CN114350550B - 一种抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂及其制备方法，以耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞制得，耐硼赖氨酸芽孢杆菌经过种子培养液和发酵培养液培养使耐硼赖氨酸芽孢杆菌OD600值达到4.8‑2.5，制得耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液。本发明中种子培养液和发酵培养液不仅具有促进菌种生长、提高菌种活力的效果，而且能够提高耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵液中抗菌的次级代谢产物的种数，相比于单一的杀菌物质，多种次级代谢产物联合发挥的杀菌效果会更佳。

Description

一种抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及铜绿假单胞菌杀菌剂领域，特别涉及一种抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂及其制备方法。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种医院感染的机会病原体，包括医院获得性肺炎，血液，泌尿道，伤口和烧伤感染。主要感染囊性纤维化(CF)患者和免疫功能低下的个体。CF是一种遗传性疾病，由编码囊性纤维化跨膜电导调节剂的基因突变引起，导致CF患者气道表面形成厚厚的粘液层，阻碍粘膜纤毛清除，减少肺上皮细胞的细菌内化并抑制抗菌肽。因此，CF患者的肺是促进细菌生长和定植的有利环境。铜绿假单胞菌感染的治疗方法如下：
(1)抗生素治疗
对铜绿假单胞菌感染的治疗方法最常见的还是抗生素治疗。常见的抗生素如多粘菌素B；β-内酰胺类，如头孢吡肟，头孢他啶，哌拉西林-他唑巴坦；氨基糖苷类和磷霉素；但随着抗生素的过度使用，铜绿假单胞菌对多种抗生素产生抗性，包括氨基糖苷类，喹诺酮类和β-内酰胺类，导致许多抗生素疗法对该微生物逐渐无效。
(2)非抗生素治疗
由于抗生素的耐药性不断产生，出现了新型的非抗生素疗法，主要包括抑制群体感应和细菌凝集素，铁螯合的使用，噬菌体治疗，疫苗策略，纳米颗粒，抗菌肽和电化学支架。这些治疗方法可以用作常规抗生素治疗的替代方法或与之结合使用。但是，迄今为止，由于成本高，副作用大和安全性高，这些更新的方法很少进入临床实践。
因此，近年来科学家们正努力寻找和开发可替代传统抗生素疗法的新方法。其中某些微生物产生的具广谱活性，快速的杀灭动力学，低水平的诱导抗性和对宿主具低毒性的次级代谢产物被认为可用于治疗铜绿假单胞菌的感染。进一步可利用合成生物学改造对铜绿假单胞菌具有生长抑制功能的生防菌，将其改造成高版本模式微生物底盘细胞，使其作为最小细胞工厂生产生物农药，将成为最为快捷有效的控制铜绿假单胞菌病害途径，为铜绿假单胞菌的防治带来新的方向。
发明内容
鉴以此，本发明提出一种抑制铜绿单孢菌生长的杀菌剂的制备方法，本发明制得的杀菌剂能够应用于铜绿假单胞菌的防治。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂，所述抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂以耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞制得。
进一步的，所述抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂包括耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液和辅料。
进一步的，所述辅料为水、液体培养基、固体培养基、甘油中的一种或者多种。
进一步的，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液的制备方法为：
(1)将耐硼赖氨酸芽孢杆菌接种至种子培养液中，控制温度为35-38℃，150r/min培养13-15h，制得耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液；
(2)将耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液接种至发酵培养液，以140-160r/min转速置于37℃的摇床培养24-96h，使耐硼赖氨酸芽孢杆菌OD600值达到4.8-2.5，制得耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵菌液；
(3)将耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵菌液置于离心机中，以7500-8500r/min转速离心4-6min，获得发酵上清液，然后用0.22μm的滤膜过滤发酵上清液，即得到耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液。
进一步的，步骤(1)中，所述种子培养液包括10-15g/L的蛋白胨、7-9g/L的酵母膏、1-3g/L的半胱氨酸、1-3g/L的葡萄糖、15-25mg/L的硫酸亚铁和10-20mg/L的硫酸铜。
进一步的，步骤(2)中，所述发酵培养液包括20-30g/L的葡萄糖、10-15g/L的糊精、8-15g/L的海藻粉、2-3g/L的碳酸钙和0.5-0.7g/L的硫酸镁。
进一步的，步骤(2)中，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液和发酵培养液体积比为0.01-0.05:1。
进一步的，步骤(1)中，取耐硼赖氨酸芽孢杆菌1环，接种至种子培养液。
进一步的，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)，该菌种已于2019年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO.M2019773。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明以耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞制得一种抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂，能够减少在铜绿假单胞菌防治方面抗生素的使用，且对环境和人体健康无害。本发明的种子培养液中含有适合耐硼赖氨酸芽孢杆菌生长的碳源、氮源及多种营养元素，能够促进耐硼赖氨酸芽孢杆菌生长，提高种子活力。发酵培养液不仅促进种子大量繁殖生长，缩短培养时间，而且提高耐硼赖氨酸芽孢杆菌活性和增加代谢产物数量。耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵液中含多种抗菌的次级代谢产物，相比于单一的杀菌物质，多种次级代谢产物联合发挥的杀菌效果会更佳，同时这些次生代谢产物具广谱活性，快速的杀灭动力学，低水平的诱导抗性和对宿主具低毒性等特征。
