CN112063566B - 一株屎肠球菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株屎肠球菌及其应用，本发明提供的屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01，其保藏编号为CGMCC NO.18925为革兰氏染色阳性菌，其对革兰氏阴性菌、阳性菌均具有抑菌能力，并能有效黏附于动物肠道上，将屎肠球菌AH01制成菌剂后用于饲喂动物效果安全可靠。

Description

一株屎肠球菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物学领域，具体地说，涉及一株具有抑菌能力，黏附能力的屎肠球菌(Enterococcus faecium)及其应用。
背景技术
乳酸菌是一类在人和动物中广泛存在且具有较大益生作用的革兰氏阳性细菌的总称，是益生菌中最具代表性的菌属。屎肠球菌是乳酸菌中的一种，具有耐酸、耐热等特点。屎肠球菌进入动物肠道后，主要通过以下三个途径对宿主产生作用：(1)黏附肠道黏膜，通过排阻效应抑制病原菌在肠道的黏附，从而保护肠道屏障，维持肠道微生态平衡；(2)代谢产物，通过乳酸、过氧化氢等代谢产物的产生，降低肠道pH，抑制病原菌繁殖；(3)诱导机体产生细胞因子、干扰素、白介素等，增强机体非特异性免疫、提高抗病能力，促进肠道健康。
益生菌具有改善肠道健康的益生性能，在养殖业中应用已经日渐广泛，可作为抗生素促生长的潜在替代物，益生菌饲喂后，通过胃肠到达作用部位的活菌数量直接影响其益生效果，而由宿主肝脏分泌、促进脂肪代谢的胆盐是细菌在胃肠道中必须面临的抑菌物质之一，因此胆盐耐受是益生菌在肠道中发挥益生作用的基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抑菌能力，黏附能力的屎肠球菌及其应用。
为了实现本发明的目的，本发明的屎肠球菌(Enterococcus faecium)是从中国农业大学肉牛养殖基地的肉牛瘤胃液中筛选并经过紫外光诱变得到，命名为AH01。经16S RNA基因序列分析，该菌株AH01为屎肠球菌(Enterococcus faecium)。该菌株已于2019年11月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为屎肠球菌Enterococcus faecium，保藏号为CGMCC No.18925。
屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01的微生物学特性为：革兰氏阳性菌，细胞形态为球状，直径不超过0.6-0.8μm，无芽胞，无鞭毛；单菌落大小为0.5-1mm，颜色呈灰白色，不透明，菌落表面光滑，边缘规则。菌体分别在pH值2.0、60℃水浴、0.3％胆盐、1.2％胃蛋白酶处理2h后存活率均大于50％。
本发明提供含有该屎肠球菌AH01的菌剂。
本发明还提供一种含有该屎肠球菌AH01的动物饲料添加剂。该饲料添加剂含有的屎肠球菌AH01活菌数为6×108CFU/g～1×109CFU/g。
本发明还提供一种含有该屎肠球菌AH01的动物饲料。其中，所述动物饲料中屎肠球菌AH01的活菌数为1×106CFU/kg～1×109CFU/kg，优选1×107CFU/kg～1×108CFU/kg。
本发明通过体外法鉴定了屎肠球菌AH01的益生效果，结果表明，屎肠球菌AH01能够耐酸、酸胆盐，能抵抗胃肠道的内环境，具备益生菌的潜力。
基于屎肠球菌AH01具有的突出的抑菌特性，含有屎肠球菌AH01的药物，特别是抑菌类药物属于本发明的保护范围。
本发明提供了屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01或其发酵产物在制备抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌药物中的应用。
优选地，所述药物为抑制金黄色葡萄球菌、和/或抑制沙门氏菌的药物。
本发明提供了屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01或其发酵产物在制备益生菌剂、饲料添加剂或食品添加剂中的应用。
在本发明的实施例中，显示了屎肠球菌AH01对金黄色葡萄球菌具有很强的抑制能力，最小半数致死量为1×1011CFU/g。
本发明的有益效果在于，本发明提供了一株具有益生特性的屎肠球菌AH01，该菌对革兰氏阴性菌、阳性菌均具有抑菌能力，对多数常用抗生素均有较好的耐药性，并能有效黏附于动物肠道上，粘附率达78.4％，本发明采用酸碱滴定法检测了屎肠球菌AH01总产酸量可达73g/L，表现出优异的益生性能。将本发明的屎肠球菌AH01制成菌剂后用于饲喂动物效果安全可靠。
附图说明
图1为屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01 CGMCC No.18925的菌落形态图。
图2为屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01 CGMCC No.18925的革兰氏染色图。
图3为屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01 CGMCC No.18925的系统发育树。
图4为屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01 CGMCC No.18925的生长曲线。
