CN114717150B

CN114717150B - 一种植物乳杆菌crs33及其应用

Info

Publication number: CN114717150B
Application number: CN202210420568.3A
Authority: CN
Inventors: 刘明超; 孙艳; 冯晓微; 刘佳玮; 冯鸣鹊; 靳天雄; 刘蓓; 姜国均
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2022-04-20
Filing date: 2022-04-20
Publication date: 2023-01-17
Anticipated expiration: 2042-04-20
Also published as: CN114717150A

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体公开一种植物乳杆菌CRS 33。所述植物乳杆菌CRS 33的菌种保藏编号为CGMCC No.24454。本发明提供的植物乳杆菌CRS 33对奶牛子宫内膜炎的病原菌大肠杆菌具有较强的抑制作用，可产生大量的过氧化氢、抑菌肽、抑菌蛋白有机酸等抑菌物质，改善生殖道内的微生态环境，且其对多种抗生素具有耐药性，可与抗生素联合使用来有效预防和治疗奶牛子宫内膜炎。

Description

一种植物乳杆菌CRS33及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种植物乳杆菌CRS 33及其应用。

背景技术

奶牛子宫内膜炎是常发的奶牛产后疾病，根据临床表现可分为临床型子宫内膜炎和亚临床型子宫内膜炎。病原微生物感染是引发奶牛子宫内膜炎的主要原因，主要病原微生物为大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)和化脓隐秘杆菌 (Trueperella pyogenes，T.pyogenes)。该病会延长奶牛的产犊间隔，降低患病牛的生育率，是危害奶牛养殖业的主要疾病之一，给养牛业造成了非常大的经济损失。

目前，对于奶牛子宫内膜炎的治疗方法主要是使用抗生素进行治疗，但长期对抗生素类兽药的不当使用，造成了严重的交叉耐药，甚至影响到奶制品的消费群体的身体健康。乳酸菌是一类非病原性、革兰氏阳性的功能性微生物。很多研究表明乳酸菌是健康奶牛生殖道内的常驻菌群，长期使用含乳酸菌的食品可以改善机体阴道中的菌群，且向围产期奶牛阴道内灌注乳酸菌，能够显著提高机体的免疫反应，降低子宫炎的发病率和子宫感染的发生率。但现有的用于改善奶牛机体内菌群的乳酸菌的有害菌抑制能力有限，且当其与抗生素联合使用来治疗奶牛子宫内膜炎时，易受到抗生素的影响，无法在奶牛机体内定植和正常生长，不能发挥有效的抑制有害菌的作用以及调节基体菌群平衡的作用。

发明内容

针对现有用于调节奶牛生殖道内的常驻菌群的乳酸存在的上述问题，本发明提供一种植物乳杆菌CRS 33及其应用，该植物乳杆菌CRS 33对奶牛子宫内膜炎的病原菌大肠杆菌具有较强的抑制作用，可产生大量的过氧化氢、抑菌肽、抑菌蛋白和有机酸等抑菌物质，改善生殖道内的微生态环境，且其对多种抗生素具有耐药性，可与抗生素联合使用来有效预防和治疗奶牛子宫内膜炎。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一株植物乳杆菌CRS 33，所述植物乳杆菌( Lactobacillus plantarum) CRS 33的菌种保藏编号为CGMCC No.24454。该菌株于2022年03月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

相对于现有技术，本发明提供的植物乳杆菌CRS 33菌株对对环丙沙星、利福平、万古霉素、卡那霉素和链霉素完全耐药，使其在临床上可以联合抗生素共同使用。植物乳杆菌CRS 33在使用过程中无毒害作用且能有效杀灭病原菌，使机体的微生态环境的优势菌群为乳酸菌。另外，该植物乳杆菌对于奶牛子宫内膜炎的主要病原菌大肠杆菌具有极强的抑制作用，其可产生大量的抗菌物质，包括过氧化氢、抑菌肽、抑菌蛋白和有机酸。这些抗菌物质能有效够酸化生殖道内微生态环境，抑制病原微生物的生长和繁殖，维持生殖道微生态环境的稳定。同时，该植物乳杆菌CRS 33菌株具有良好的生长特性和产酸能力，这些特性保证了其进入生殖道内能迅速活化并大量繁殖，在生殖道内快速繁殖和产生发酵代谢产物，保证了其在动物生殖道内产生益生作用的基础。

