CN114107133A - 一种抗结直肠肿瘤的屎肠球菌及其应用 - Google Patents

一种抗结直肠肿瘤的屎肠球菌及其应用 Download PDF

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bacteria
medicament
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Abstract

本发明提供了一株屎肠球菌，保藏编号为CCTCC NO:M20211220，保存于中国典型培养物保藏中心。本发明提供的屎肠球菌CCTCC NO:M20211220在pH4.0的人工胃液环境中孵育3h仍能保证77.60％的存活率。在小鼠MC38模型中，该屎肠球菌在抑制肿瘤体积方面有显著效果。

Description

一种抗结直肠肿瘤的屎肠球菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株抗结直肠肿瘤的屎肠球菌及其应用。
背景技术
结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，其发病隐匿，死亡率较高。目前对于晚期结直肠癌的治疗，以5FU或卡培他滨加奥沙利铂或者伊立替康方案化疗联合靶向药物例如贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗等为主。尽管化疗联合靶向治疗使晚期结直肠癌患者总的生存率得到了提高，但是对于多线化疗进展后的结直肠癌患者可以使用的药物很少，且化疗引起的胃肠道反应、骨髓抑制、神经毒性等不良反应经常发生。
微生物涉及肠内稳态的调节，人肠微生物组的一些共生和致病生物在结直肠癌发病机理中是必需的。因此，通过使用益生菌操纵肠细菌组成和局部代谢物被证实可以用于结直肠癌治疗干预。益生菌是活的微生物饲养添加剂，有利地影响宿主的健康。
中国专利201910909859.7中公开了一种抑制结直肠癌致病菌的益生菌配方及其筛选方法，益生菌配方为：丁酸梭菌1.3×1010CFU/mL，粪肠球菌1×109CFU/mL，短乳杆菌1×109CFU/mL，植物乳杆菌1×109CFU/mL，鼠李糖乳杆菌1×109CFU/mL，清酒乳杆菌1×109CFU/mL，肠系膜明串珠菌1×109CFU/mL。该发明益生菌配方不会产生耐药性，并且安全、有效，性能优良，但涉及的菌种较多，方案复杂。
中国专利201480080834.6公开了微生物特别是真杆菌菌株在治疗和预防结直肠癌相关的疾病中的应用。涉及了包含真杆菌菌株的组合物。动物实验的结果证明了凸腹真杆菌(Eubacterium ventriosum)和挑剔真杆菌(Eubacteriumeligens)有效预防和治疗结肠炎和结直肠癌的能力。
丰富治疗结直肠癌的微生物种质资源对于结直肠癌的治疗和预后都是十分有利的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明自健康人粪便菌液中分离出一株抗结直肠肿瘤的屎肠球菌，将其应用于结直肠肿瘤的治疗中，以期为结直肠肿瘤的治疗提供一种获得途径更为便捷且效果更好的药物。
一方面，本发明提供了一株屎肠球菌。
所述的屎肠球菌16S rRNA序列为与SEQ ID NO.1具有99.93％以上同一性的序列。
所述的屎肠球菌16S rRNA序列为SEQ ID NO.1，保藏编号为CCTCC NO:M20211220，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年9月26日。
另一方面，本发明提供了屎肠球菌在制备用于诊断、预防和/或治疗肿瘤的产品或药物中的应用。
所述的屎肠球菌为前述的屎肠球菌。
所述的肿瘤包括但不限于：消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、生殖系统肿瘤、运动系统肿瘤、神经系统肿瘤、内分泌系统肿瘤、循环系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、生殖系统肿瘤。
优选地，所述的肿瘤为消化系统肿瘤，所述的消化系统肿瘤为食道肿瘤、胃肿瘤、贲门肿瘤、肠肿瘤、肝肿瘤、胆囊肿瘤中的一种或多种。
进一步优选地，所述的肿瘤为结直肠肿瘤，所述的结直肠肿瘤包括息肉样型、狭窄型和溃疡型中的一种或多种。
再一方面，本发明提供了一种用于前述应用的制剂。
所述的制剂中包括前述的屎肠球菌和/或其制备物。
所述的制备物为屎肠球菌的死菌、细胞破碎物、发酵上清液、发酵沉淀、改造菌、突变菌和/或诱变菌。
