CN111187726A - 一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞制备的稻瘟病杀菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)在抑制稻瘟病菌(Magnaporthe oryzea)生长的应用。耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)不仅可以很大程度上降低稻瘟病的发生和危害，而且对生态环境没有影响，有望作为合成生物学研究的优质底盘微生物，为稻瘟病的防治带来新的方向。

Description

一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞制备的稻瘟病杀菌剂

技术领域

本发明涉及一种生防菌的合成生物学改造和应用，特别地涉及一种稻瘟病杀菌剂。

背景技术

“民以食为天，食以稻为先”。近5年来，我国水稻播种面积占粮食作物播种面积的27.5％左右，水稻单产比粮食作物平均单产高35.7％，稻谷产量占粮食总产的37.3％以上。水稻是我国单产最高、总产最多的粮食作物。全国65％以上人口以稻米为主食，生产的85％以上稻米作为口粮消费。一旦稻米供给不足，人民的生活就会受到影响，稻米供求的细小变化都会导致粮食价格乃至整个物价波动。水稻丰歉直接关系到粮食丰歉，水稻安全直接关系到国家粮食安全。

稻瘟病是水稻重要病害之一，可引起水稻的大幅度减产，严重时可导致减产40％～50％，甚至颗粒无收。稻瘟病是真菌(如稻瘟病菌)寄生引起，病害的扩展靠分生孢子在空气中传播。病菌发育最适温度为25℃～28℃，高湿有利分生孢子形成飞散和萌发，而高湿度持续达一昼夜以上，则有利于病害发生流行。稻瘟病菌属于半知菌亚门，除感染水稻致其感染稻瘟病外，还能引起人类和一些动物皮肤病。

常见的稻瘟病菌防治措施包括：

物理措施：选用排灌方便的田块；不种植感病品种；使用无病菌感染的土；定期检查病情，发现病株及时拔出等。此种防治方法需消耗大量精力，且很难完全清除土壤中的全部致病菌，一旦致病菌再次泛滥，将带来不可估量的损失。

药物防治：提前使用抗菌化学制剂浸种，喷洒农药等。尽管化学药剂的使用对植物病害防治带来了诸多便利以及成效，但是化学药剂的生产成本本身较高，并且使用化学药剂杀菌后，随之而来的环境污染、农产品农药残留超标以及病原菌抗药性的形成等负面效应已经引起社会的广泛关注。

因此，近年来世界各国都在努力开发可替代传统化学药剂控制植物病害的新方法。其中利用微生物及其代谢产物进行生物防治，被公认为是一种环境友好型的选择。进一步地，利用合成生物学改造具有抗稻瘟菌功能的生物系统，或者对稻瘟病菌具有生长抑制功能的生防菌，将其改造成高版本模式微生物底盘细胞，使其作为最小细胞工厂生产生物农药，将成为最为快捷有效的控制植物病害途径。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)，于2019年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO.M 2019773。

如上所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌在抑制稻瘟病菌(Magnaporthe oryzea) 生长方面的应用。

一种杀菌剂，包括：如上所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液(Lysinibacillusboronitolerans)以及辅料。

如上所述的杀菌剂，所述辅料为水、液体培养基、固体培养基、甘油中的一种或者多种。

如上所述的杀菌剂，其中所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵液为如上所述的硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)经24-96小时培养，OD₆₀₀为4.8-2.5时的发酵液。

如上所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液在制备抑制稻瘟病菌(Magnaportheoryzea)生长的杀菌剂的应用。

如上所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞在制备抑制稻瘟病杀菌剂中的应用。

一种如上所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞为基础的改造模块。

如上所述的改造模块在制备抑制稻瘟病菌(Magnaporthe oryzea)生长的杀菌剂中的应用。

一种用于预防或治疗稻瘟病的方法，包括：获取如上所述的杀菌剂；以及将所述杀菌剂与介质混合。

如上所述的方法，其中，所述介质为携带稻瘟病菌(Magnaporthe oryzea) 的载体。

如上所述的方法，其中，所述载体为种子、植物、植物生长的土壤、培养植物的培养基中的一者或多者。

如上所述的杀菌剂，其中所述耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)发酵液为耐硼赖氨酸芽孢杆菌以200ml菌液(初始OD为 0.02OD₆₀₀/ml)/500ml LB培养基的装液量，在37℃下以150r/min转速培养24h、 60h或96h，且菌液OD值分别达到4.8、4.0、2.5时得到的发酵产物。