本发明还提供所述植物乳杆菌CRS 33在抑制奶牛生殖道有害菌中的应用。

本发明提供的植物乳杆菌CRS 33在抑制奶牛生殖道有害菌中的应用，为奶牛生殖道相关疾病的临床防治提供了新的益生菌菌株，可进一步用于奶牛生殖道相关疾病的临床试验探究。

优选的，所述奶牛生殖道有害菌包括大肠杆菌。

本发明提供的植物乳杆菌CRS 33对奶牛生殖道有害菌大肠杆菌有较强的针对性，可显著抑制上述病害菌的生长。

本发明还提供了所述植物乳杆菌CRS 33在生产抑菌性有机酸中的应用。

本发明提供的植物乳杆菌CRS 33具有很强的产酸性能，能有效抑制有害病菌的生长，快速调节生殖道微生态环境的稳定。

本发明还提供了所述植物乳杆菌CRS 33在生产抑菌肽和抑菌蛋白中的应用。

本发明还提供了所述植物乳杆菌CRS 33在生产过氧化氢中的应用。

本发明还提供了所述植物乳杆菌CRS 33在制备具有抗生素耐药性的益生菌制剂中的应用。

本发明提供的植物乳杆菌CRS 33制备的益生菌制剂具有多种抗生素耐药性，可与抗生素联合使用，在快速抑制病害菌生长的同时，能快速调节生殖道微环境的菌群平衡和pH值。

优选的，所述益生菌制剂包括所述植物乳杆菌CRS 33。

附图说明

图1是本发明实施例3中的植物乳杆菌CRS 33产生的抑菌物质分析柱形图；

图2是本发明实施例4中的植物乳杆菌CRS 33的生长特性曲线图；

图3是本发明实施例5中的植物乳杆菌CRS 33的产酸性能曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

菌种的采集

选择产后子宫修复良好、卵巢无异常的奶牛进行生殖道采样。将采集的样品粘液置于无菌的50mL离心管中(事先装有20mL灭菌好的MRS肉汤)，并用封口膜封闭管口，标记牛的编号和日期。样品采集后放于冰盒中4h内送实验室进行分离培养。

菌种的分离培养与纯化

将采集的样品放入MRS液体培养基(按质量百分比计包括：1％蛋白胨、 2％葡萄糖、0.5％乙酸钠、0.02％硫酸镁、0.05％硫酸锰、5％牛肉粉、4％酵母粉、2％磷酸氢二钾、2％柠檬酸三铵和余量的蒸馏水)中富集培养18h，富集培养完成后取菌液1mL用灭过菌的蒸馏水倍比稀释至10^-6、10^-7和10^-8，分别取100μL上述稀释浓度的菌液涂布到MRS琼脂平板上，涂布完成后倒置放入厌氧罐内，37℃厌氧培养24h，将平板上生长的单个菌落挑出，然后用接种环划线至MRS固体培养基平板上培养24h，再重复之前的步骤挑取单菌落至 MRS固体培养基中，如此重复，直至分离出的菌落形态、大小、颜色一致。

挑取单个菌落进行涂片，分离得到1株呈乳白色或白色的革兰阳性菌，分离的菌株经纯化后，菌落大小均一，边缘整齐，湿润光滑。菌体形态一般为短杆状或球形，根据菌落形态特征以及革兰染色，初步鉴定上述菌株为乳酸菌，将其初步命名为CRS 33。

