主要营养成分。可制果汁、果酱、罐头、腌渍、酸辣泡菜及芒果奶粉、蜜饯等。食用芒果具有清肠胃的功效，对于晕车、晕船有一定的止吐作用。芒果叶和树皮可作黄色染料。木材坚硬，耐海水，宜作舟车或家具等。芒果树冠球形，常绿乔木，郁闭度大，为热带良好的庭园和行道树种。
芒果蒂腐病主要为害芒果果实，发病部位最初在果蒂周围，先出现褐色斑点，继而迅速扩展至整个果蒂的果皮变褐、腐烂、渗出黏液，是芒果生长的重要病害，给农业生产造成了严重的经济损失。蒂腐病的病原有多种真菌。病原菌从幼果期侵入后便潜伏在果实的深层组织或核组织内，到芒果采收后，在贮藏、运输期间发病，对贮藏及运输影响甚大，造成烂果，带来严重的经济损失。发病的最适温度为25～30摄氏度。
常见的芒果蒂腐病防治措施包括：田间管理和采后处理。其中，田间管理防治需要配合杀菌剂进行而且成本较高，采后处理需要使用防腐剂，对果实的安全性存在威胁。目前，防治芒果蒂腐病的杀菌剂大多为化学杀菌剂，长期、大量的使用，会使病原菌产生抗药性，造成果实和环境污染，给环境和食品也带来了巨大的威胁，还会影响人体安全。
因此，近年来世界各国都在努力开发可替代传统化学药剂控制植物病害的新方法。其中利用微生物及其代谢产物进行生物防治，被公认为是一种环境友好型的选择。记载在2020年第3期《浙江农业学报》上，由郭雪松等人撰写的《芒果蒂腐病拮抗放线菌A10和A17的分离、鉴定和特征化研究》，公开了放线菌A10和A17对芒果蒂腐病病菌具有拮抗作用，但目前对于芒果蒂腐病病菌生防菌的研究较少。
发明内容
针对上述问题，本发明提出了一种芒果蒂腐病菌(Botryodiplodia theobromae)杀菌剂。
如上所述的杀菌剂，包括：耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)或其发酵液，其中，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌于2019年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO.M2019773。
如上所述的杀菌剂，还包括辅料。
如上所述的杀菌剂，所述辅料为水、液体培养基、固体培养基、甘油中的一种或者多种。
如上所述的杀菌剂，所述甘油的用量可根据芒果蒂腐病菌杀菌剂的贮藏条件进行调节，甘油在芒果蒂腐病菌杀菌剂中的体积百分比可以为10％、25％、50％、75％等。
如上所述的杀菌剂，所述芒果蒂腐病菌杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：培养耐硼赖氨酸芽孢杆菌并用辅料调配至所需浓度后，制备成芒果蒂腐病菌杀菌剂。
如上所述的杀菌剂，所述发酵液为将所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌按2.5-4％v/v的接种量，接种到发酵培养基中，在37-45℃，振荡120-150r/min的条件下，发酵培养24-96h，待OD600为4.8-2.5时，停止发酵，得发酵液。
如上所述的杀菌剂，所述发酵液为将所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌按3.0％v/v的接种量，接种到发酵培养基中，在37℃，以150r/min转速发酵培养24-96h，待OD600为2.5时，停止发酵所得。
如上所述的杀菌剂，所述发酵培养基，包括以下成分：25-35g/L葡萄糖，10-15g/L蛋白胨，2.2-3.2g/L延胡索酸，0.05-0.1mg/L水苏碱，5-7g/L黄芩苷，1-3g/L(NH4)2SO4，1.5-2.6g/L CaCO3，0.2-0.5g/L MgSO4·7H2O，pH6.5-6.8。
如上所述的杀菌剂，所述芒果蒂腐病菌杀菌剂在抑制芒果蒂腐病菌生长方面的应用。
如上所述的杀菌剂，所述抑制芒果蒂腐病菌生长方面的应用为预防或治疗芒果蒂腐病。
如上所述的杀菌剂，所述应用的方法为将芒果蒂腐病菌杀菌剂与介质混合。
如上所述的杀菌剂，所述介质为携带芒果蒂腐病菌的载体。
如上所述的杀菌剂，所述载体为种子、植物、植物生长的土壤、水环境和/或培养植物的培养基。