所述的屎肠球菌的发酵上清液的制备方法中包括：
S1、接种屎肠球菌CCTCC NO:M20211220；
S2、条件培养；
S3、去除菌体，即得。
所述的屎肠球菌的细胞破碎物的制备方法中包括：
S1、接种屎肠球菌CCTCC NO:M20211220；
S2、条件培养；
S3、菌体细胞破碎。
所述的条件培养包括但不限于：厌氧培养、好氧培养、兼性厌氧培养。
优选地，所述的制剂为液体制剂，所述的液体制剂中包括屎肠球菌的量为5×109CFU/mL。
优选地，所述的制剂为固体制剂或半固体制剂，所述的制剂中包括屎肠球菌的量为5×109CFU/g。
优选地，所述的制剂为冻干粉。
又一方面，本发明提供了一种基因编码产物。
所述的基因编码产物由前述的屎肠球菌的基因组上的基因编码，且能够诊断、预防和/或治疗结直肠肿瘤。
又一方面，本发明提供了前述的屎肠球菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、接种前述的屎肠球菌；
S2、条件培养。
所述的条件培养包括但不限于：厌氧培养、好氧培养、兼性厌氧培养。
又一方面，本发明提供了前述的制剂在制备诊断、预防和/或治疗结直肠肿瘤的产品或药物中的应用。
又一方面，本发明提供了一种用于前述应用的药物。
所述的药物中包括前述的屎肠球菌或其制备物。
或者，所述的药物中包括前述的制剂。
所述的药物中包括屎肠球菌的量为5×109CFU/mL。
所述的药物中还包括5FU、卡培他滨、奥沙利铂、伊立替康、贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗中的一种或多种。
所述的药物中还包括其他药学上可接受的载体或赋形剂。
优选地，所述的药物为口服药物。
本发明的有益效果：
本发明提供的屎肠球菌CCTCC NO:M 20211220在pH4.0的人工胃液环境中孵育3h仍能保证77.60％的存活率。在小鼠MC38模型中，该屎肠球菌在抑制肿瘤体积方面有显著效果。
保藏说明
保藏地址：中国，武汉，武汉大学；
保藏日期：2021年09月26日；
菌种名称：屎肠球菌PRS-15；
拉丁名：Enterococcus Faecium PRS-15；
保藏机构：中国典型培养物保藏中心；
保藏机构简称：CCTCC；
保藏中心登记入册编号：CCTCC NO:M 20211220。
附图说明
图1为给药后MC38小鼠模型的肿瘤大小变化曲线。
图2为给药后MC38小鼠模型的体重变化曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一株抗结直肠肿瘤的屎肠球菌的分离
在无菌条件下，制备好的健康人粪便菌液进行10倍梯度稀释，选取三个浓度梯度，划线接种于NA及MRS培养基上，三个重复平板，置37℃恒温培养箱中厌氧培养72h，随后挑取不同形态的菌落进行革兰氏染色镜检，并于MRS培养基中进行2次划线纯化，再染色镜检，观察细菌形态及是否纯化，再进行16srRNA测序，使用的引物序列为：
27F：SEQ ID NO.2；
1429R：SEQ ID NO.3。
PCR反应体系如下：
Figure BDA0003426826530000041
Figure BDA0003426826530000051
PCR反应条件如下：
Figure BDA0003426826530000052
扩增得到的PCR产物进行16srRNA测序后在NCBI进行比对。
测序结果如SEQ ID NO.1所示。
实施例2耐药性检测
采用药敏纸片扩散法进行，将MRS液体培养基(购自青岛海博生物科技有限公司，货号：HB0384-1)培养好的菌液，进行4000rpm离心15min，去掉上清液，用PBS进行悬浮，吹打均匀，将OD值调整为0.6左右，均匀涂布于含有MRS固体培养基的培养皿中，待菌液完全吸收后，放置药敏纸片(含有抗菌药物或抗生素)，一块平板放置一种药敏纸片(3片)和空白对照(1片)，倒置培养于37℃培养箱，24h用直尺测量抑菌环直径，记录数据，根据纸片法抗菌药物试验标准(WS/T125—1999)判读结果。结果如下：
Figure BDA0003426826530000053
Figure BDA0003426826530000061
备注：S＝敏感，I＝中介，R＝耐药，/为无抑菌圈，—为剔除抑菌圈。
Figure BDA0003426826530000062
备注：S＝敏感，I＝中介，R＝耐药，/为无抑菌圈，—为剔除抑菌圈。
本株菌主要对喹诺酮类、硝基呋喃类抗菌药、多粘菌素B、林克霉素类、复方新诺明和庆大霉素耐药；对于青霉素类、氯霉素类、大环内脂类、四环素类、头孢菌素类和糖肽类抗生素表现为敏感。