16S rDNA基因序列鉴定

利用DNA提取试剂盒提取上述分离得到的菌株的基因组DNA，采用细菌通用引物338F(5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′，SEQ ID NO.1)和518R： (5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′，SEQID NO.2)对菌株的16S rDNA V3 区进行PCR扩增。PCR扩增体系(25μL)如下：提取的基因组DNA 1μL，引物(338F/518R，10μmol/L)各1μL，2×Taq PCR Mix 12.5μL，ddH₂O 9. 5μL。PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。将PCR扩增产物送往上海生工生物公司测序，测序结果如表1所示。

表1 PCR扩增产物测序结果

用Blast软件对扩增产物进行比对分析，进一步确定其这株乳酸菌属于植物乳杆菌属，与Lactiplantibacillus plantarum strain RCM1呈现100％同源性，如表2所述，并将其进一步命名为植物乳杆菌CRS 33。该菌株于2022年03 月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

表2对比分析结果

实施例2

抑菌试验

将植物乳杆菌CRS 33和现有对照菌株分别接种于MRS液体培养基中厌氧静止培养18h后，用牛津杯法测其抑菌活性。将待测菌悬液12000r/min离心 20min，取240μL上清液加入病原菌平板上的牛津杯中，做5个重复，空白组添加等量的无菌蒸馏水，将平板放入恒温培养箱中37℃培养48h，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

其中，现有菌株为鼠李糖乳杆菌GR-1，菌株编号为ATCC55826，病原菌为大肠杆菌，菌株编号为CVCC1450，由中国农业大学营养与免疫实验室惠赠。以大肠杆菌作为病原菌指示菌，通过牛津杯法对分离得到的菌株进行抑菌试验，结果如表3所示，与现有菌株鼠李糖乳杆菌GR-1相比，CRS 33菌株有较强的抑菌活性。

表3抑菌活性检测结果

菌株	平均抑菌环直径
		植物乳杆菌CRS 33	19.33±0.05
鼠李糖乳杆菌GR-1	18.3±0.02
		空白组	无抑菌环

实施例3

抑菌物质分析

细菌素排除试验

为了消除蛋白类对抑菌能力的影响，按实施例2中的方法取植物乳杆菌 CRS 33培养的上清液，每1mL上清液中加入蛋白酶K进行酶解，37℃水浴处理3h。用牛津杯法测定抑菌物质是否含有细菌素。

过氧化氢排除试验

为了消除过氧化氢对抑菌能力的影响，向植物乳杆菌CRS 33培养的上清液中添加过氧化氢酶溶液进行酶解，37℃水浴处理1h，以大肠杆菌作为指示菌，用牛津杯法测定抑菌物质是否含有过氧化氢。

有机酸排除试验

为了消除有机酸对抑菌能力的影响，使用浓度为1mol/L的NaOH溶液把植物乳杆菌CRS 33培养的上清液的pH值调整为7.0，用牛津杯法测定抑菌物质是否为有机酸。

结果由图1所示，将上清液的pH调整到7.0时，CRS33的上清液对大肠杆菌的抗菌活性显著下降(P<0.05)；表明CRS33菌株的主要抗菌物质包括有机酸。向上清液中加入蛋白酶K时，CRS33上清液对大肠杆菌的抗菌活性极显著下降(P<0.01)；表明CRS33的主要抗菌物质包括具有抑菌作用的肽类及蛋白类物质。向上清液中加入过氧化氢酶时，CRS33上清液对大肠杆菌的抗菌活性极显著下降(P<0.01)；表明CRS33的主要抗菌物质还包括过氧化氢。