稻瘟病是水稻的重要病害，给农业生产造成了严重的经济损失。由于大量使用化学农药给环境和食品也带来了巨大的威胁。耐硼赖氨酸芽孢杆菌 (Lysinibacillusboronitolerans)不仅可以很大程度上降低稻瘟病的发生和危害，而且对生态环境没有影响，有望作为合成生物学研究的优质底盘微生物，为稻瘟病的防治带来新的方向。

附图说明

下面，将结合附图对本发明的优选实施方式进行进一步详细的说明，其中：

图1是根据本申请的一个实施例的对从土壤中分离的潜在生防菌的鉴定。其中，图1A是从土壤中分离并纯化的细菌基因组DNA凝胶电泳分离图谱；图1B是用16S引物对基因组DNA进行特异性扩增所获得PCR产物的凝胶电泳分离图谱；图1C是通过序列比对后获得的潜在生防菌的系统进化树，通过序列比对分析，鉴定所获取的潜在生防菌是耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)；

图2是根据本申请的一个实施例的耐硼赖氨酸芽孢杆菌不同时期发酵液对稻瘟病菌的生长抑制作用。其中，图2A、2B、2C是实验组，在其培养基中分别加入了耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵24h、60h、96h后获得的无菌发酵滤液；图2D是对照组，未在其培养基中加入耐硼赖氨酸芽孢杆菌的无菌发酵滤液；

图3为根据本申请的一个实施例的耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)96h发酵液的不同浓度乙酸乙酯提取物对稻瘟病菌 (Magnaportheoryzea)的抑菌活性检测。其中，粗提物的浓度分别为1mg/ml、 5mg/ml、10mg/ml和15mg/ml；以及

图4为根据本申请的一个实施例的耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)96h发酵液以不同饱和度的硫酸铵沉淀所获得提取物对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzea)的抑菌活性检测。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在以下的详细描述中，可以参看作为本申请一部分用来说明本申请的特定实施例的各个说明书附图。本申请的各个特定实施例在以下进行了足够详细的描述，使得具备本领域相关知识和技术的普通技术人员能够实施本申请的技术方案。应当理解，还可以利用其它实施例或者对本申请的实施例进行结构、逻辑的改变。

本领域技术人员应当理解，当陈述细菌经发酵、培养至一定浓度时，所说的浓度为一定数值范围内的浓度，例如当以OD值表示浓度时，申请中若出现 OD₆₀₀为4.8，则实际OD值约为4.8，如OD₆₀₀值为4.8±0.6。将细菌发酵、培养至一定程度所需时间均为不能精确至分、秒的确定的时间，且所需时间与细菌发酵、培养的环境温度、培养基种类等均有关系，所以本申请中出现的与细菌发酵、培养、生长等相关的时间，均为大约的时间，而不是确定的时间。

本申请中出现的一些名词具有如下释义：

本申请所说的发酵液是指菌经发酵后产生的含有发酵产物的液体，例如耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)发酵液为耐硼赖氨酸芽孢杆菌以200ml菌液(初始OD约为0.02OD₆₀₀/ml)/500ml LB培养基的装液量，在37℃下以150r/min转速培养约24h、60h或96h得到的发酵产物。耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵时间约为24、60h和96h时，菌液OD值分别约为4.8、4.0和 2.5(OD值随着发酵时间的延长而降低)。发酵结束后，离心去除沉淀，收集发酵上清液，然后用0.22μm的滤膜过滤，即得到无菌的发酵滤液。

本申请所说的含毒介质法又叫生长速率法,是杀菌剂毒力测定的常规方法之一,适用于不长孢子而菌丝生长较快的真菌。通过菌落生长的速度快慢可以衡量药剂的毒力大小。含毒介质法是将供试药剂与培养基混合,以培养基上菌落的生长速度来衡量药剂的毒力大小。一般多用于那些不产孢子或孢子量少而菌丝较密的真菌。菌落生长速率一般通过菌落达到一个给定的大小所需要的时间 (天或小时)，或者在单位时间内菌落直径的大小表示。