图5为屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01 CGMCC No.18925的产酸性检测结果。
图6为实施例6中屎肠球菌AH01的黏附情况示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的培养基如无特殊说明配方如下：MRS培养基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，吐温-801ml，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.25g，琼脂粉15g，用蒸馏水定容至1L，将pH调至6.2-6.4。
实施例1屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01的分离与鉴定
1.菌株的分离培养
取1ml中国农业大学肉牛养殖基地的肉牛瘤胃液装入有9ml生理盐水的试管中，漩涡器震荡混匀，即为1：10稀释液，再取稀释液进行10倍递增稀释，然后选择3个适宜梯度的稀释液各1ml涂布于LB培养基上。37℃培养48-72小时，观察并记录菌落形态，挑取长势良好的单菌落，进行划线分离纯化。
2.菌株的紫外诱变与初筛
将灭菌后的MRS培养基倒入培养皿中，待凝固后取步骤1所得的菌悬液涂布于平板上，每个培养皿控制菌落在50个左右，培养12小时后，距离紫外灯20cm，诱变30s。
挑取诱变后的菌株，接种于pH为2的MRS液体培养基中，培养2小时，测定OD值，选取活菌率大于50％的菌株；取适量的菌悬液至于60℃的MRS培养基中，培养2小时，选取活菌率大于50％的菌株；取适量菌悬液至于含有0.3％胆盐的MRS液体培养基中，培养2小时，选取活菌率大于50％的菌株；取适量菌悬液至于含有1.2％胃蛋白酶的MRS液体培养基中，培养2小时，选取活菌率大于50％的菌株。将菌悬液涂布于MRS固体培养基上，培养48小时，挑取单菌落于MRS液体培养基中培养24小时候，取适量菌悬液于Caco-2细胞共培养，选取黏附率大于10％的菌落进行下一步革兰氏染色。
3.菌株的革兰氏染色
在载玻片上滴一滴经灭菌的蒸馏水，挑取一个初筛后的单菌落(菌落形态图见图1)在水中溶解，经刮片后，在酒精灯上烘干固定。滴加结晶紫染色液，染2min，水洗，自然晾干；滴加碘液媒染2min，水洗，自然晾干；滴加碱性品红乙醇溶液50S，水洗，自然晾干；在普通光学显微镜上观察，若菌体呈紫色为阳性，菌体呈红色为阴性，结果见图2。
通过步骤1-3的分离筛选，最终获得一株革兰氏染色阳性菌。将该菌株编号为AH01。
4、菌株AH01的鉴定
(1)形态学鉴定
对处于对数生长期且菌落大小稳定的菌株AH01进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态及菌落边缘状态。所得单菌落颜色呈乳白色，不透明，菌落表面光滑，边缘规则。
(2)生理生化鉴定
菌株的生理生化特征测定结果见下表1：
表1生理生化检测结果
检测项目 结果 检测项目 结果
七叶苷 + 甘露醇 +
纤维二糖 + 水杨苷 +
麦芽糖 + 山梨醇 -
蔗糖 + 棉子糖 -
菊糖 + 乳糖 +
马尿酸 + 过氧化氢酶 -
运动性 - 45℃ +
甘油 - NV7.0 +
+表示反应呈阳性；-表示反应呈阴性
(3)16S RNA序列同源性分析
细菌总DNA的提取采用天根生化科技有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取。提取后的样品送到上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。将测定结果在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对，确定菌种类别为屎肠球菌(Enterococcus faecium)。测序结果见SEQ ID NO.1。该菌系统发育树见图3。
上述实验结果表明，该菌为屎肠球菌。该菌株已于2019年11月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为屎肠球菌Enterococcus faecium保藏号为CGMCC No.18925。
实施例2屎肠球菌AH01的生长曲线测定
生长曲线代表了细菌在新的适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。将屎肠球菌AH01 CGMCC No.18925按1％(v/v)的接种量，接种到MRS培养基中，37℃培养20小时，以不加菌液的MRS培养基作为空白对照，每隔2小时测定OD600值。实验设三次重复，结果取其平均值，记录数据并绘制生长曲线。如图4所示，在2-14小时，屎肠球菌AH01处于对数生长阶段，繁殖速率较高。在14-16小时屎肠球菌AH01数目趋于稳定。16小时以后进入生长率下降阶段。
实施例3屎肠球菌AH01的抗生素敏感性检测
将适宜浓度的屎肠球菌AH01涂布于MRS培养基上，每个培养皿中均匀的贴附2个药敏纸片，培养30小时，观察抑菌圈大小。
表2抗生素敏感性检测结果
抗生素种类 抑菌圈直径 抗生素种类 抑菌圈直径
氯霉素 15mm 红霉素 -
万古霉素 22mm 米诺环素 26mm
头孢氨苄 26mm 青霉素 11mm
复方新诺明 30mm 多粘菌素B -
氧氟沙星 36mm 四环素 19mm
判断标准为抑菌圈直径大于20mm极敏，15-20mm高敏，10-15mm中敏，这一结果表明，屎肠球菌AH01 CGMCC No.18925对红霉素、多粘菌素B、万古霉素、头孢氨苄、复方新诺明、米诺环素及氧氟沙星等常用的抗生素具有较好的耐药性，因此作为饲用益生菌使用是安全可靠的。
