CN111235070A - 一株母乳婴儿源植物乳杆菌bf_15及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了属于生物技术领域的一株母乳婴儿源的植物乳杆菌BF_15，保藏日期为2019年12月27日，保藏编号为CGMCC NO.19252。本发明的植物乳杆菌BF_15分离自河北省保定地区纯母乳喂养婴儿的新鲜粪便，耐酸、耐胆盐和耐受模拟人体消化液性能良好，并且具有免疫调节活性和抗氧化能力；同时能够有效地定植在小鼠肠道内；进一步以葡聚糖硫酸钠诱导小鼠溃疡性结肠炎为模型，菌株BF_15可通过减轻肠道黏膜损伤及炎症细胞浸润，缓解肠道黏膜氧化应激损伤，提高能量代谢水平，调节肠道黏膜免疫功能，促进抑炎因子的表达，达到有效缓解小鼠结肠炎症症状，BF_15还通过调节DSS诱发的肠道菌群结构紊乱来达到预防溃疡性结肠炎目的。

Description

一株母乳婴儿源植物乳杆菌BF_15及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及植物乳杆菌及其应用。

背景技术

肠道是人体最大的免疫器官，当肠道免疫系统发育不成熟或紊乱时，极易诱发免疫相关的肠道性疾病。溃疡性结肠炎(UC)是一种好发于直肠、结肠黏膜及黏膜下层的慢性非特异性炎症。近年来，普遍认为宿主共生的肠道菌群紊乱，免疫功能失调，氧化应激以及炎症介质在UC疾病发生和进展中起到重要作用。目前益生菌的分离和筛选主要来源于传统发酵食品、自然环境、动物和人体等，由于外源益生菌的生长环境与人体胃肠道的环境相差甚远，因此，相比外源益生菌，人源益生菌在耐胆汁、耐酸和耐胃液，胃肠道定植和黏附力，抑菌作用等方面的功能性更具优势，同时具有安全性高、不容易被人体肠道的免疫系统所排斥，具有遗传稳定性，因而更适合作为人类益生菌来使用。

健康婴儿的肠道菌群通常被植物乳杆菌定殖，而这些菌株是通过母乳喂养获得，是容易在肠道粘膜上定殖乳酸菌的重要来源，从而与宿主免疫系统相互作用。从粪便中选出乳酸菌，作为可用于一系列生物医学和技术应用的潜在益生菌发酵剂，被认为是一种很有前途的方法，因为这种细菌群具有与人的长期联系和适应性。总之，鉴于其安全性，益生功能特性以及在不同基质中作为微生物食品培养物的用途，植物乳杆菌，尤其是人体肠道来源，代表了一种极具吸引力的生物制剂，具有巨大的生物技术潜力。

考虑到我国较低的母乳喂养率以及我国婴儿源益生菌菌种资源的匮乏，以中国本土母乳喂养婴儿新鲜粪便为材料，以消化道耐受、抗生素敏感性、Caco-2细胞黏附能力、体外免疫调节和抗氧化能力为评价指标，筛选出具有突出免疫调节能力的乳酸菌，尤其是植物乳杆菌，能够为我国婴儿源益生菌的开发提供优良的菌种资源。

发明内容

本发明旨在解决上述问题，提供一株母乳婴儿源的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)BF_15CGMCC NO.19252。

本发明从河北省保定地区纯母乳喂养婴儿的新鲜粪便中分离出一系列乳酸菌株，并以分离自人体肠道，且能够耐受动物消化道环境，能够在人和动物肠道内定植，起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素和提高机体免疫力等功能特性的标准菌Lactobacillus rhamnos-us GG(ATCC 53103)作为阳性对照菌株(购自于中国普通微生物菌种保藏管理中心)，以耐酸能力、抗人工消化液能力、耐胆盐能力、黏附能力等为指标，筛选出一株具有潜在益生功能的乳酸菌，通过对其16S rDNA进行测序并结合生理生化试验结果初步确定为植物乳杆菌，命名BF_15，同时通过体外试验对该菌株的安全性(抗生素敏感性、有害代谢产物、溶血性等)及益生功能(免疫调节活性和抗氧化能力)进行评估；进一步通过体内试验评价该菌株在小鼠肠道中的定植能力；最后以DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎为动物模型，通过动物实验，测定免疫指标、氧化指标及结肠内容物肠道菌群多样性，检验筛选出的具免疫调节和抗氧化活性乳酸菌的早期摄入对溃疡性结肠炎模型小鼠是否具有通过调节肠道菌群预防肠道炎症的益生作用。