本申请所说的打孔法，是指用已灭菌的打孔器或钢管等在试验平板上打孔，然后往孔中注入一定量的待检测样品，培养一段时间后测定其抑菌圈大小的一种方法。

本文所说的萃取法是指利用化合物在两种互不相溶(或微溶)的溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中。经过反复多次萃取，将绝大部分的化合物提取出来的方法。乙酸乙酯属于中极性溶剂，可以从细菌的发酵滤液中萃取多种物质，例如具有较小极性的分子(如葡萄糖或带糖的苷类)、特小极性的分子(如某些石蜡)、含有盐结构的分子(如氨基酸)等。

本申请所说的硫酸铵沉淀是指用不同浓度硫酸铵溶液对蛋白质进行沉淀和分离的技术。常用于分离免疫球蛋白。硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

本申请所说的16S引物鉴定细菌是指运用PCR及序列比对等方法，确定待测细菌的种类。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成。其分子内存在的可变区，显示出细菌不同分类等级水平上的特异性。

细菌中包括三种核糖体RNA，分别为5S、16S和23S rRNA。其中，5S rRNA 虽易分析，但核苷酸数量太少，仅几十个核苷酸组成，导致遗传信息不足而不能用于分类研究；23SrRNA则因其分子量太大，所含有的核苷酸数量几乎是 16S rRNA的两倍，分析较困难而不选择其进行分类研究。通常将16S rRNA用于细菌分类研究。

首先，16S rRNA普遍存在于原核生物(真核生物中其同源分子是18S rRNA)中。rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。第三，16S rRNA的相对分子量大小适中，约2kb个核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。

16S rRNA的编码基因是16S rDNA，直接从细菌中提取16S rRNA很困难，且提取的RNA易降解，不易保存等，因而通常利用16S rDNA鉴定细菌的种类。

本申请所说PCR即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链 DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。PCR是一项体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增目的DNA片段。在本申请的实施例中，母链可以为单克隆待测细菌的基因组DNA。

本申请所述的OD值是optical density(光密度)的缩写，表示被检测物吸收的光密度。测量细菌培养液在600nm处的吸光值(用OD₆₀₀表示)，可以测量细菌培养液的浓度，从而估计细菌的生长情况，所以600nm处的光密度值可以用于表示菌体细胞密度，其中，吸光值正比于培养液中的细菌的浓度。

本申请所述PDA培养基，是指马铃薯葡萄糖培养基，其中P、D、A即为 PotatoDextrose Agar(Medium)的缩写。PDA培养基是一种常用的酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌培养基，是一种半合成培养基。

本申请所说的生防细菌或者生防菌，是指具有生物防治功能的一种或者多种细菌。是指利用有益微生物杀灭或压低病原生物数量以控制植物病害发生、发展的一类措施。又称“以菌治菌”。生物防治是病虫害综合治理体系的重要一环。它具有不污染环境、对人畜无毒、对植物无副作用等优点,对土传病害的控制尤其适用。

在生态环境中，一种微生物控制其他微生物生长的作用机制有很多种，不同的生防菌，以及同种生防菌在与不同植物作用时，可能有不同的生防机制。以木霉菌为例，生防菌的生防机制大体可分为竞争作用，如木霉菌对环境的适应性强，生长速度远比病原菌快，能与病原菌竞争营养或空间，有效地利用植物表面或侵入点附近的浓度营养物质，迅速占领空间吸收营养，占领病原菌的入侵位点而不为病原菌的入侵留下空隙；拮抗作用，如木霉菌可以产生的非挥发性代谢物能够强烈抑制棉花黄萎病菌生长，使病原菌菌丝出现细胞原生质浓缩和菌丝断裂等现象；诱导抗性作用，如绿色木霉穿透并定植在棉花根表皮和外皮层组织中，其过氧化物酶活性升高，萜类化合物积累，比没有被绿色木霉侵染的植株更有效地控制了病原菌感染，诱导了棉花的抗病性；寄生作用；抗生作用等。许多生防微生物是通过某一种单一机制起到生防作用的，也有部分微生物可通过集中不同机制而联合发挥功能。

本申请通过从土壤中分离、纯化出约100多株可能具有生防活性的细菌，以本实验室中现存的主要真菌病原菌作为靶标，检测分离细菌的生防特性。

实施例1土壤菌株的分离、纯化

根据本申请的一个实施例，可以从可能存在生防细菌的任何土壤中分离、纯化细菌，检测其生防特性。根据本申请的一个实施例，取番茄-水稻轮作土壤，并对其中的细菌进行分离、纯化。