如上所述杀菌剂，可将耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞，改进为可以大量生产某一种或者多种具有特定抑菌活性的蛋白或者其他物质的改造模块，进而增强其抑制芒果蒂腐病菌生长的功能，提高其制备的芒果蒂腐病菌杀菌剂抑制芒果蒂腐病菌生长的效率。
如上所述的杀菌剂，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌还可与其他具有生物防治功能的细菌、真菌混合，制成对芒果蒂腐病菌等多种致病菌具有良好抑制作用的制剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供一种芒果蒂腐病菌杀菌剂及其应用，将耐硼赖氨酸芽孢杆菌或其发酵液制备成芒果蒂腐病菌杀菌剂，不仅可以很大程度上降低芒果蒂腐病的发生和危害，而且对生态环境没有任何威胁，耐硼赖氨酸芽孢杆菌有望作为合成生物学研究的优质底盘微生物，为芒果蒂腐病的防治带来新的方向。
采用本发明配制发酵培养基，能够增强耐硼赖氨酸芽孢杆菌抑制芒果蒂腐病菌生长的功能，提高其发酵液抑制芒果蒂腐病菌生长的作用。
附图说明
图1为本申请实施例1中耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵96h后的耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液对芒果蒂腐病菌的生长抑制作用；其中，图1A是实验组，在其培养基中混入了耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵96h后获得的无菌发酵液，图1B是对照组，未在其培养基中混入耐硼赖氨酸芽孢杆菌的无菌发酵液，培养基中间圆点为滴入的靶标病原菌。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在以下的详细描述中，可以参看作为本申请一部分用来说明本申请的特定实施例的各个说明书附图。本申请的各个特定实施例在以下进行了足够详细的描述，使得具备本领域相关知识和技术的普通技术人员能够实施本申请的技术方案。应当理解，还可以利用其它实施例或者对本申请的实施例进行结构、逻辑的改变。
本领域技术人员应当理解，当陈述细菌经发酵、培养至一定浓度时，所说的浓度为一定数值范围内的浓度，例如当以OD值表示浓度时，申请中若出现OD600为4.8，则实际OD值约为4.8，如OD600值为4.8±0.6。将细菌发酵、培养至一定程度所需时间均为不能精确至分、秒的确定的时间，且所需时间与细菌发酵、培养的环境温度、培养基种类等均有关系，所以本申请中出现的与细菌发酵、培养、生长等相关的时间，均为大约的时间，而不是确定的时间。
本申请中出现的一些名词具有如下释义：
本申请所说的发酵液包括菌经发酵后产生的具有发酵产物的液体。
本申请所说的含毒介质法又叫生长速率法，是杀菌剂毒力测定的常规方法之一，适用于不长孢子而菌丝生长较快的真菌。通过菌落生长的速度快慢可以衡量药剂的毒力大小。含毒介质法是将供试药剂与培养基混合，以培养基上菌落的生长速度来衡量药剂的毒力大小。一般多用于那些不产孢子或孢子量少而菌丝较密的真菌。菌落生长速率一般通过菌落达到一个给定的大小所需要的时间(天或小时)，或者在单位时间内菌落直径的大小表示。
本申请所说的打孔法，是指用已灭菌的打孔器或钢管等在试验平板上打孔，然后往孔中注入一定量的待检测样品，培养一段时间后测定其抑菌圈大小的一种方法。
本文所说的萃取法是指利用化合物在两种互不相溶(或微溶)的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中。经过反复多次萃取，将绝大部分的化合物提取出来的方法。乙酸乙酯属于中极性溶剂，可以从细菌的发酵滤液中萃取多种物质，例如具有较小极性的分子(如葡萄糖或带糖的苷类)、特小极性的分子(如某些石蜡)、含有盐结构的分子(如氨基酸)等。
本申请所述的OD值是optical density(光密度)的缩写，表示被检测物吸收的光密度。测量细菌培养液在600nm处的吸光值(用OD600表示)，可以测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况，所以600nm处的光密度值可以用于表示菌体细胞密度，其中，吸光值正比于培养液中的细菌的浓度。