本发明还公开了所述母乳婴儿源植物乳杆菌在制备调节机体免疫力组合物中的应用。

本发明还公开了所述的母乳婴儿源植物乳杆菌在抗氧化组合物中的应用。

本发明还公开了所述母乳婴儿源植物乳杆菌在制备具有通过调节肠道菌群预防溃疡性结肠炎组合物中的应用。

本发明还公开了一种组合物，包含所述的母乳婴儿源植物乳杆菌。

本发明还公开了一种食品，包含所述的母乳婴儿源植物乳杆菌。

所述食品可以为奶粉。

本发明还公开了一种食品添加剂，包含所述的母乳婴儿源植物乳杆菌。

本发明还公开了一种微生物制剂，包含所述的母乳婴儿源植物乳杆菌。

本发明还公开了一种保健品，包含所述的母乳婴儿源植物乳杆菌。

本发明还公开了一种药物组合物，包含所述的母乳婴儿源植物乳杆菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1.本发明公开的母乳婴儿源植物乳杆菌BF_15耐酸、耐胆盐和耐受模拟人体消化液性能良好，并且能够很好地定植在小鼠肠道内。

2.体外安全性试验表明BF_15具备一定的安全性，除具有对氨基糖苷类、糖肽类抗生素的固有耐药性外，对苯唑西林、头孢噻吩也具有耐药性，但不存在抗性质粒，并且该菌株不产生有害代谢产物，不具有溶血性。

3.体外益生功能试验表明BF_15活性/热致死菌在一定的菌浓范围内(1×10⁶～10⁷CFU/mL)均能在体外促进小鼠淋巴细胞增殖，具有免疫调节功能。

4.体外益生功能试验表明BF_15菌体/发酵上清均具有较强的抗氧化活性，(耐受高浓度的H₂O₂、自由基(O₂ ^-·、·OH和DPPH)清除和抗脂质过氧化能力)。

5.通过DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎的动物模型证明BF_15菌体对溃疡性结肠炎具有缓解作用。

本发明的菌种保藏日期为2019年12月27日，保藏编号为CGMCC NO.19252。保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

附图说明

图1为菌株BF_15的菌落形态和菌体特征图。

图2为基于16S rDNA序列的系统发育树。

图3为质粒提取电泳图，其中M：super DNA marker；1：4.6kb质粒；2：8.0kb质粒；3：BF_15；4：LGG。

图4为靛基质反应检测图。

图5为溶血活性检测图。

图6(A)、(B)为不同种属、不同剂量的活性和热致死乳杆菌对淋巴细胞增殖指数影响图，不同处理组相比，n＝3，上标大写字母(A-E)代表P＝0.01水平的显著性差异，上标小写字母(a-e)代表P＝0.05水平的显著性差异。

图7为不同时期小鼠肠道定植BF_15的rpo B PCR产物分析电泳图谱，A为成功提取到样品及菌株BF_15的基因组,B为扩增到长约338bp的目的片段；其中M：Marker；1-3，适应期3组平行；4-6，灌胃期第一周3组平行；7-9，灌胃期第二周3组平行；10-12，恢复期第一周3组平行；13-15，恢复期第二周3组平行；16，L.plantarum BF_15。

图8为不同时期小鼠肠道定植BF_15的rpoB PCR-DGGE图谱图，其中M：L.plantarumBF_15；1-3，适应期3组平行；4-6，灌胃期第1周3组平行；7-9，灌胃期第2周3组平行；10-12，恢复期第1周3组平行；13-15，恢复期第2周3组平行；16，L.plantarum BF_15。

图9为不同处理组小鼠DAI评分图。

图10为不同处理组小鼠结肠形态图。

图11为不同处理组小鼠结肠长度图。

图12为不同处理组小鼠结肠组织HE染色图。

图13为不同处理组小鼠结肠组织氧化应激(MDA,T-SOD,GSH-Px)及能量代谢指标(ATP酶)。

图14为不同处理组血清中炎症因子(IL-6，IL-17A，TNF-α，IFN-γ和IL-10)及sIgA含量图。

图15为Illumina平台测序实验流程图。

图16为各样本在97％相似水平下的稀释曲线，其中(A)rarefaction curve指数分析；(B)coverage指数分析。

图17为益生菌(BF_15/LGG)对DSS诱导UC小鼠肠道菌群的影响图，其中(A：属水平不同处理组的PCA分析；B：门水平不同处理组间的菌群组成；C：不同处理组的Firmicutes/Bacteroidetes(F/B)比值；D：属水平不同处理组间的菌群组成；E：门水平不同样本间的菌群组成；F：属水平不同样本间的菌群组成)。