1.制备土壤稀释液。称取适量的土壤。此处所说土壤为提前从野外取回的可能含有生防菌的土壤。根据本申请的一个实施例，也可以直接在野外称取土壤。根据本申请的一个实施例，可以称取10g土壤。将称取的土壤放入无菌水中，打碎，后静置30分钟以上，充分析出土壤中的微生物。根据本申请的一个实施例，称取10g土壤，将其混于100mL无菌水中。得到的上清液即为土壤原液。

然后将土壤原液稀释10倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍等。根据本申请的一个实施例，按上述方式稀释，即可得到1g、10^-1g、10^-2g、10^-3g、 10^-4g、10^-5g、10^-6g等土壤中微生物含量。此步骤便于获得土壤中微生物的单克隆。例如，根据本申请的一个实施例，吸取10mL土壤原液于0号试管中，再从本试管中吸取1mL土壤原液，混合于装有9mL无菌水的1号试管中，充分混合，是以将土壤原液稀释10倍。依次操作，即可得到土壤原液稀释10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍的溶液。按土壤原液的稀释倍数，将试管分别标号为0，1，2，3，4，5，6。

2.涂板。即，将步骤1中各试管中的微生物，涂布于固体培养基上。根据本申请的一个实施例，从步骤1制作的7个试管中分别吸取溶液，移送至细菌固体培养基表面，并用刮刀、玻璃棒等工具将溶液涂布均匀。晾晒至培养基表面较干燥，无液体状态后，将培养基封装。根据本申请的一个实施例，可利用封口膜封装。根据本申请的一个实施例，根据实验及统计的需求，可以将每个稀释度的溶液涂布于多个固体培养基表面。例如将每个稀释度的溶液均涂布于 3个固体培养基表面。

3.微生物培养。将涂布细菌的固体培养基放置于合适环境中，待长出可见单克隆菌落后，取出。根据本申请的一个实施例，可以将细菌放置37℃恒温环境中培养，如37℃恒温箱，水浴等，培养12小时以上。也可以将细菌放置在 28℃环境中培养，如28℃恒温箱，水浴等，培养48小时以上。

4.计数及菌落描述。计算每个固体培养基表面的菌落个数，观察其菌落形态特征，并记录结果。例如，0号试管中为直接吸取的10mL土壤原液，将其涂覆于固体培养基上，培养得到的菌落数目即为1g土壤中细菌数；1号试管中液体为将0号试管中溶液稀释10倍得到的，所以将其涂覆于固体培养基上，培养得到的菌落数目即为0.1g土壤中细菌数，其他试管以此类推。

5.平板划线分离。将上述步骤中得到的菌落划线分离，置于适合温度重新培养。如此操作，不仅可以将单克隆菌种分离，还可以对单克隆菌种扩繁和保存，且利于后续测序、分类试验。

6.菌种保存和鉴定。

实施例2鉴定菌株种类

根据本申请的一个实施例，可以用细菌16S通用引物对菌株种类进行初步鉴定。根据本申请的一个实施例，可以直接将菌株作为模板进行菌种鉴定，也可以先提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板进行菌种鉴定。根据本申请的一个实施例，使用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的细菌基因组DNA含量、品质。图1A为根据本申请的一个实施例所提取的细菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图，如图1A所示，基因组DNA的条带明显，浓度符合后续PCR实验的需求。

1.设计选择引物进行16S rDNA的PCR扩增。根据本申请的一个实施例，可自行设计鉴定菌株种类的PCR引物。根据本申请的一个实施例，也可以选择常用的细菌鉴定通用引物进行PCR扩增。根据本申请的一个实施例，选用通用引物27F和1492R进行PCR扩增，其中27F和1492R的DNA序列如下：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

根据选取的不同DNA聚合酶，选择适合的PCR反应体系以及反应条件。本申请不限定任何种类DNA聚合酶的使用，也不限定使用同一种DNA聚合酶后PCR反应体系与反应条件。例如，选用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增时，可参考如表1所列的反应体系：

表1.PCR体系表(12μL)

PCR的反应条件为：首先进行预变性，条件为94℃、5min，然后进入循环程序，每个循环程序是94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 30s，进行30个循环，最后72℃保温7min。

根据本申请的一个实施例，使用琼脂糖凝胶电泳检测以提取的基因组 DNA为模板经16S通用引物进行PCR后得到的DNA片段的含量与品质。图 1B为根据本申请的一个实施例为根据所提取的细菌基因组DNA为模板经16S 通用引物进行PCR后得到的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳图。如图1B所示，7 组实验均得到条带单一、浓度符合后续测序鉴定需求的PCR产物。

