CN113416670B - 一株具有抑菌能力的耐硼赖氨酸芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株具有抑菌能力的耐硼赖氨酸芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有抑菌能力的耐硼赖氨酸芽孢杆菌及其应用。一株具有良好抑菌能力的耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS‑2018，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CGMCC No.21392，保藏日期为2020年12月17日。本发明所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS‑2018在制备抑制大肠杆菌的制剂中的应用，优选在制备抑制耐药大肠杆菌的制剂中的应用。LBS‑2018对革兰氏阴性菌(大肠杆菌为典型代表)，尤其对耐药菌株具有显著的抑菌效果，生长速度快于枯草芽孢杆菌，通过竞争方式抑制耐药菌。相比其他耐硼赖氨酸芽孢杆菌菌株具有更强抑制大肠杆菌黏附细胞的作用，抑制率61％‑81％。

Description

一株具有抑菌能力的耐硼赖氨酸芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株具有抑菌能力的耐硼赖氨酸芽孢杆菌及其应用。
背景技术
抗生素耐药性已经成为全球公共卫生的一大威胁，导致多重耐药细菌的快速产生和广泛传播，对人类健康和动物疾病防治构成巨大威胁。为保障人类健康和畜牧业的持续发展，新型抗生素或抗生素替代产品的发掘和研发迫在眉睫。新型抗生素的研发投入大和周期长，远远赶不上耐药菌增长的速度，抗生素替代品的研发成为刚需。
芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，有氧和无氧条件下均能存活，繁殖速度快、抗逆性强、耐强酸、耐强碱，容易在动物肠道中存活。目前，在畜禽养殖中，常用枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，但随着这些菌株的大量使用，临床使用效果不佳，亟待发现和鉴定新菌株以更新迭代，满足临床不同的需求。
耐硼赖氨酸芽孢杆菌是一类重要的芽孢杆菌，在环境治理领域得到较为广泛的使用，可以降解土壤中砷浓度、通过改变细胞壁支链脂肪酸结构促进碳酸钙沉积、与黑水虻合用快速无害化处理畜禽粪便，而在畜禽养殖和疾病防控中未被开发和使用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株具有抑菌能力的耐硼赖氨酸芽孢杆菌。
本发明的另一目的是提供该菌制备的菌剂。
本发明的又一目的是提供该菌或菌剂的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一株具有良好抑菌能力的耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusboronitolerans)LBS-2018，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.21392，保藏日期为2020年12月17日。
本发明所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)LBS-2018在制备抑制大肠杆菌的制剂中的应用，优选在制备抑制耐药大肠杆菌的制剂中的应用。
由本发明所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)LBS-2018制备的菌剂。
作为本发明的一种优选，所述的菌剂由LB培养基在32-35℃培养所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)LBS-2018所得。
本发明所述的菌剂在制备抑制大肠杆菌的制剂中的应用，优选在制备抑制耐药大肠杆菌的制剂中的应用。
本发明所述的菌剂在制备畜禽用抑菌益生产品中的应用。
作为本发明的一种优选，所述的菌剂在制备畜禽用抑制大肠杆菌生长和黏附细胞的益生产品中的应用。
有益效果：
本发明从大葱中筛选并鉴定了一株耐硼赖氨酸芽孢杆菌，对革兰氏阴性菌(大肠杆菌为典型代表)，尤其对耐药菌株具有显著的抑菌效果，生长速度快于枯草芽孢杆菌，通过竞争方式抑制耐药菌。相比其他耐硼赖氨酸芽孢杆菌菌株具有更强抑制大肠杆菌黏附细胞的作用，抑制率61％-81％。
大肠杆菌是动物体内和环境中分布最为广泛、数量最多的微生物，并且它极易产生耐药性，严重危害人类健康和影响畜禽养殖业有序发展。利用本发明耐硼赖氨酸芽孢杆菌开发耐硼赖氨酸芽孢杆菌为畜禽用抑菌益生产品，靶向以大肠杆菌为典型代表的耐药菌和病原菌、生产成本低、安全性高，应用前景良好。
附图说明
图1：菌株LBS-2018显微镜(1000X)观察
图2：菌株LBS-2018的平板正面菌落形态
图3：菌株LBS-2018的16rDNA的分子进化树
图4：菌株LBS-2018的溶血能力观察
图5：菌株LBS-2018的抑菌观察(双层琼脂平板法)
图6：菌株LBS-2018抑菌观察(猪小肠上皮细胞IPEC-J2粘附试验)
A：竞争试验；B：排斥试验；C：置换试验
生物材料保藏信息
耐硼赖氨酸芽胞杆菌LBS-2018，分类命名为耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)，保藏编号为CGMCC No.21392，于2020年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