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明做出详细说明，应当了解，实施例只用于说明本发明，而不是用于对本发明进行限定，任何在本发明基础上所做的修改、等同替换等均在本发明的保护范围内。

实施例1从纯母乳喂养婴儿新鲜粪便中筛选乳酸菌并进一步鉴定

1、菌株的分离、纯化

用无菌玻璃棒挑取不同月龄健康婴幼儿自然排出的新鲜粪便，立即放入装有cMRS液体培养基的厌氧管中，进行1：10的梯度稀释，并选取合适的稀释度采用Hungate厌氧滚管进行菌株的分离，挑取单菌落，继续采用厌氧滚管进行多次菌株纯化。对分离并纯化的菌株进行革兰氏染色及接触酶试验，将初步确定为疑似乳酸菌于-20℃保藏备用。

2、菌株酸耐受能力测定

将纯化并活化好的的菌株按0.1％接种于pH 3.0的cMRS培养基中，37℃静置培养24h，以ΔA600(菌株在24h和0h时600nm处吸光度之差)为指标，初步筛选出耐酸菌株。

结果见表1(部分菌株的耐酸)，由表1可知：较其它菌株，菌株BF_1、BF_15、BF_29、BF_55在pH 3.0 MRS培养基中较好的生长，具有一定的酸耐受能力。

表1部分分离菌株在pH 3.0 MRS培养基中24h的生长情况

注：-表示菌株被完全抑制。

3、供试菌液的制备

菌株按2％(v/v)接种于cMRS液体培养基中，37℃培养，活化至三代，待第三代生长至稳定期(16～18h)，以6000rmp/min的速率4℃离心10min后，弃掉上清液，加无菌PBS缓冲液(pH7.4)洗涤3次。洗涤后的菌体悬浮于10mL PBS中，用灭菌PBS梯度稀释至一定倍数，采用MRS琼脂培养基平板倾注法37℃培养48h，计菌落总数，同时测定相应稀释度菌体的OD_600nm值。根据上述各稀释度OD值与所对应的近似菌落数(CFU/mL)的线性关系，通过调整各菌体在600nm处的OD(1.5-1.6之间)值，获得乳酸菌最终浓度分别为(1～2)×10⁹CFU/mL备用。

4、菌株耐受人工消化液能力测定

准确吸取1.0mL供试菌液加入到9.0mL人工胃液(pH 3.0)中，于37℃放置3h后取出1.0mL到9.0mL人工肠液(pH 8.0)中，37℃放置4h，分别对人工消化液处理0h和人工消化液处理7h的菌液进行活菌计数，按(1)计算存活率。

结果见表2，由表2可知：经人工消化液处理7h，供试菌株(BF_1、BF_15、BF_29、BF_55)的存活率分别为：(54.48±1.31)％、(59.97±7.60)％、(47.15±2.65)％、(57.39±3.62)％，其中以BF_15的存活率最高，略低于阳性对照菌株LGG(62.76±4.65)％，但差异不显著(P>0.01)，表明BF_15在较低pH(pH＝3.0)的人工消化液环境下能够较好的存活并生长。

表2菌株对模拟消化液的耐受性

注：不同处理组相比，n＝3，上标大写字母(A-E)代表P＝0.01水平的显著性差异，上标小写字母(a-e)代表P＝0.05水平的显著性差异。

5、菌胆盐耐受能力测定

将调整好浓度的供试菌悬液((1～2)×10⁹CFU/mL)以体积分数1％的接种量接种到胆盐浓度为0.3％的胆盐基础液中，调整菌体浓度至(1～2)×10⁷CFU/mL，37℃恒温培养，分别于0、4h取样，用平板计数法测定活菌数。按式(2)计算存活率。

结果见表3，由表3可知：BF_15的存活率高达(77.69±0.29)％，而其余供试菌株和阳性对照菌株LGG在0.3％胆盐浓度下作用3h后生长完全受到抑制，表明BF_15对胆盐具有一定的耐受能力。