2、本发明含有耐硼赖氨酸芽孢杆菌OD600值达到4.8-2.5的杀菌剂对铜绿假单胞菌的抑制率高达83.5-86.1％。
附图说明
图1试验例2耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液对铜绿假单胞菌生长的平板抑制实验效果图。
图2试验例3不同OD值的耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液对铜绿假单胞菌生长抑制实验效果图
图3试验例4耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液中脂肽类化合物抑制铜绿假单胞菌生长实验效果图
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂的制备方法
1、种子培养液由10g/L的蛋白胨、7g/L的酵母膏、1g/L的半胱氨酸、1g/L的葡萄糖、15mg/L的硫酸亚铁和10mg/L的硫酸铜组成。
2、发酵培养液由20g/L的葡萄糖、10g/L的糊精、8g/L的海藻粉、2g/L的碳酸钙和0.5g/L的硫酸镁组成。
3、取耐硼赖氨酸芽孢杆菌1环，接种至种子培养液，控制温度为35℃，140r/min培养13h，制得耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液；
4、将耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液接种至发酵培养液，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液和发酵培养液体积比为0.01:1，以140r/min转速置于37℃的摇床培养24h，使耐硼赖氨酸芽孢杆菌OD600值达到4.8，制得耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵菌液；
5、将耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵菌液置于离心机中，以7500r/min转速离心4min，获得发酵上清液，然后用0.22μm的滤膜过滤发酵上清液，即得到耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液。
6、将耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液、水和甘油按照体积比0.5:10:3制得抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂。
实施例2抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂的制备方法
1、种子培养液由13g/L的蛋白胨、8g/L的酵母膏、2g/L的半胱氨酸、2g/L的葡萄糖、20mg/L的硫酸亚铁和15mg/L的硫酸铜组成。
2、发酵培养液由25g/L的葡萄糖、13g/L的糊精、11g/L的海藻粉、2.5g/L的碳酸钙和0.6g/L的硫酸镁组成。
3、取耐硼赖氨酸芽孢杆菌1环，接种至种子培养液，控制温度为37℃，150r/min培养14h，制得耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液；
4、将耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液接种至发酵培养液，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液和发酵培养液体积比为0.03:1，以150r/min转速置于37℃的摇床培养96h，使耐硼赖氨酸芽孢杆菌OD600值达到2.5，制得耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵菌液。
5、将耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵菌液置于离心机中，以8000r/min转速离心5min，获得发酵上清液，然后用0.22μm的滤膜过滤发酵上清液，即得到耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液。
6、将耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液、水和甘油按照体积比0.5:10:3制得抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂。
实施例3抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂的制备方法
1、种子培养液由15g/L的蛋白胨、9g/L的酵母膏、3g/L的半胱氨酸、3g/L的葡萄糖、25mg/L的硫酸亚铁和20mg/L的硫酸铜组成。
2、发酵培养液由30g/L的葡萄糖、15g/L的糊精、15g/L的海藻粉、3g/L的碳酸钙和0.7g/L的硫酸镁组成。
3、取耐硼赖氨酸芽孢杆菌1环，接种至种子培养液，控制温度为38℃，160r/min培养15h，制得耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液；
4、将耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液接种至发酵培养液，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液和发酵培养液体积比为0.05:1，以160r/min转速置于37℃的摇床培养60h，使耐硼赖氨酸芽孢杆菌OD600值达到4.0，制得耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵菌液。
5、将耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵菌液置于离心机中，以8500r/min转速离心6min，获得发酵上清液，然后用0.22μm的滤膜过滤发酵上清液，即得到耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液。