本发明实施例中所涉及的培养基种类及用途如下：
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L。
Landy培养基：葡萄糖20.0g/L，FeSO4 0.15mg/L，L-谷氨酸钠5.0g/L，MnSO4 5.0mg/L，MgSO4 0.5g/L，CuSO4 0.16mg/L，KCL 0.5g/L，KH2 PO4 1.0g/L。
实施例1耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS-2018的分离
选自江苏省农业科学院牧草育种试验地的大葱作为筛选样品，以大肠杆菌(Eschericia coli)ATCC25922和临床分离多重耐药大肠杆菌3001为指示菌开展试验。
取1-2g大葱样品，研磨粉碎，加入1mL无菌PBS，水浴80℃条件下处理20min，按2％比例接种LB培养基，37℃，200r/min培养12h。梯度稀释，每个梯度吸取100μL悬液均匀涂布于无菌固体LB平板，于37℃培养箱过夜培养(一般大于12h)。待菌落长出，随机挑选菌纯化。
采用双层琼脂点接种方法，将指示菌菌液浓度调整为1×106CFU/mL，吸取加入100μL到微热的LB琼脂培养基中上下倒置混匀，混匀后立即倒入LB平板上待其凝固。将候选菌株复苏24h后调整浓度为1×106CFU/mL的悬浮液，取2μL点种于平板；然后将平皿放入30℃的恒温箱培养不同时间，测抑菌圈大小，选取抑菌圈最大的菌落作进一步筛选用。LBS-2018为筛选得到的目标菌。
实施例2耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS-2018的鉴定
1.菌株形态观察将LBS-2018三区划线接种于LB平板，37℃培养，次日观察菌落形态，如图1；使用接种环挑取适量菌苔，涂布于滴有一滴蒸馏水的干净玻璃片上，风干固定，再依次使用结晶紫混合液、碘液、95％乙醇和番红液染色，水洗风干后，镜检，如图2。
2.16S rDNA序列分析利用试剂盒提取LBS-2018的DNA，用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(SEQ ID NO.2)，1492R：5′-TACGGTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO.3)进行PCR扩增，PCR反应体系组成：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，引物27F和1492R各1μL，模板DNA 1μL，最后用灭菌双蒸水补充至25μL。反应程序为：93℃5min；93℃30s，58℃30s，72℃2min，共30个循环；最后72℃5min，12℃结束反应。PCR扩增产物经1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳，产物经切胶送南京思普金生物科技有限公司测序分析。耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS-2018的16S rDNA序列如SEQ No.1所示。序列在Genbank上进行Blast比对，选择与比对序列相似度高的菌株。并运用MEGA6.06软件构建系统发育树，如图3。
3.生理生化鉴定参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)，依据形态及生理生化特征对LBS-2018进行鉴定。结果如表1。通过形态观察、16S rDNA序列比对和生理生化鉴定结果表明，本菌株与耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)高度同源，确定并命名为耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS-2018。
表1菌株LBS-2018生理生化特性–酶活、碳源氧化
Figure BDA0003110889260000041
Figure BDA0003110889260000051
+：阳性反应；-：阴性反应；W:弱阳性反应
4.耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS-2018的最佳培养温度
将活化的LBS-2018菌种，按2％接种量接种到新的LB培养液中，分别置于27℃、32℃、37℃、42℃的摇床中，200rpm振荡培养24h，OD600检测培养物吸光值，进行培养温度的优化。本发明提供的LBS-2018在27-42℃之间均生长良好，并且32℃时，其培养物的吸光值最高，故选择32℃作为最佳培养温度。
5.耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS-2018的低pH耐受性
将菌株LBS-2018活化后，调整浓度为1×108CFU/mL，按2％的接种量分别接种到pH为2.0、3.0、4.0、5.0的LB培养基，32℃、200r/min震荡培养，1h后取菌液进行涂平板计数，计算存活率。本发明提供的LBS-2018菌在pH3.0条件下存活率接近72％、在pH2.0条件下存活率接近10％，如表2，表明它具有良好的低pH耐受性。
表2菌株LBS-2018在不同pH值的菌落计数
Figure BDA0003110889260000052
实施例3 LBS-2018菌剂制备