表3菌株的耐胆盐实验

注：-表示菌株被完全抑制。

6、菌株对Caco-2细胞粘附能力的测定

用血球计数板调整Caco-2细胞浓度为5×10⁵cells/mL，按照1mL/孔加入到6孔细胞培养板中，再加入1mL的完全细胞培养液，于37℃的CO₂培养箱中培养；待细胞长成单层后用无菌PBS洗涤2-3次，以除去死细胞和抗生素；然后将用不含抗生素的细胞培养液调整好浓度的菌悬液(1～2)×10⁸CFU/mL)以1mL/孔接入到6孔板中，于37℃的CO₂培养箱中孵育2h；紧接着小心移去上清，无菌PBS漂洗5次，以除去未黏附的细菌，加入0.25％的胰酶0.5mL/孔消化细胞，再加入0.5mLPBS后，进行梯度稀释混板，37℃培养，计数。与此同时对没有接菌的一孔细胞中加入0.25％的胰酶0.5mL/孔消化细胞，再加入0.5mLPBS后直接用血球计数板计数，计算细胞浓度。按式(3)计算单个细胞黏附菌株的数量。

结果见表4，由表4可知：黏附率依次为BF_15＞LGG＞BF-55＞BF-1＞BF-29，其中BF_15的黏附能力最强(7.10±0.30)CFU/cell，显著高于阳性对照菌株LGG：(3.90±0.30)CFU/cell(P<0.01)，进一步表明供试菌株具有肠道定植的潜力，并且通过对耐人工消化液和耐胆盐试验结果的综合评价，筛选出具有较强抗逆性和粘附性的菌株BF_15为候选菌株进行后续试验研究。

表4供试菌株对Caco-2细胞的黏附作用

注：不同处理组相比，n＝3，上标大写字母(A-E)代表P＝0.01水平的显著性差异，上标小写字母(a-e)代表P＝0.05水平的显著性差异。

7、菌株的鉴定

经过筛选，得到1株具有潜在益生特性的菌株，命名为BF_15。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)以及《乳酸细菌分类鉴定及试验方法》，按照乳酸菌成套生化管鉴定使用说明书(SHBG13)对菌株BF_15的生理生化试验进行判断。同时，对具有潜在益生特性的菌株BF_15提取菌株的DNA，并以提取的DNA为模板，采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，将扩增成功的PCR产物送至上海生工公司进行测序。在NBCI(https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov)上，利用BLAST将测序返回的16S rDNA序列与Gen Bank中的标准菌株16S rDNA序列进行比，下载同源性分析最高的标准菌株的16S rDNA序列，使用MEGA5软件，利用Neighbor-joining的统计方法，选择Bootstrap method法建树，反复次数为1000，进行系统发育树构建。

结果见图1、表5和图2，由图1可知：将活化后菌株BF_15接种在固体MRS上，37℃培养48h后，可在培养基看到乳白色、表面光滑、边缘整齐、活性强的圆形菌落；并且该菌株革兰氏染色后，为G+菌，显微镜观察菌体发现无鞭毛、呈短杆状；同时由表5可知：BF_15能利用七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、山梨糖醇、蔗糖、棉子糖、菊粉、乳糖和1％马尿酸，对照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，显示菌株BF_15可能为植物乳杆菌；进一步将菌株BF_15的16S rDNA扩增产物，测序共得到1367个碱基，登陆NCBI数据库进行BLAST中16SrDNA序列进行比对和分析GenBank中的核酸数据，发现菌株与植物乳杆菌JCM1149(Accession NR117813.1)的相似性为99.93％，将菌株BF_15的16S rDNA测序结果在NCBI-BLAST进行同源性分析并构建系统发育树，由图2可知：菌株BF_15与所在分支的L.plantarum JCM1149的系统位置最接近；最终通过生理生化试验结合分子生物学鉴定，菌株BF_15可确定为植物乳杆菌，命名为Lactobacillus plantarum BF_15。

表5细菌微量生化鉴定管(乳酸菌)鉴定结果

实施例2植物乳杆菌BF_15体外安全性试验

1、药敏性试验

采用药敏纸片琼脂扩散法，将培养至对数末期的受试植物乳杆菌BF_15和阳性对照菌株LGG离心收集菌体(6000rmp/min)，用生理盐水洗涤并重悬，调整菌体浓度1×10⁸CFU/mL。将灭菌平皿平均划分为4部分，每一部分标明药敏纸片的名称和位置，加入MRS固体培养基，凝固后取100μL已调菌悬液均匀涂布，待晾干后用灭菌的镊子夹取药敏纸片轻放于固体培养基上，静置5min后翻转平皿，37℃恒温培养，24h后测量并记录抑菌圈的直径，判断受试菌株药物敏感性。平行实验三次。

对植物乳杆菌BF_15对常用8大类21种抗生素的敏感性进行测定，结果见表6。由表6可知：BF_15对氨苄西林、青霉素G、头孢哌酮、头孢他啶、红霉素、乙酰螺旋霉素等数十种药物均敏感，对苯唑西林、头孢噻吩、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、新霉素、万古霉素均耐药，并且与LGG相比，对头孢他啶、卡那霉素、哌拉西林表现出不同的耐药性。