实施例4屎肠球菌AH01的抑菌性检测
采用牛津杯法测定屎肠球菌AH01的抑菌活性，将牛津杯放置于含有不同病原菌的琼脂糖培养基上，取适量的屎肠球菌AH01的菌悬液滴加于牛津杯中，观察抑菌圈的大小。
表3抑菌性检测结果
致病菌菌种 抑菌圈直径
沙门氏菌CUCC1791 18.00mm
金黄色葡萄球菌ATCC4330 14.50mm
大肠杆菌E.coli K88 —
金黄色葡萄球菌CUCC1882 24.00mm
结果显示，屎肠球菌AH01能有效抑制沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的生长。另外还对金黄色葡萄球菌进行了半数致死量试验，试验发现屎肠球菌AH01对金黄色葡萄球菌具有很强的抑制能力，最小半数致死量为1×1011CFU/g。
实施例5屎肠球菌AH01的产酸性检测
由于大多数致病菌更适宜在碱性环境下生长繁殖，而益生菌产酸会导致肠道环境的pH下降，致病菌在酸性环境下生长受到抑制甚至会死亡，所以产酸更有利于抑制致病菌，促进肠道健康。本实施例是考察屎肠球菌AH01是否产酸以及产酸能力。
取1ml屎肠球菌AH01，接种于50ml pH为5.9的MRS液体培养基中，定期检测液体培养基pH，结果如图5所示，屎肠球菌AH01，产酸性能好，使环境pH 5.9在20小时之内降至4.6左右，产总酸量可达73g/L。采用酸碱滴定法检测了总产酸量。具体实验方法如下：
1.将屎肠球菌AH01按1％(v/v)的接种量，接种到MRS培养基中，混合后取出一定的菌液稀释100倍备用，37℃培养20小时，后取出菌液稀释100倍。
2.取未培养20小时之后的稀释后的菌液50ml，加入40ml干净蒸馏水，再加入200μl浓度1％的酚酞指示剂，用浓度为0.1％的NaOH进行滴定至微红色且30s不褪色，记录NaOH消耗的体积V2，另取培养了20小时之后的菌液进行相同处理后记录体积V1。(该步骤重复三次取平均值)
检测指标：计算培养前后的总酸量差值即为屎肠球菌AH01在20小时内的产酸总量，计算结果总产酸量为73g/L。这说明屎肠球菌AH01具有较强的产酸能力，能够使环境中pH下降，从而使致病菌在酸性环境下生长受到抑制甚至死亡，有利于促进肠道健康。
实施例6屎肠球菌AH01 CGMCC No.18925的黏附力验证
通过实验测得屎肠球菌AH01对Caco-2细胞的黏附率在78.4％左右，肠道黏附性较好。Caco-2细胞来源于人结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。Caco-2细胞与人小肠上皮细胞在形态学上相似，具有相同的细胞性和紧密连接，可以用来进行模拟体内常用转运的实验。具体实验方法如下：
1.将Caco-2细胞培养并传代后，加入胰酶消化后，使用血球计数板检测其浓度，并调整至5×105个/ml的浓度；挑单菌落至MRS液体培养基中，于37℃摇床摇菌并进行平板计数测其浓度，最终通过稀释调整其浓度至1×108cfu/ml后备用。
2.调整好浓度的Caco-2细胞放入35mm培养皿中进行培养至贴壁后，待细胞长至单层，无菌PBS进行洗涤一次，后加入1ml菌液(浓度1×108cfu/ml)和1ml细胞培养基的混合液，孵育后PBS洗涤三次，多聚甲醛固定半小时后革兰氏染色，显微镜下观察其黏附情况。
3.把调整好浓度的Caco-2细胞放入35mm培养皿中进行培养至贴壁后，待细胞长至单层，无菌PBS进行洗涤一次，一部分皿加入含200μg/ml庆大霉素的细胞培养基2ml，孵育后无菌PBS洗涤三次。所有皿加入胰酶，待细胞完全脱落后加入一定量培养基，再加入TritonX-100，裂解细胞，最后将混合物进行划板计数。另取长至单层细胞的培养皿进行细胞计数。
检测指标：
(1)拍摄图片：实验步骤1、2进行的显微镜下观察屎肠球菌AH01的黏附情况，拍摄图片如图6。
(2)计算黏附率：上述实验进行5次平行实验，根据实验步骤1、3得出屎肠球菌AH01对Caco-2细胞的黏附率可达78.4％。
实施例7屎肠球菌AH01 CGMCC No.18925制剂的安全性评价
本实施例以小鼠作为实验动物，采用灌胃试验的方法，评价地衣芽孢杆菌的安全性，具体方法如下：
1.将地衣芽孢杆菌菌剂的冻干粉，经平板计数测定，其屎肠球菌AH01的活菌数为6.0×108cfu/g。
2.选取8周龄左右的小鼠72只，随机分为4组(A组为对照组灌服无菌生理盐水，B组为高剂量组按照6.0×108cfu/只的量灌服菌液，C组为中剂量组按照6.0×107cfu/只的量灌服菌液，D组为低剂量组按照6.0×106cfu/只的量灌服菌液)，每组3个重复，每个重复6只鼠。
3.每天下午三点灌胃一次，连续灌服21天。
实验鼠房控制温度湿度恒定，自然光照，小鼠自由采食、饮水，每7天清扫鼠笼一次。实验过程中，每天观察并记录小鼠的状态，存活情况，有无临床异常症状等。
检测指标：
(1)于实验结束当天采用心脏取血的方式，取得实验小鼠血液样品，经静止离心后获得血清，用于检测血清中白蛋白、总蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、胆固醇、尿素、肿瘤细胞坏死因子等血液生化指标。
(2)取完整的心、肝、脾、肾(双侧)称湿重，分别计算心脏指数＝(心脏湿重/体重)×100％、肝脏指数＝(肝脏湿重/体重)×100％、脾脏指数＝(脾脏湿重/体重)×100％、肾脏指数＝(肾脏湿重/体重)×100％。
表4不同处理组小鼠存活情况
A组 B组 C组 D组
7天 存活 存活 存活 存活
14天 存活 存活 存活 存活
21天 存活 存活 存活 存活
从表4可以看出，使用屎肠球菌AH01 CGMCC No.18925给小鼠灌胃21天后，实验各处理组小鼠均存活，说明上述屎肠球菌对动物安全。