将LBS-2018从低温保存冰箱取出，接种环刮取适量培养物，三区划线接种LB琼脂平板，于37℃恒温培养箱倒置培养12h-20h。次日取出，蘸取单菌落转接LB培养液，37℃培养12-20h后，作为活化LBS-2018菌种。活化菌种以1-2％比例接种新的LB培养液，于最佳培养温度32℃，200rpm振荡培养20-24h，用于后续试验。
实施例4耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS-2018的溶血活性检测
实验中使用菌株包括：2株测试菌株：耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS-2018、枯草芽孢杆菌1277。
将活化的2株测试菌，分别接种于在绵羊血平板上划线，32℃培养24h，观察平板上是否有溶血圈。耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS-2018无溶血圈，即表明LBS-2018没有溶血活性，而枯草芽孢杆菌1277可形成明显的溶血圈。结果如图4。
实施例5耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS-2018抑菌细菌生长的观察
实验中使用菌株包括：
2株指示菌：大肠杆菌ATCC25922；临床分离多重耐药大肠杆菌3001
2株测试菌株：耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS-2018、枯草芽孢杆菌1277。
1种抗生素：美罗培南，储液浓度为100μg/mL
分别将活化后的2株指示菌接种新鲜无菌LB液体培养基中，32℃，200r/min培养12h，使用磷酸盐缓冲液(PBS)将其浓度调整为1×108CFU/mL，待用。
采用双层琼脂点平板打孔方法：吸取100μL上述指示菌加到微热的LB琼脂培养基中上下倒置混匀，混匀后立即倒入LB平板上待其凝固。将2株待测菌浓度调整为1×106CFU/mL的悬液，取40μL加入双层平板孔中，同时设置抗生素美罗培南(100μg/mL)为阳性对照、PBS为阴性对照，然后将所有平皿放入32℃的恒温箱培养20h，测抑菌圈直径(含孔直径)大小。如图5所示。综合两种指示菌抑菌结果，本发明的LBS-2018的抑菌效果最强，枯草芽孢杆菌1227效果最差。
实施例6耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS-2018抑制细菌粘附的观察
实验中使用菌株/细胞包括：
1株指示菌：临床分离多重耐药大肠杆菌3001，悬于无血清细胞培养基中，待用。
1测试菌株：耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS-2018，悬于无血清细胞培养基中，待用。
1种传代细胞：猪小肠上皮细胞(IPEC)，细胞密度长成80％，无菌PBS漂后，待用。
(1)竞争试验将100μL待测菌悬液(2×109CFU/孔)与100μL指示菌悬液(2×108CFU/孔)一起加入到含有单层IPEC细胞板中，37℃、5％CO2培养箱孵育1h。同时做细菌和细胞单独的对照。所有试验孔均做3个平行重复。孵育后，然后弃去所有细菌悬液，无菌PBS漂洗3次，洗去未黏附细菌，向细胞板中加入胰酶200μL，37℃、5％CO2条件下孵育5-10min，使细胞从细胞板上脱落，再加入800μL无菌PBS，吹打数次，收集细胞悬液于无菌1.5mL离心管中，10倍比稀释，涂布麦康凯琼脂培养板，计数菌数。结果如图6A。耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS-2018明显降低大肠杆菌3001黏附能力，降低比率为75.7％(P<0.01)。
(2)排斥试验将100μL待测悬液(2×109CFU/孔)加至含有IPEC细胞板中，37℃、5％CO2培养箱培养1h，无菌PBS洗3次，将未黏附待测菌除去，再加入100μL指示菌(2×108CFU/孔)，继续在37℃、5％CO2培养箱培养1h。同时做细菌和细胞单独的对照。所有试验孔均做3个平行重复。孵育后，所有处理同(1)中，平板计数菌数。结果如图6B。
首先接种耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS-2018后，大肠杆菌3001黏附能力显著降低(p<0.01)，降低比率为81.0％。
(3)置换试验将100μL指示菌(2×108CFU/孔)加至含有IPEC细胞板上，37℃、5％CO2培养箱培养1h，无菌PBS洗3次，除去未黏附细菌，再加入100μL待测菌(2×109CFU/孔)，继续在37℃、5％CO2培养箱培养1h。同时做细菌和细胞单独的对照。所有试验孔均做3个平行重复。孵育后，所有处理同(1)中，平板计数菌数。结果如图6C。首先接种大肠杆菌3001再接种耐硼赖氨酸芽孢杆菌LBS-2018，大肠杆菌3001黏附能力同样显著降低(p<0.01)，降低比率为61.2％。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一株具有抑菌能力的耐硼赖氨酸芽孢杆菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1447
<212> DNA
<213> 耐硼赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus boronitolerans)
<400> 1