本申请所说的生防细菌或者生防菌，是指具有生物防治功能的一种或者多种细菌，是指利用有益微生物杀灭或压低病原生物数量以控制植物病害发生、发展的一类措施，又称“以菌治菌”。生物防治是病虫害综合治理体系的重要一环。它具有不污染环境、对人畜无毒、对植物无副作用等优点，对土传病害的控制尤其适用。
本申请所述PDA培养基，是指马铃薯葡萄糖培养基，其中P、D、A即为Pota toDextrose Agar(Medium)的缩写。PDA培养基是一种常用的酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌培养基，是一种半合成培养基。
在生态环境中，一种微生物控制其他微生物生长的作用机制有很多种，不同的生防菌，以及同种生防菌在不同与不同植物作用时，可能有不同的生防机制。以木霉菌为例，生防菌的生防机制大体可分为竞争作用，如木霉菌对环境的适应性强，生长速度远比病原菌快，能与病原菌陈胜营养或空间竞争，有效地利用植物表面或侵入点附近低浓度营养物质迅速的占领空间吸收营养，占领病原菌的入侵位点而不为病原菌的入侵留下空隙；拮抗作用，如木霉菌可以产生的非挥发性代谢物强烈抑制棉花黄萎病菌生长，使病原菌菌丝出现细胞原生质浓缩和菌丝断裂等现象；诱导抗性作用，如绿色木霉穿透并定植在棉花根表皮和外皮层组织中，其过氧化物酶活性升高，萜类化合物积累，比没有被绿色木霉侵染的植株更有效地控制了病原菌感染，诱导了棉花的抗病性；寄生作用；抗生作用等。许多生防微生物是通过某一种单一机制起到生防作用的，也有部分微生物可通过集中不同机制之间的联合发挥功能。
本发明采用含毒介质法对耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液的抑菌活性进行鉴定。
本申请中，通过以下公式评价生防菌的抑菌特性：
菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％
实施例1抑菌特性鉴定
实验方法为：
1.挑取耐硼赖氨酸芽孢杆菌单菌落接种于LB培养基中，在37℃，150r/min的环境中过夜培养，次日，以3％v/v的接种量接种到发酵培养基中，置于温度为37℃，转速为150r/min的恒温摇床中培养24h-96h，分别在培养24h、60h和96h，测定发酵培养基的光密度值(OD值)，然后将发酵培养基置于离心机中，以8000r/min离心去除沉淀，获得发酵上清液，然后用0.22μm的滤膜过滤发酵上清液，即得到无菌的发酵液；
发酵培养基，包括以下成分：28g/L葡萄糖，13g/L蛋白胨，2.5g/L延胡索酸，0.08mg/L水苏碱，6g/L黄芩苷，2g/L(NH4)2SO4，2.2g/L CaCO3，0.3g/LMgSO4·7H2O，LB培养基补足1L，pH6.7。
2.将发酵液与冷却至55℃的PDA培养基以1：9的体积比混合，制成含拮抗菌发酵液的含药平板培养基；
3.待含药平板培养基凝固后，在平板中央接种1个供试芒果蒂腐病菌菌饼(直径为8mm)，每个培养时间点设三个平行试验，以不含发酵液的PDA培养基平板作为对照；
4.将接种后的培养基置于28℃恒温培养箱培养7d后，评价耐硼赖氨酸芽孢杆菌的抑菌特性，抑制率的计算结果见表1。
结合图1及上述菌丝生长抑制率的公式可以明显看出，芒果蒂腐病菌的生长明显被耐硼赖氨酸芽孢杆菌抑制。
表1
24h 60h 96h
OD<sub>600</sub> 4.8 4.0 2.5
菌丝生长抑制率(％) 62.6 64.7 70.1
经测算，耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵24h的发酵液对芒果蒂腐病菌的拮抗效率为62.6％，发酵60h的发酵液对芒果蒂腐病菌的拮抗效率为64.7％，发酵96h的发酵液对芒果蒂腐病菌的拮抗效率为70.1％。说明本发明耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液，可有效抑制芒果蒂腐病菌的生长，本申请经过多次实验验证，发现耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵时间在96h，OD600为2.5左右时，其抑制芒果蒂腐病菌生长的拮抗效率最佳。
实施例2发酵条件对抑菌效果的影响
实验方法为：