实施例3耐人工胃肠液检测
(1)MTT溶液配制：称0.5gMTT(购自北京索莱宝，货号：M8180-250)，加入100mL PBS溶解(终浓度为5mg/mL)，过滤除菌，分装于15mL离心管中，-20℃冻存备用，有效期半年。
(2)模拟胃液(Simulated Gastric Fluid，SGF)实验
1、取2.0g NaCl和3.2g胃蛋白酶(索莱宝胃蛋白酶，1:3000，标识为每mg中含800-2500个活度单位)，加7.0mL 37％稀盐酸和水使溶解至1000mL，溶液pH值为1.2。
2、调pH分别至1.2(模拟人空腹肠液pH)、2.0、3.0(模拟人饭后肠液pH及小鼠空腹肠液pH)和4.0，过滤除菌；
3、集菌：菌株于37℃静止培养8h，达到对数生长期，将菌液分装于50mL无菌EP管，4000rpm室温离心15min后，弃上清，用PBS重悬菌体，并调取菌液OD600值，得到细菌数约为2×109CFU/mL，随后取17个15mL无菌EP管，分别加入调好OD值的6mL菌液，进行离心(条件同上)，16个离心管(实验组)去除PBS，收集菌沉淀待用，1个吹打重悬(对照组)；
4、人工胃液培养：将上述不同pH的人工胃液分别加入6mL至洗涤后收集的菌沉淀16个15mL离心管中，并吹打混匀，分别孵育培养1h、2h和3h；
5、MTT检测：先对照组菌液、孵育不同pH不同时间的菌液分别取3mL于新的离心管中，并分别加入1mL MTT试剂进行孵育过夜(这一步可将菌液通过3500rpm，8min离心，去掉上清液人工胃液，再加入MTT试剂，MTT试剂可降低至500ul，且孵育时间也可缩短)，孵育过后，再进行离心处理(3500rpm，8min)，去掉上清液，加入600μL DMSO(国药分析纯98.5％)，吹打溶解后，分别加入深孔板中，而后用排枪转移至96孔无菌培养板中，每孔加入150μL(并标记清楚每孔加样顺序和名称)，然后用酶标仪进行检测，选取波长570nm或630nm获取吸光值，推算出活细菌的比例；
6、进行数据处理，计算对应的存活率，其中细菌存活率＝实验组OD值/对照组OD值×100％，得到菌株模拟人工胃液作用不同时间后的耐受程度。
(3)模拟肠液(SIF)-SimulatedIntestinalFluid(SIF)实验
1、取磷酸二氢钾6.8g，加水500mL使溶解，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶1g(索莱宝胰蛋白酶，1:250)，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至1000mL，过滤除菌；
2、集菌方法同上模拟胃液(SimulatedGastricFluid，SGF)实验；
3、人工肠液培养：将上述pH6.8的人工肠液分别加入8mL至洗涤后收集的菌沉淀4个15mL离心管中，并吹打混匀，孵育培养0h、1h、2h和3h；
4、MTT检测：同上模拟胃液(SimulatedGastricFluid，SGF)实验；
5、进行数据处理，计算对应的存活率，其中细菌存活率＝实验组OD值/对照组OD值×100％，得到菌株模拟人工肠液作用不同时间后的耐受程度。
(4)模拟人体内胆盐环境实验
1、胆汁配制：在目标菌培养基(MRS或BHI)溶液中加入牛胆粉，设置三个终浓度，分别为10g/L(1％牛胆粉)、20g/L(2％牛胆粉)和40g/L(4％牛胆粉)，高压灭菌后备用，同时，以不加胆粉的培养基溶液0h作为对照。本实施例中选用MRS培养基。
2、菌株收集同上。
3、牛胆粉培养：将配置含有0％、1％、2％和4％牛胆粉(购自合肥巴斯夫生物科技有限公司，货号：N0101-100g)的MRS或BHI培养基分别加入10mL至洗涤后收集的菌沉淀20个15mL离心管中进行孵育培养0h、1h、2h、3h和4h，以0％牛胆粉培养基溶液0h作为对照组，本实施例选用MRS培养基。
4、倾注培养：同上模拟胃液(SimulatedGastricFluid，SGF)实验。
5、计算细菌耐受胃酸情况：进行平板计数，记录各平板菌落数，进行数据处理，得到菌株对牛胆盐的耐受程度。
结果如下：
Figure BDA0003426826530000081
Figure BDA0003426826530000091
Figure BDA0003426826530000101
Figure BDA0003426826530000102
Figure BDA0003426826530000111
Figure BDA0003426826530000112