表5不同处理组小鼠的脏器系数
A组 B组 C组 D组
心脏 0.62 0.63 0.62 0.64
肝脏 5.66 5.63 5.67 5.58
脾脏 0.42 0.48 0.45 0.42
肾脏 1.33 1.39 1.35 1.36
从表5可以看出，处理组小鼠的脏器指数与对照组相比没有明显变化，说明上述屎肠球菌没有造成小鼠各脏器异常。
利用生化分析仪检测小鼠血清中白蛋白、总蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯、胆固醇、尿素、肿瘤细胞坏死因子等，结果均显示正常，说明本发明提供的屎肠球菌制剂对小鼠的生理指标不构成影响。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 江苏澳华生物科技研究院有限公司
<120> 一株屎肠球菌及其应用
<130> KHP201110023.0
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1161
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actgcgggcg gcgtgctata catgcaagtc gaacgcttct ttttccaccg gagcttgctc 60
caccggaaaa agaggagtgg cgaacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cccatcagaa 120
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cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc 600
ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg ggagacttga gtgcagaaga ggagagtgga 660
attccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat atatggagga acaccagtgg cgaaggcggc 720
tctctggtct gtaactgacg ctgaggctcg aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac 780
cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgttg gagggtttcc gcccttcagt 840
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agaaccttac caggtcttga catcctttga ccctctagag atagagcttc cccttcgggg 1020
gcaaagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgggc gtgaaatgtt gggttaagtc 1080
ccgcaacgag cgcaccctta ttgttattgc ctcattcagt tgggcctcta gcagaatgcc 1140
ggtgaaaacc ggaggaaggg g 1161

Claims (10)

1.屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01，保藏编号为CGMCC NO.18925。
2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01或其发酵产物。
3.一种食品或饲料添加剂，其特征在于，含有权利要求1所述的屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01或其发酵产物。
4.含有权利要求1所述的屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01或其发酵产物的动物饲料。
5.含有权利要求1所述的屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01或其发酵产物的抗菌药物。
6.权利要求1所述的屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01或其发酵产物在制备抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌药物中的应用。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物为抑制金黄色葡萄球菌、和/或抑制沙门氏菌的药物。
8.权利要求1所述的屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01或其发酵产物在制备益生菌剂、饲料添加剂或食品添加剂中的应用。
9.权利要求1所述的屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01或其发酵产物在制备饲料中的应用。
10.权利要求1所述的屎肠球菌(Enterococcus faecium)AH01或其发酵产物在提高饲料转化率、促进动物生长或提高动物体重中的应用。
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