表6 BF_15对常见抗生素的敏感性

注：S代表敏感；I代表中度敏感；R代表具有抗性。

2、质粒的提取

对菌株BF_15进行质粒的提取，并将提取的质粒进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

对菌株BF_15进行质粒提取，结果见图3。由图3可知：菌株BF_15及对照菌株LGG中不含有质粒。由此表明BF_15虽然对部分抗生素耐受，但不含有耐药性质粒，具备一定的安全性。

3、有害代谢产物评价

取-20℃保存的菌株于MRS固体培养基划线培养16h后，挑取单菌落于MRS液体培养基培养16h(37℃)以获得活化待用的菌液。

(1)硝酸盐还原酶检测

将活化好的供试菌株按3％的接菌量分别接入到硝酸盐(0.5％硝酸钾，蛋白胨：10g，氯化钠：10g)培养基中37℃培养5d后，先滴加5％的KI溶液10滴，接着滴加5％的淀粉溶液10滴，观察试验结果，同时做空白试验。滴加溶液和淀粉溶液后，培养基溶液变为蓝色为阳性结果，不变色为阴性结果。

(2)氨基脱羧酶活性检测

将活化好的供试菌株接种于MRS液体培养基，加入质量分数为0.1％的每一种前体氨基酸与质量分数为0.005％的5-磷酸吡哆醛，37℃培养24h，诱导菌体的脱羧酶活性。连续传代6次后，将菌株按10％的量分别接种于含酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、苯丙氨酸的Bover-Cid&Holzapfel改进的培养基，并在表面加入1mL的灭菌石蜡油密封，于37℃温箱培养3～4d，观察显色反应。若有淡蓝色或紫色的颜色特征则表示菌株形成相应氨基酸的生物胺。

(3)吲哚实验

将活化好的供试菌株及质控菌株大肠杆菌(ATCC 25922)按3％的接种量接入到靛基质反应检测培养基中，37℃恒温培养72h。然后向培养液中加入少量乙醚，震荡混匀以提取和浓缩靛基质，待乙醚层浮于培养液表面后，缓慢加入Kovacs氏试剂8-10滴，观察并照相记录，出现红色圆环则为靛基质反应阳性。

对菌株BF_15进行有害代谢产物的测定，结果见表7和图4。由表7和图4可知：菌株BF_15及对照菌株LGG的氨基酸脱羧酶和硝基还原酶活性为阴性(－)，靛基质试验结果也为阴性(－)。由此表明，菌株不产生生物胺、亚硝酸盐和哚类有害代谢产物。

表7氨基酸脱羧酶和硝基还原酶活性检测

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性

4、溶血活性检测

将BF_15/LGG接种于哥伦比亚血琼脂平板中，37℃培养观察菌落周围有无溶血圈出现，质控菌株为ATCC 25923。

哥伦比亚血琼脂平板法是检测细菌是否具有溶血活性最常用的方法，菌株溶血活性检测结果见图5。由图5可知：质控菌株金黄葡萄球菌ATCC 25923菌落周围出现溶血圈，表现为溶血阳性(+)，BF_15及LGG菌株的菌落周围没有溶血圈，表明无溶血活性(－)。

实施例3植物乳杆菌BF_15的体外免疫调节活性测定

小鼠脱颈处死，置于75％乙醇溶液中浸泡5分钟，皮肤消毒，置于超净台内，逐层剪开腹壁，无菌取小鼠脾脏，置于盛有预冷的细胞培养液平皿中，剪去结缔组织和脂肪，用2个无菌镊子，撕脾，至只剩下淡红色的脂肪组织；将脾细胞悬液通过带有4层纱布的漏斗，并用PBS清洗4层纱布，使脾细胞尽可能多的过滤到离心管中；1500rpm/min,离心5min，弃上清，加入8mL红细胞裂解液，室温放置5min，离心弃上清，并用PBS洗涤2次，收集细胞；台盼蓝染色计数，最后以完全DMEM培养基调节脾细胞数为1-2×10⁶cells/mL备用。