tgcctactac atgcaagtcc gagcgaacag aaaaggagct tgctcccttt gacgttagcg 60
gcggacgggt gagtaacacg tgggcaacct accctatagt ttgggataac tccgggaaac 120
cggggctaat accgaataat ctcttttgct tcatggtaaa agactgaaag acggtttcgg 180
ctgtcgctat aggatgggcc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa 240
ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc 300
cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa tgggcgaaag cctgatggag 360
caacgccgcg tgagtgaaga aggttttcgg atcgtaaaac tctgttgtaa gggaagaaca 420
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gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa 540
gcgcgcgcag gcggtccttt aagtctgatg tgaaagccca cggctcaacc gtggagggtc 600
attggaaact gggggacttg agtgcagaag aggaaagtgg aattccaagt gtagcggtga 660
aatgcgtaga gatttggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctttctggtc tgtaactgac 720
gctgaggcgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 780
aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct aacgcattaa 840
gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga cgggggcccg 900
cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg 960
acatcccgtt gaccactgta gagatatagt ttccccttcg ggggcaacgg tgacaggtgg 1020
tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080
cccttgatct tagttgccat catttagttg ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac 1140
cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1200
gctacaatgg acgatacaaa cggttgccaa ctcgcgagag ggagctaatc cgataaagtc 1260
gttctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agccggaatc gctagtaatc 1320
gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380
acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga ggtaaccttt tggagccagc cgccgaagat 1440
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacggtacct tgttacgact t 21

Claims (6)

1.一株具有抑菌能力的耐硼赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus boronitolerans）LBS-2018，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21392，保藏日期为2020年12月17日。
2.权利要求1所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus boronitolerans）LBS-2018在制备抑制大肠杆菌的制剂中的应用。
3.权利要求1所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus boronitolerans）LBS-2018在制备抑制耐药大肠杆菌的制剂中的应用。
4.由权利要求1所述的耐硼赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus boronitolerans）LBS-2018制备的菌剂。
5.权利要求4所述的菌剂在制备抑制大肠杆菌的制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的菌剂在制备抑制耐药大肠杆菌的制剂中的应用。
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