2.菌株种类鉴定。根据本申请的一个实施例，可以对上述实验得到的PCR 产物进行测序处理。将得到的测序结果与现有菌种序列进行比对，最终得到所鉴定菌株的种类。例如，将测序得到的结果输入至NCBI网站 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行blast，即可得到所鉴定菌株种类。

图1C是根据本申请的一个实施例，采用16S引物对所分离的菌株进行PCR 扩增获得16S rDNA，并通过序列比对后获得的系统进化树，鉴定得到的生防菌是耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)。该菌种已于2019年 10月8日保藏于湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO.M 2019773。根据图1C 中所示的系统进化树，可以很清晰地看出本申请的耐硼赖氨酸芽孢杆菌 (Lysinibacillus boronitolerans)与其他细菌种属的进化关系。

实施例3分离细菌的生防特性鉴定

根据本申请的一个实施例，可采用含毒介质法对本申请分离出的潜在生防菌的抑菌活性进行鉴定。根据本申请的一个实施例，含毒介质法的具体操作为：

1.配置PDA固体培养基，并将其冷却至55℃左右；或者将已凝固的PDA 培养基加热融化并冷却至55℃左右；

2.挑取耐硼赖氨酸芽孢杆菌单菌落接种于LB液体培养基中，37℃，150 r/min过夜培养，次日转接菌液，以200ml菌液/500ml LB培养基的装液量，至终浓度为0.02OD₆₀₀/ml，150r/min转速，置于恒温摇床37℃培养约24h、60 h和96h，使得OD值分别达到4.8、4.0和2.5左右。在不同时间点分别收集发酵产物，置于离心机中，以8000r/min离心去除沉淀，获得发酵上清液。然后用0.22μm的滤膜过滤发酵上清液，即得到无菌的发酵滤液；

3.将发酵滤液与PDA培养基以1：9的体积比混合，即发酵液占10％，制成含拮抗菌发酵液的含药平板；

4.待混有发酵液的培养基冷却后，在平板中央接种1个供试病原菌菌饼 (直径为8mm)；

5.将接种后的培养基置于28℃恒温培养箱进行培养。

以不含发酵液的PDA培养基平板作为对照，以上步骤1-4重复至少三次，即做至少三个生防菌对特定细菌抑菌性测试实验。

本申请中，通过以下公式评价生防菌的抑菌特性：

菌丝生长抑制率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-0.8) ×100％

图2所示为根据本申请的一个实施例的耐硼赖氨酸芽孢杆菌 (Lysinibacillusboronitolerans)发酵滤液对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzea)的生长抑制作用。其中，图2A、2B、2C是实验组，在其培养基中分别加入了耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵约24h、60h、96h后获得的无菌发酵滤液；图2D是对照组，未在其培养基中加入耐硼赖氨酸芽孢杆菌的无菌发酵滤液。培养基中间的圆点为滴入的靶标病原菌。根据本申请的一个实施例，靶标病原菌为稻瘟病菌(Magnaporthe oryzea)。

结合图2及上述公式可以明显看出，稻瘟病菌的生长明显被耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵滤液抑制。经测算，耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)发酵约24h、60h和96h的发酵液对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzea)的拮抗效率分别约为27.14％、42.85％、57.69％。根据本申请的多次实验验证，耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)的发酵时间在96h， OD为2.5左右时，其发酵滤液可有效抑制稻瘟病菌(Magnaporthe oryzea)生长，拮抗效率达到约57.69％。

实施例4分离细菌发酵滤液粗提物的生防特性鉴定

根据本申请的一个实施例，采用乙酸乙酯萃取法和硫酸铵沉淀提取法对具有生防效果的细菌发酵液进行粗提取，并采用打孔法对粗提物的抑菌活性进行鉴定。

根据本申请的一个实施例，打孔法的具体操作步骤如下：

1)配置PDA固体培养基，并将其冷却至55℃左右；或者将已凝固的PDA 培养基加热融化并冷却至55℃左右；

2)待培养基冷却后，在培养基的中线部分，距中心点各3.5cm，用0.8cm 的打孔器小心按压打孔，用灭菌后的镊子夹出多余的培养基，在平板中央接种 1个供试病原菌菌饼(直径为8mm)；