在无菌96孔板中，设

(1)空白调零组(只加细胞培养液200μL/孔)；

(2)阳性对照组(淋巴细胞悬液180μL/孔和75μg/mL的ConA 20μL)；

(3)乳酸菌对照组(培养液180μL/孔和浓度为10⁶～10⁸CFU/mL的待测活性和热致死菌悬液)；

(4)乳酸菌试验组(加淋巴细胞悬液180μL/孔，20μL/孔待测菌悬液(浓度为10⁶～10⁸CFU/mL的待测活性和热致死菌悬液)，使不同种属的活性和热致死乳杆菌与细胞分别以10:1、1:1和1:10的比例共同孵育)。

所有实验均3个平行。加样混匀后，置于37℃、5％CO₂培养箱连续培养48h。在培养结束前4h，加入新鲜配制成5mg/mL的MTT液20μL/孔，反应4h，作用结束后，吸取培养液，加入DMSO 100μL/孔，轻轻振荡使其溶解后，用酶标仪570nm波长处测定OD值，计算公式(4)如下：

式中：OD₁为实验组OD值；OD₂为阳性对照组OD值；OD₃为菌株OD值；PI>1时提示促进增殖；PI<1时提示抑制增殖。

菌株BF_15和阳性对照菌株LGG体外对小鼠脾细胞增殖作用的结果见图6(A、B)。由图6(A、B)可知：对于活菌而言，菌浓度为10⁷CFU/mL时，BF_15和LGG对脾淋巴细胞的增值效果与Con A组没有显著差异(P>0.05)，而菌浓度为10⁸CFU/mL时，BF_15和LGG的促增殖效果显著低于Con A组(P<0.01)；对于死菌而言，在菌浓度为10⁷CFU/mL时，BF_15和LGG对脾细胞的增值效果低于Con A组，差异不显著(P>0.05)，在菌浓度为10⁶和10⁸CFU/mL时，BF_15对脾细胞的增值效果显著低于Con A组(P<0.01)；无论活菌还是死菌，在相同菌浓条件下，BF_15和LGG的促增殖效果没有显著差异(P>0.05)。表明植物乳杆菌BF_15本身或其代谢产物对小鼠脾淋巴细胞的增殖具有促进效果，具有一定的免疫调节能力。

实施例4 BF_15的体外抗氧化活性测定

(1)菌株不同组分(发酵上清、菌悬液)的制备

将培养好的菌液离心取上清为发酵上清，并将菌体浓度调整至10⁹CFU/mL。

(2)清除·OH能力测定

采用水杨酸法，对益生菌(BF_15/LGG)清除·OH的能力进行测定。将1.0mL 5mmol/L的FeSO₄和1.0mL 3mmol/L的H₂O₂与菌悬液室温混合反应10min后加入1.0mL 5mmol/L的水杨酸溶液，然后加入蒸馏水至10mL。将混合物在室温下静置反应30min后，置于离心机中6000rmp/min离心10min，在510nm处测得吸光值。对照组为等体积蒸馏水代替样品溶液。清除率按公式(5)计算。

(3)清除DPPH能力测定

取1.0mL样品加入到1.0mL 0.2mmol/L乙醇DPPH自由基溶液中，将反应溶液摇匀后，置于室温下遮光反应30min，在6000rmp/min离心10分钟后，取上清液在517nm处测量溶液的吸光度。对照组为等体积的蒸馏水代替样品溶液。空白组包括等量的乙醇代替DPPH自由基溶液。清除率按公式(6)计算。

(4)清除O₂ ^-·能力测定

采用邻苯三酚自氧化法，对益生菌(BF_15/LGG)清除O₂ ^-·的能力进行测定。将3mLPH为8.0的Tris-HCl缓冲液与0.4mL 25mmol/L邻苯三酚混合，25℃反应20min，加入1mL样品，25℃反应4min，加两滴浓盐酸终止反应。对照组用蒸馏水代替样品。清除率按公式(7)计算。

(5)抗脂质过氧化能力测定

对益生菌(BF_15/LGG)抗脂质过氧化的能力进行测定。磁力搅拌10min等体积的PBS(pH7.4)与蛋黄混合液，再加入同样pH的PBS，使其成为PBS:混合液为成1:25的蛋黄悬液。取1mL蛋黄悬液，1mLPBS，1mLFeS0₄(25mM)和0.5mL菌悬液溶液混匀，37℃振荡30min后加入1mL的三氯乙酸(20％)，静置10min离心(3500rmp/min，10min)，取3mL上清液与2mL TBA(0.8％)混匀，沸水浴中反应10min，冷却后测其在532nm波长处的吸光值。清除率按公式(8)计算。