6、将耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液、水和甘油按照体积比0.5:10:3制得抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂。
实施例4抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂的制备方法
在实施例2的基础上，步骤(4)中，调整培养时间，具体为：将耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液接种至发酵培养液，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液和发酵培养液体积比为0.03:1，以150r/min转速置于37℃的摇床培养105h，使耐硼赖氨酸芽孢杆菌OD600值达到2.2，制得耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵菌液。
实施例5抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂的制备方法
在实施例2的基础上，步骤(4)中，调整培养时间，具体为：将耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液接种至发酵培养液，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液和发酵培养液体积比为0.03:1，以150r/min转速置于37℃的摇床培养12h，使耐硼赖氨酸芽孢杆菌OD600值达到5.3，制得耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵菌液。
实施例6抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂的制备方法
在实施例2的基础上，步骤(1)中，调整种子培养液的配比，具体为：种子培养液由10g/L的蛋白胨、10g/L的酵母膏、5g/L的半胱氨酸、10g/L的葡萄糖、10mg/L的硫酸亚铁和10mg/L的硫酸铜组成。
实施例7抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂的制备方法
在实施例2的基础上，步骤(2)中，调整发酵培养基的配比，具体为：发酵培养液由10g/L的葡萄糖、10g/L的糊精、10g/L的海藻粉、2.5g/L的碳酸钙和0.6g/L的硫酸镁组成。
对比例1
在实施例2的基础上，步骤(2)中，调整发酵培养基的原料，具体为：25g/L的麦芽糖、13g/L的淀粉、11g/L的酵母膏、2.5g/L的碳酸钙和0.6g/L的硫酸镁组成。
试验例1
采用实施例1-7和对比例1制得的耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵菌液进行试验，试验方法为挑取铜绿假单胞菌单菌落分别接种至LB液体培养基中，37℃，150r/min过夜培养，稀释铜绿假单胞菌的菌液，使OD600为0.1OD600/mL，吸取1mL，6000rpm离心10min，弃去上清液，沉淀加入1mLPBS缓冲液冲洗3次，6000rpm离心3min，弃去上清液，沉淀分别加入500μL实施例2制得的耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵，置于37℃恒温培养箱孵育10-12h，对照组将耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液替换成PBS缓冲液。分别吸取5μL实验组和对照组的菌悬液，垂直滴入LB平板的中心点，置于37℃恒温培养箱静止培养18-36h，观察铜绿假单胞菌的生长直径。检测指标为菌丝生长抑制率。
菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100％
菌落直径采用十字交叉法进行测量，菌饼直径为8mm。
组别 抑制率(％)
实施例1 83.5％
实施例2 86.1％
实施例3 84.8％
实施例4 77.3％
实施例5 75.4％
实施例6 72.8％
实施例7 74.1％
对比例1 71.6％
实验结果表明，耐硼赖氨酸芽孢杆菌对铜绿假单胞菌有明显的抑制生长的效果，抑制率高达86.1％。实施例4-5调整硼赖氨酸芽孢杆菌种子液在发酵培养液中的培养时间，导致耐硼赖氨酸芽孢杆菌对铜绿假单胞菌的抑制效果下降。本发明中将OD600值控制在4.0-2.5的范围区间，有利于提高耐硼赖氨酸芽孢杆菌对铜绿假单胞菌的抑制效果。实施例6和实施例7分别调整种子培养液和发酵培养液的配方。本发明种子培养液和发酵培养液合理配比，促进菌种生长，提高菌种活力。对比例1改变发酵培养液的组分，导致抑制效果下降，本发明中优选培养基原料组成，不仅有利于促进菌种生长，而且提高发酵液中代谢产物数量，进一步提高耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液对铜绿假单胞菌的抑制效果。
试验例2
试验过程：(1)挑取铜绿假单胞菌单菌落分别接种至LB液体培养基中，37℃，150r/min过夜培养，稀释铜绿假单胞菌的菌液，使OD600为0.1OD600/mL，吸取1mL，6000rpm离心10min，弃去上清液，沉淀加入1mLPBS缓冲液冲洗3次，6000rpm离心3min，弃去上清液，沉淀分别加入500μL实施例2制得的耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵，置于37℃恒温培养箱孵育10-12h，对照组将耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液替换成PBS缓冲液。分别吸取5μL实验组和对照组的菌悬液，垂直滴入LB平板的中心点，置于37℃恒温培养箱静止培养18-36h，观察铜绿假单胞菌的生长直径。
试验结果：参见图1，其中，图1A是实验组，使用耐硼赖氨酸芽孢杆菌液处理；图1B是对照组，使用PBS处理。培养基中间圆点为滴入的处理后的靶标病原菌。通过图1明显看出，铜绿假单胞菌的生长明显被耐硼赖氨酸芽孢杆菌抑制。
试验例3