实施例4

生长性能

从冰箱里取出冻存的植物乳杆菌CRS 33菌液，在超净台中用接种环蘸取菌液放入事先配好的已经灭菌的MRS肉汤培养基中，活化三次，37℃厌氧静置培养14h活化，放置备用。取活化后的植物乳杆菌CRS 33按体积比为1％的比例接种于MRS肉汤培养基中，充分混合均匀后分别吸取5mL混合液置于 5mL无菌离心管中，分别编号为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、 22和24，于37℃厌氧培养，分别培养0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、 20、22和24h，根据标记好的时间将离心管取出，测量600nm波长下的吸光度。空白对照选用未接种植物乳杆菌CRS 33的MRS液体培养基，阳性对照选用接种鼠李糖乳杆菌的MRS液体培养基。测定前用涡旋振荡器摇匀，从最先取出的培养液开始依次测定，若菌液浓度太大，应适当稀释之后进行测量，测完之后记录数据。绘制细菌生长曲线：以时间为横坐标，OD 600nm为纵坐标，绘制菌株的生长曲线。

结果如图2所示，CRS33在培养6h后开始大量繁殖，进入对数生长期， 14h后趋于平缓，进入生长稳定期。CRS33对数生长期时间段为8～12h，稳定生长期时间段为12～24h。表明该乳酸菌的生长性能较好，菌体密度较高。

实施例5

取活化后的植物乳杆菌CRS 33按体积比为1％的比例接种于MRS肉汤培养基中，充分混合均匀后分别吸取5mL混合液置于5mL无菌离心管中，分别编号为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24，于37℃厌氧培养，分别培养0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24h，根据标记好的时间将离心管取出。使用pH计分别测定各个试管中菌液的pH。绘制细菌产酸能力的曲线：以时间为横坐标，pH值为纵坐标，绘制菌株的产酸能力曲线。

结果如图3所示，随着培养时间的延长，培养液的pH也随之降低，至培养16h后CRS33的pH降到3.77，并趋于稳定。表明该乳酸菌均具有极强的产酸性能。

实施例6

抗生素敏感试验

在活化后的植物乳杆菌CRS 33平板上挑取单菌落，接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h，使用MRS培养基将菌液浓度调整为3×10⁶CFU/mL，涂布在平板上，室温放置5min，用镊子将抗生素纸片贴于平板上，37℃厌氧培养18h，用游标卡尺测定抑菌圈直径。

结果如表5所示，该植物乳杆菌CRS 33对环丙沙星、利福平、万古霉素、卡那霉素和链霉素完全耐药，且对庆大霉素也有一定的耐药性。

表5抗生素敏感试验结果

注：R：抗性，I，中等敏感。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北农业大学

<120> 一种植物乳杆菌CRS 33及其应用

<130> 2022

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 338F

<400> 1

cctacgggag gcagcag 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 518R

<400> 2

attaccgcgg ctgctgg 17

<210> 3

<211> 165

<212> DNA

<213> 16S rDNA扩增片段

<400> 3

ggctagtgga cgaagtctga tggagcacgc cgcgtgagtg aagaagggtt tcggctcgta 60

aaactctgtt gttaaagaag aacatatctg agagtaactg ttcaggtatt gacggtattt 120

aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatt 165

Claims

1.一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)CRS 33，其特征在于：所述植物乳杆菌（Lactiplantibacillusplantarum）CRS 33的菌种保藏编号为CGMCC No.24454。

2.权利要求1所述的植物乳杆菌CRS 33在制备抑制奶牛生殖道有害菌的产品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述奶牛生殖道有害菌包括大肠杆菌(Escherichia coli)。

4.权利要求1所述的植物乳杆菌CRS 33在生产抑菌性有机酸中的应用。

5.权利要求1所述的植物乳杆菌CRS 33在生产抑菌肽和抑菌蛋白中的应用。

6.权利要求1所述的植物乳杆菌CRS 33在生产过氧化氢中的应用。

7.权利要求1所述的植物乳杆菌CRS 33在制备具有抗生素耐药性的益生菌制剂中的应用，所述益生菌制剂包括所述植物乳杆菌CRS 33；所述抗生素包括环丙沙星、利福平、万古霉素、卡那霉素、链霉素和庆大霉素。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述益生菌制剂包括所述植物乳杆菌CRS33。