1.挑取耐硼赖氨酸芽孢杆菌单菌落接种于LB培养基中，在37℃，150r/min的环境中过夜培养，次日，以3％v/v的接种量接种到发酵培养基中，分别置于恒温摇床中培养96h后，将发酵培养基置于离心机中，以8000r/min离心去除沉淀，获得发酵上清液，然后用0.22μm的滤膜过滤发酵上清液，得到无菌的发酵液；
发酵培养基，包括以下成分：28g/L葡萄糖，13g/L蛋白胨，2.5g/L延胡索酸，0.08mg/L水苏碱，6g/L黄芩苷，2g/L(NH4)2SO4，2.2g/L CaCO3，0.3g/LMgSO4·7H2O，LB培养基补足1L；
其中，当恒温摇床温度为28℃、40℃、50℃时，摇床转速为150r/min，发酵培养基pH为6.7；
其中，当恒温摇床转速为100r/min、120r/min、180r/min时，摇床温度为37℃，发酵培养基pH为6.7；
其中，当发酵培养基的pH为5.5、6.5、7.0时，恒温摇床温度为37℃，转速为150r/min；
2.将发酵液与冷却至55℃的PDA培养基以1：9的体积比混合，制成含拮抗菌发酵液的含药平板培养基；
3.待含药平板培养基凝固后，在平板中央接种1个供试芒果蒂腐病菌菌饼(直径为8mm)，每个条件设三个平行试验，以不含发酵液的PDA培养基平板作为对照；
4.将接种后的培养基置于28℃恒温培养箱培养7d后，评价耐硼赖氨酸芽孢杆菌的抑菌特性。
表2
Figure BDA0003170365490000081
经测算，在本发明耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵条件下，发酵得到的发酵液可有效抑制芒果蒂腐病菌的生长，抑制效果明显优于其他发酵条件。
实施例3发酵培养基对抑菌效果的影响
实验方法为：
1.挑取耐硼赖氨酸芽孢杆菌单菌落接种于LB培养基中，在37℃，150r/min的环境中过夜培养，次日，以3％v/v的接种量分别接种到发酵培养基中，设发酵培养基为LB培养基的对照，置于温度为40℃，转速为120r/min的恒温摇床中培养96h后，将发酵培养基置于离心机中，以8000r/min离心去除沉淀，获得发酵上清液，然后用0.22μm的滤膜过滤发酵上清液，得到无菌的发酵液；
发酵培养基1，包括以下成分：28g/L葡萄糖，13g/L蛋白胨，2.5g/L延胡索酸，0.08mg/L水苏碱，6g/L黄芩苷，2g/L(NH4)2SO4，2.2g/L CaCO3，0.3g/LMgSO4·7H2O，LB培养基补足1L，pH6.7；
发酵培养基2，包括以下成分：25g/L葡萄糖，10g/L蛋白胨，2.2g/L延胡索酸，0.1mg/L水苏碱，5g/L黄芩苷，1g/L(NH4)2SO4，1.5g/L CaCO3，0.2g/LMgSO4·7H2O，pH6.5；
发酵培养基3，包括以下成分：35g/L葡萄糖，15g/L蛋白胨，3.2g/L延胡索酸，0.05mg/L水苏碱，7g/L黄芩苷，3g/L(NH4)2SO4，2.6g/L CaCO3，0.5g/LMgSO4·7H2O，LB培养基补足1L，pH6.8；
对照培养基，包括以下成分：28g/L葡萄糖，13g/L蛋白胨，2.5g/L柠檬酸，6g/L槲皮素，2g/L(NH4)2SO4，2.2g/L CaCO3，0.3g/L MgSO4·7H2O，LB培养基补足1L，pH6.7；
2.将发酵液与冷却至55℃的PDA培养基以1：9的体积比混合，制成含拮抗菌发酵液的含药平板培养基；
3.待含药平板培养基凝固后，在平板中央接种1个供试芒果蒂腐病菌菌饼(直径为8mm)，每个发酵培养基设三个平行试验，以不含发酵液的PDA培养基平板作为对照；
4.将接种后的培养基置于28℃恒温培养箱培养7d后，评价耐硼赖氨酸芽孢杆菌的抑菌特性。
表3
组别 菌丝生长抑制率(％)
发酵培养基1 71.1
发酵培养基2 69.4
发酵培养基3 70.2
对照培养基 37.1
LB培养基 62.6
根据本实施可知，采用本发明发酵培养基培养耐硼赖氨酸芽孢杆菌，所得发酵液对芒果蒂腐菌的抑制效果更佳。
实施例4不同发酵液提取物对抑菌效果的影响
实验方法为：
1.挑取耐硼赖氨酸芽孢杆菌单菌落接种于LB培养基中，在37℃，150r/min的环境中过夜培养，次日，以3％v/v的接种量分别接种到发酵培养基中，置于温度为37℃，转速为150r/min的恒温摇床中培养96h后，将发酵培养基置于离心机中，以8000r/min离心去除沉淀，获得发酵上清液，分别用乙酸乙酯、水萃取发酵上清液，得到发酵液的乙酸乙酯提取物和水提取物；