式中：A_b：对照组吸光度，以蒸馏水代替样品；A_c：样品组吸光度。

菌株BF_15和阳性对照菌株LGG体外抗氧化指标：自由基(DPPH、O₂ ^-·、·OH)清除能力及抗脂质过氧化能力进行测定，结果见表8。

由表8可知：菌株BF_15和LGG均表现出一定的体外抗氧化能力。对于同一菌株不同组分之间的抗氧化能力比较而言，对DPPH和O₂ ^-·清除能力强弱顺序BF_15和LGG均为：发酵上清液＞菌悬液；对·OH清除能力强弱顺序BF_15为：发酵上清液＞菌悬液，而LGG为：菌悬液＞发酵上清液；抗脂质过氧化能力强弱顺序BF_15为：菌悬液＞发酵上清液，而LGG为：发酵上清液＞菌悬液。

对于不同菌株之间的抗氧化能力比较而言，BF_15发酵上清清除·OH和O₂ ^-·的能力高于LGG，清除DPPH和抗脂质过氧化能力却低于LGG；BF_15菌悬液的各项抗氧化指标均高于LGG。由此表明：BF_15的综合抗氧化能力优于LGG，并且主要以其代谢产物抗氧化能力为主，可作为天然抗氧化剂候选菌株。

表8菌株不同组分综合抗氧化能力分析(％)

注：不同处理组相比，n＝3，上标大写字母(A-E)代表P＝0.01水平的显著性差异，上标小写字母(a-e)代表P＝0.05水平的显著性差异。

实施例5植物乳杆菌BF_15在小鼠体内的定植能力测试

1、小鼠的饲养及分组

取6周龄SPF级BALB/c小鼠，饲喂基础饲料，用于BF_15在小鼠肠道定植能力的测定。菌株体内定植能力测定实验周期为5周，第1周为适应期，第2、3周为灌胃期，第4、5周为恢复期。在适应期和恢复期对小鼠灌胃生理盐水；在灌胃期间，小鼠对菌株摄入量为(1～2)×10⁸CFU/只/d，主要基于以下两种假设：1)人体肠道菌群的数量为10¹⁴，每天摄入乳制品中的活菌数量为10¹⁰CFU，比率为10⁴；2)小鼠肠道菌群的数量为10¹¹～10¹²CFU。分别在适应期(第1周)、灌胃期(第2周和第3周)以及恢复期(第4周和第5周)5个时间点无菌收集小鼠粪便，保存于-80℃冰箱，备用。

2、基因组DNA提取

对不同阶段采集的小鼠粪便提取基因组，采集粪便样品0.1g，溶于5mL无菌PBS中，漩涡震荡混匀后4℃、3000rmp/min离心5min取上清，2次。12000rmp/min离心5min收集菌体，PBS洗2次，无菌水洗1次，菌体分装1mL/管。取1mL处理好的粪便样品混匀后12000rmp/min离心10min，弃上清，将沉淀重悬于500μL裂解液Ⅰ中，剧烈震荡。加入溶菌酶(100mg/mL)100μL(终浓度为16.8mg/mL)，轻轻混匀，冰浴70min。加裂解液Ⅱ500μL，混匀后加9％的SDS 100μL，冰浴5min，分装2管，每管620μL。每管加500μL的Tris-HCl饱和酚，12000rmp/min离心10min取上清。加入等体积的Tris-HCl饱和酚和氯仿异戊醇(24：1)进行抽提，12000rmp/min离心10min取上清。加入等体积氯仿异戊醇(24：1)抽提，12000rmp/min离心10min取上清。加入2倍体积的预冷无水乙醇，-20℃醇沉30min，12000rmp/min离心10min留沉淀，再用1mL70％乙醇洗涤，12000rmp/min离心1min。干燥去乙醇，沉淀中加30μL TE，加1/10体积的RNAase，37℃水浴20min，琼脂糖凝胶电泳检测完毕后于-20℃保存备用。

3、细菌rpo B可变区的PCR扩增

(1)rpo B特异性引物设计

登录NCBI网站，从Gen Bank数据库中下载植物乳杆菌及与其遗传距离近/远菌株的rpo B基因序列，用DNAMAN软件进行比对和分析，基于序列比对的保守区及序列之间G+C含量差异显著的区段设计特异性引物：GC-rpo B-up，rpo B-down，其中rpo B-up 5’端带有一个40bp GC夹子。

(2)PCR扩增

分别以粪便中细菌基因组和植物乳杆菌BF_15基因组为模板，根据设计的特异性引物扩增rpo B基因中长为339bp的片段。用Nanodrop 2000微量分光光度计测定产物浓度，定量后统一上样量为1000ng(根据预试验结果确定)。