3)往打好的孔里小心注入提取物。本实验左边孔里为对照溶剂，右边为提取物。

根据本申请的一个实施例，制备粗提物的具体操作如下：

(1)乙酸乙酯萃取法制备粗提物

将耐硼赖氨酸芽孢杆菌于37℃，以150r/min转速培养，然后转接菌液，以200ml菌液/500ml LB培养基的装液量，至终浓度为0.02OD₆₀₀/ml，继续 150r/min转速，于37℃培养至96h，使得OD值达到2.5左右，收集发酵产物， 8000r/min离心去除沉淀，获得发酵上清液，然后用0.22μm的滤膜过滤，即得到无菌的发酵滤液。取400ml无菌发酵滤液，加入等体积的乙酸乙酯溶剂，振荡萃取4次，萃取结束后，使用分液漏斗将上层的乙酸乙酯全部取出，获得萃取液。合并4次萃取液，加入500ml旋蒸瓶中进行旋转蒸发浓缩，至乙酸乙酯完全蒸干，然后加入丙酮溶解残留浸膏，使其浓度为1mg/ml、5mg/ml、 10mg/ml、15mg/ml，分别测试粗提物的抑菌活性。对照溶剂为丙酮。图3为根据本申请的一个实施例，采用乙酸乙酯萃取法制备耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵 96h的发酵液粗提物，检测其对稻瘟菌的生长的抑制效果。如图3所示的实验结果，不同浓度的粗提物均对稻瘟病菌有不同程度的抑制作用。

(2)硫酸铵沉淀法制备粗提物

首先，确定最佳硫酸铵浓度。获得耐硼赖氨酸芽孢杆菌在96h最佳发酵条件下的大量发酵液，收集发酵液，4℃、8000rpm离心10min去除菌体。取上清液各200ml，分别缓慢加入硫酸铵至饱和度为10％、20％、30％、40％、50％、 60％、70％或80％，4℃过夜沉淀，8000rpm离心10min收集沉淀，沉淀用PBS (pH7.0)溶解并定容至相同体积，测定其抑菌活性，每个处理重复3次，活性最强的组分的硫酸铵饱和度即为制备抗菌粗提物所需的硫酸铵最适饱和度。

接着，采用硫酸铵沉淀法制备粗提物。取400ml耐硼赖氨酸芽孢杆菌在 96h最佳发酵条件下的发酵上清液，边搅拌边向上清液中加入硫酸铵，使其饱和度达到50％、60％、70％或80％，4℃过夜沉淀。8000rpm离心10min收集沉淀，沉淀用PBS(pH7.0)溶解并定容至10ml，测定其抑菌活性，对照溶剂为PBS(pH7.0)。图4为根据本申请的一个实施例，采用硫酸铵沉淀法制备耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵96h的发酵液粗提物，检测其对稻瘟菌的生长的抑制效果。如图4所示可知，不同硫酸铵饱和度沉淀实验中，硫酸铵饱和度为80％的发酵液粗提物对稻瘟菌的生长的抑制效果最为明显。

根据本申请的一个实施例，可以通过将生防细菌的无菌发酵滤液或其粗提物(例如本申请的耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)发酵滤液或其粗提物)与介质混合，以抑制致病菌生长，进而预防植物感染致病菌或者治疗已感染致病菌的植物。根据本申请的一个实施例，介质为任何可以携带致病菌的载体，例如介质可以包括水稻的种子、植物本身(即水稻生长的各个时期的苗)，也可以包括水稻生长的土壤、水环境，甚至培养植物的培养基等中的一者或者多者。根据本申请的一个实施例，致病菌可以是稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzea)。当然，不应当限定致病菌的种类，本申请的耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)可以一定程度上抑制其生长的细菌、真菌等都应视为本申请所说的致病菌。

根据本实施例及图3和图4显示的实验结果可知，耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)发酵滤液中多种成分均对稻瘟病菌 (Magnaportheoryzea)具有不同程度的抑制作用。所以，可以将耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)作为底盘微生物底盘细胞，用于大量生产具有抑菌活性的发酵滤液，从而满足农业及生产生活上对杀菌剂的需求。根据本申请的一个实施例，还可以将耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)为基础进一步改进，将其改进为可以大量生产某一种或者多种具有特定抑菌活性的蛋白或者其他物质的改造模块，进而增强其制备的抑制稻瘟病菌(Magnaporthe oryzea)生长的杀菌剂的功能，提高其制备抑制稻瘟病菌(Magnaporthe oryzea)生长的杀菌剂的效率。