试验过程：(1)将铜绿假单胞菌在LB固体培养基上划线活化，挑取单菌落至5mL LB液体培养基中，过夜培养12～14h，按0.01OD600/mL转接至20mL LB液体培养基中，150rpm，37℃振荡培养4～8h，测量600nm处的吸光度，将菌液稀释至1OD600/mL；取上述菌液1mL，4000rpm离心3min，弃去上清，用PBS缓冲液重悬，再次离心，反复操作3次，洗去多余培养基。试验组加入1mL耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液液重悬，对照组使用PBS缓冲液重悬，4℃孵育过夜。
(2)将孵育过后的铜绿假单胞菌，按10倍梯度稀释至7.2×102CFU/mL，对照组加入PBS缓冲液，试验组加入纯净的LB液体培养基进行稀释；然后从各浓度菌液内分别吸取2.5μL滴加在LB固体培养基表面，37℃静置培养20～24h后，观察菌落生长情况。
试验结果：参见图2，图中E1,E2,E3为三个重复，为使用耐硼赖氨酸芽孢杆菌无菌发酵液处理后的铜绿假单胞菌生长状况；C1,C2,C3为三个重复，为使用纯净LB培养基处理后的铜绿假单胞菌生长状况。从上述结果可以看出，经过耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液处理后，铜绿假单孢菌的生长受到了明显抑制，形成的菌落大小相比对照组较小。说明耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液中存在一些生物活性物质，能够有效抑制铜绿假单胞菌的生长。
试验例4
试验过程：(1)耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液中脂肽类化合物粗提取：在实施例2制得的耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液中滴加浓盐酸，调节pH至2.0，4℃静置过夜，12000rpm离心10min，收集沉淀，将沉淀冷冻干燥，加入发酵液1/3体积的无水甲醇，振荡萃取10～12h，离心取上清，继续加入无水甲醇振荡，重复三次，将萃取后的甲醇合在一起，55℃旋蒸至干燥，再加入1mLDMSO溶解，置于4℃保存。
(2)将铜绿假单胞菌在LB固体培养基上划线活化，挑取单菌落至5mL LB液体培养基中，过夜培养12～14h，按0.01OD600/mL转接至20mL LB液体培养基中，150rpm，37℃振荡培养4～8h，测量600nm处的吸光度，将菌液稀释至0.01OD600/mL；吸取995μL上述菌液加入24孔well plate中，试验组中加入5μL粗提物，对照组加入5μL DMSO，然后在酶标仪上37℃振荡培养，间隔1h检测一次吸光度，检测波长：600nm。
试验结果：参见图3，从铜绿假单胞菌的生长曲线可以看到，经过耐硼赖氨酸芽孢杆菌脂肽类化合物处理后，从8小时开始，铜绿假单胞菌的生长受到了较为明显的抑制，试验组的菌液OD数约为对照组的65％，并且这种抑制效果能够延续到24h左右，说明耐硼赖氨酸芽孢杆菌中产生的脂肽类化合物能够对铜绿假单胞菌的生长起到一定的抑制作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂，其特征在于，所述抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂以耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞制得，所述铜绿假单胞菌保藏编号为CCTCCNO.M 2019773。
2.如权利要求1所述的抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂，其特征在于，所述杀菌剂包括耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液和辅料。
3.如权利要求2所述的抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂，其特征在于，所述辅料为水、液体培养基、固体培养基、甘油中的一种或者多种。
4.如权利要求2所述的抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂的制备方法，其特征在于，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液的制备方法为：
(1)将耐硼赖氨酸芽孢杆菌接种至种子培养液中，控制温度为35-38℃，150r/min培养13-15h，制得耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液；
(2)将耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液接种至发酵培养液，以140-160r/min转速置于37℃的摇床培养24-96h，使耐硼赖氨酸芽孢杆菌OD600值达到4.8-2.5，制得耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵菌液；
(3)将耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵菌液置于离心机中，以7500-8500r/min转速离心4-6min，获得发酵上清液，然后用0.22μm的滤膜过滤发酵上清液，即得到耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液。
5.如权利要求4所述的抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述种子培养液包括10-15g/L的蛋白胨、7-9g/L的酵母膏、1-3g/L的半胱氨酸、1-3g/L的葡萄糖、15-25mg/L的硫酸亚铁和10-20mg/L的硫酸铜。
6.如权利要求4所述的抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述发酵培养液包括20-30g/L的葡萄糖、10-15g/L的糊精、8-15g/L的海藻粉、2-3g/L的碳酸钙和0.5-0.7g/L的硫酸镁。
7.如权利要求4所述的抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌种子液和发酵培养液体积比为0.01-0.1:1。
8.如权利要求4所述的抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，取耐硼赖氨酸芽孢杆菌1环，接种至种子培养液。
9.根据权利要求4-8任意一项的抑制铜绿假单胞菌生长的杀菌剂的制备方法制得的杀菌剂。
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