发酵培养基，包括以下成分：28g/L葡萄糖，13g/L蛋白胨，2.5g/L延胡索酸，0.08mg/L水苏碱，6g/L黄芩苷，2g/L(NH4)2SO4，2.2g/L CaCO3，0.3g/LMgSO4·7H2O，LB培养基补足1L，pH6.7。
2.将萃取物与冷却至55℃的PDA培养基以1：9的体积比混合，制成含拮抗菌发酵液的含药平板培养基；
3.待含药平板培养基凝固后，在平板中央接种1个供试芒果蒂腐病菌菌饼(直径为8mm)，每种萃取物设三个平行试验，以不含发酵液的PDA培养基平板作为对照；
4.将接种后的培养基置于28℃恒温培养箱培养7d后，评价耐硼赖氨酸芽孢杆菌的抑菌特性。
表4
成分 菌丝生长抑制率(％)
乙酸乙酯提取物 62.5
水提取物 66.7
根据本实施例可知，本发明发酵所得的耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液，其乙酸乙酯、水提取物对芒果蒂腐病菌均具有抑制作用，说明耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液中多种成分均对芒果蒂腐病菌具有不同程度的抑制作用。因此，可以将耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘微生物底盘细胞，用于大量生产具有抑菌活性的发酵液，从而满足农业及生产生活上对芒果蒂腐病菌杀菌剂的需求。
更进一步地，如可以在生防菌代谢物合成元件、装置的基础上，组装途径、合成模块，并模块或系统进行的理性修饰，从而产生更强效抑菌活性；或通过揭示基因线路和调控网络，合理设计或优化逻辑基因线路和功能基因线路，使之成为最小细胞工厂从而产生强效抑菌活性，则可以为芒果蒂腐病的防治带来了新的方向。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种芒果蒂腐病菌杀菌剂的应用，其特征在于，芒果蒂腐病菌杀菌剂包括：耐硼赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus boronitolerans）或其发酵液，
所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌保藏编号为CCTCC NO .M2019773；
所述应用为芒果蒂腐病菌杀菌剂在抑制芒果蒂腐病菌（Botryodiplodia theobromae）生长方面。
2.如权利要求1所述的芒果蒂腐病菌杀菌剂的应用，其特征在于，芒果蒂腐病菌杀菌剂还包括辅料。
3.如权利要求2所述的芒果蒂腐病菌杀菌剂的应用，其特征在于，所述辅料为水、液体培养基、固体培养基、甘油中的一种或者多种。
4.如权利要求1所述的芒果蒂腐病菌杀菌剂的应用，其特征在于，所述发酵液为将耐硼赖氨酸芽孢杆菌按2.5-4%v/v的接种量，接种到发酵培养基中，在37-45℃，振荡120-150r/min的条件下，发酵培养24-96h，待OD600为4.8-2.5时，停止发酵，得发酵液。
5.如权利要求4所述的芒果蒂腐病菌杀菌剂的应用，其特征在于，所述发酵培养基，包括以下成分：25-35g/L葡萄糖，10-15g/L蛋白胨，2.2-3.2g/L延胡索酸，0.05-0.1mg/L水苏碱，5-7g/L黄芩苷，1-3g/L（NH4）2SO4，1.5-2.6g/L CaCO3，0.2-0.5g/L MgSO4·7H2O，pH6.5-6.8。
6.如权利要求1所述的芒果蒂腐病菌杀菌剂的应用，其特征在于，所述抑制芒果蒂腐病菌生长方面的应用为预防或治疗芒果蒂腐病。
7.如权利要求6所述的芒果蒂腐病菌杀菌剂的应用，所述应用的方法为将芒果蒂腐病菌杀菌剂与介质混合。
8.如权利要求7所述的芒果蒂腐病菌杀菌剂的应用，其特征在于，所述介质为携带芒果蒂腐病菌的载体。
9.如权利要求8所述的芒果蒂腐病菌杀菌剂的应用，其特征在于，所述载体为种子、植物、植物生长的土壤、水环境和/或培养植物的培养基。
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