根据本申请的一个实施例，还可以将耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)制作成杀菌剂，用以抑制稻瘟病菌(Magnaporthe oryzea)等致病菌的生长。根据本申请的一个实施例，杀菌剂包括耐硼赖氨酸芽孢杆菌 (Lysinibacillusboronitolerans)发酵滤液或其粗提物以及辅料。根据本申请的一个实施例，杀菌剂包括以耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans) 为基础的细胞改造模块制备的发酵液以及辅料。根据本申请的一个实施例，杀菌剂中耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)发酵液的发酵时长为96h，粗提物为采用乙酸乙酯萃取法和硫酸铵沉淀法获得的提取物。根据本申请的一个实施例，改造模块为可以大量生产某一种或者多种具有特定抑菌活性的蛋白或者其他物质的改造模块。根据本申请的一个实施例，辅料为水、液体培养基、固体培养基、甘油中的一种或者多种。根据本申请的一个实施例，根据可以杀菌剂的贮藏条件调节甘油的比例，例如甘油的体积比可以为10％、 25％、50％、75％等。

根据本申请的一个实施例，还可以将本申请的耐硼赖氨酸芽孢杆菌与其他具有生物防治功能的细菌、真菌混合，制成对多种致病菌具有良好抑制作用的制剂。

根据本申请的一个实施例，预防或者治疗致病菌感染植物的方法，包括将前文所述的含有耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)发酵液或其粗提物的杀菌剂，将其与介质混合，进而抑制介质表面致病菌的生长。根据本申请的一个实施例，也可以直接将耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)培养并调配至所需浓度后，将其与介质混合。根据本申请的一个实施例，介质为任何可以携带致病菌的载体，例如介质可以包括水稻的种子、植物本身(即水稻生长的各个时期的苗)，也可以包括水稻生长的土壤、水环境，甚至培养植物的培养基等中的一者或者多者。根据本申请的一个实施例，致病菌可以是稻瘟病菌(Magnaporthe oryzea)。当然，不应当限定致病菌的种类，本申请的耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)，以及与其混合的其他生防菌可以一定程度上抑制其生长的细菌、真菌等都应视为本申请所说的致病菌。

稻瘟病是水稻的重要病害，给农业生产造成了严重的经济损失。由于大量使用化学农药给环境和食品也带来了巨大的威胁。耐硼赖氨酸芽孢杆菌 (Lysinibacillusboronitolerans)不仅可以很大程度上降低稻瘟病的发生，而且于生态环境无任何威胁。进一步地，如可以通过对生防菌代谢物合成元件、装置的基础上，组装途径、合成模块，并模块或系统进行的理性修饰，从而产生更强效抑菌活性；或通过揭示基因线路和调控网络，合理设计或优化逻辑基因线路和功能基因线路，使之成为最小细胞工厂从而产生强效抑菌活性，则可以为稻瘟病的防治带来新的方向。

上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此，所有等同的技术方案也应属于本发明公开的范畴。

Claims (12)

1.一种耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)，于2019年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO.M 2019773。

2.如权利要求1所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌发酵液在抑制稻瘟病菌(Magnaportheoryzea)生长方面的应用。

3.一种杀菌剂，包括：如权利要求1所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵液以及辅料。

4.根据权利要求3所述的杀菌剂，所述辅料为水、液体培养基、固体培养基、甘油中的一种或者多种。

5.根据权利要求3所述的杀菌剂，其中所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌的发酵液为如权利要求1所述的硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)经24-96小时培养，OD₆₀₀为4.8-2.5时的发酵液。

6.如权利要求1所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌在制备抑制稻瘟病菌(Magnaportheoryzea)生长的杀菌剂中的应用。

7.如权利要求1所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞在制备抑制稻瘟病杀菌剂中的应用。

8.一种如权利要求1所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌作为底盘细胞为基础的改造模块。

9.如权利要求8所述的改造模块在制备抑制稻瘟病菌(Magnaporthe oryzea)生长的杀菌剂中的应用。

10.一种用于防治稻瘟病的方法，包括：

获取如权利要求3所述的杀菌剂；以及

将所述杀菌剂与介质混合。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述介质为携带稻瘟病菌(Magnaportheoryzea)的载体。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述载体为种子、植物、植物生长的土壤、培养植物的培养基中的一者或多者。

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