结果表明，屎肠球菌CCTCC NO:M20211220：在pH值较低的胃液环境中仍能保持较好的存活率；在pH4.0的人工胃液环境中孵育3h仍能保证77.60％的存活率；在1％-4％牛胆粉培养基中可正常生长，且随着孵育培养的时间增加，其活菌数也在增加，说明该菌株对牛胆盐具备一定的耐受程度，且可正常生长繁殖。
实施例4小鼠模型实验
本实施例中选用的小鼠为雌性C57BL/6或小鼠，周龄6-7周(肿瘤细胞接种时的小鼠预计周龄)，接种细胞时小鼠体重范围为18-22g，购自君科生物技术有限公司。
小鼠MC38模型用于药效验证，模型构建方法如下：
MC38细胞(上海富衡生物科技有限公司，货号为FH-0125)培养在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中。收集指数生长期的MC38细胞，PBS重悬至1×107个/mL用于小鼠皮下肿瘤接种。将0.1mL MC38细胞接种于实验小鼠的右侧背部皮下，定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均体积96mm3时，根据肿瘤大小和小鼠体重随机分组给药，肿瘤接种记为第0天。
给药开始前，称量动物体重并测量肿瘤体积。
实验分组如下：
Figure BDA0003426826530000121
屎肠球菌活体菌的配制方式为：PBS+0.25％甘油悬浮的屎肠球菌。
肿瘤接种第9天开始给药，并于给药后第6、8、10、12、14、16、19、21、24、27天测量小鼠的体重(g)和肿瘤的大小(mm3)。肿瘤大小计算公式：肿瘤体积(mm3)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径2)。
结果如图1-2所示，结果表明：在小鼠MC38模型中，该屎肠球菌在抑制肿瘤体积方面有显著效果。
序列表
<110> 苏州普瑞森生物科技有限公司
<120> 一株抗结直肠肿瘤的屎肠球菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (10)

1.一种屎肠球菌，其特征在于，其16S rRNA序列为与SEQ ID NO.1具有99.93％以上同一性的序列。
2.根据权利要求1所述的屎肠球菌，其特征在于，其16S rRNA序列为SEQ ID NO.1，其保藏编号为CCTCC NO:M20211220，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年9月26日。
3.屎肠球菌在制备用于诊断、预防和/或治疗肿瘤的产品或药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的屎肠球菌为权利要求1或2所述的屎肠球菌。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤、生殖系统肿瘤、运动系统肿瘤、神经系统肿瘤、内分泌系统肿瘤、循环系统肿瘤、泌尿系统肿瘤、生殖系统肿瘤中的一种或多种；优选地，所述的肿瘤为消化系统肿瘤；更优选地，所述的消化系统肿瘤为食道肿瘤、胃肿瘤、贲门肿瘤、肠肿瘤、肝肿瘤、胆囊肿瘤中的一种或多种；更优选地，所述的肿瘤为结直肠肿瘤，所述的结直肠肿瘤包括息肉样型、狭窄型和溃疡型中的一种或多种。
6.一种用于权利要求3-5任一项所述应用的制剂，其特征在于，所述的制剂中包括权利要求1或2所述的屎肠球菌和/或其制备物；所述的制备物为屎肠球菌的死菌、细胞破碎物、发酵上清液、发酵沉淀、改造菌、突变菌和/或诱变菌。
7.一种基因编码产物，其特征在于，所述的基因编码产物由权利要求1或权利要求2所述的屎肠球菌的基因组上的基因编码。
8.权利要求1或2所述的屎肠球菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、接种权利要求1或2所述的屎肠球菌；
S2、条件培养。
9.一种用于权利要求3-5任一项所述应用的药物，其特征在于，所述的药物中包括权利要求1或2所述的屎肠球菌和/或其制备物；或者，所述的药物中包括权利要求6所述的制剂。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述的药物中还包括5FU、卡培他滨、奥沙利铂、伊立替康、贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗中的一种或多种。
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