采用溶菌酶法提取样品基因组，并以其为模板，采用rpo B特异性引物进行PCR扩增，结果见图7(A、B)。由图7(A、B)可知：成功提取到样品及菌株BF_15的基因组(图7A)，并以此为模板扩增到长约338bp的目的片段(图7B)，并且条带单一，可以进行后续实验。

4、BF_15肠道定植能力的检测

根据预实验结果，将PCR产物用变性梯度为20％～60％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳结束后银染后拍照。进一步将DGGE图谱中与BF_15条带对应的条带切下置于无菌管中，加入无菌水100μL置于4℃浸泡过夜，取上清作为模板进行PCR扩增：所用引物是rpo B-up(不带GC夹)-rpo B-down，反应体系和条件不变。将PCR产物克隆到pMD 19-T载体上，并将阳性克隆子菌液送往北京华大科技测序。

以BF_15基于rpo B基因的PCR产物作为Marker，确定灌胃的目标菌株出现的位置，结果见图8。由图8可知：在适应期(第1周)，小鼠肠道内未发现植物乳杆菌的存在；在灌胃期(第2、3周)，小鼠肠道内出现与目标菌株BF_15相对应的条带；在停止灌胃后的恢复期内，第4周目的条带稍有减弱，第5周目的条带逐渐增强。通过对图中菌株BF_15、灌胃期和恢复期的目的条带测序比对发现，该目的条带与目的基因的片段同源性为100％，由此表明植物乳杆菌BF_15能够在小鼠肠道内存活下来并很好地定植。

实施例6植物乳杆菌BF_15通过调节肠道菌群缓解小鼠溃疡性结肠炎

一、植物乳杆菌BF_15早期灌胃缓解溃疡性结肠炎病症的评价

1、实验动物的分组及饲喂方式

7周龄SPF级C57BL/6J小鼠，饲喂基础饲料，适应环境一周，然后按照表9进行动物实验分组(每组10只)及灌胃，持续4周，并于第4周对除正常组以外的组别进行溃疡性结肠炎造模：采用浓度为0.8g/mL DSS溶液，剂量为0.1mL/10g进行灌胃，持续7d，造模结束后对小鼠眼球取血后脱颈处死，取结肠内容物及结肠组织用于后续各项指标的测定。

表9小鼠试验组别

2、各项指标的测定

(1)疾病活动指数(DAI)的评估

根据Hamamoto等评分方法，计算小鼠的DAI评分，主要包括：每日体重变化大便性状以及便隐血情况，评分标准见表10。其中便潜血按照粪便隐血(OB)试剂盒(珠海贝索生物技术有限公司)进行测定。

表10疾病活动指数(DAI)评分标准

注：正常大便：成型大便；松散大便：不黏附于肛门的糊状、半成型大便；稀便：可黏附于肛门的稀水样便。

通过以上三项指标对各组小鼠进行DAI评分，结果如图9所示。正常对照组小鼠行动活跃，毛发有光泽，饮食饮水正常，没有出现松散、不成形的粪便，且无体重下降和粪便隐血情况，因此DAI评分基本维持在0分左右；与正常组小鼠相比，模型组小鼠活动量下降，拱背，毛发无光泽，饮食量减少，体重下降明显，腹泻并出现肉眼可见的严重的粪便含血等一系列情况，DAI评分明显增加到(3.00±0.50，P<0.05)；与模型组小鼠相比，早期给予灌胃益生菌BF_15和LGG(109CFU/mL，0.1mL/10g)预防的两组小鼠活动量有所增加，体重下降趋势减缓，粪便隐血情况改善，粪便形状较模型组小鼠粪便粘稠，DAI评分分别为1.16±0.36、0.93±0.20，显著低于模型组(P<0.05)，但仍不能恢复到正常状态。结果表明：益生菌的早期灌胃可有效缓解DSS诱发的小鼠体重下降，结肠出血等炎症相关症状。

(2)结肠组织病理切片及HE染色

将小鼠颈椎脱白处死后，无菌取小鼠结肠，用预冷的生理盐水冲洗肠道内容物后立即放于4％多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋，5μm切片，HE染色后于200倍光学显微镜下观察结肠黏膜炎症情况，包括黏膜的完整性，黏膜内炎症细胞的浸润，隐窝结构的改变程度和炎症范围。

各组小鼠于造模完毕后第8d，统一处死，解剖，取肛门至回盲部的结肠，进行结肠大体病变观察，进一步测量结肠长度，并通过对各组小鼠结肠HE染色观察其组织病变情况，结果如图10、11、12所示。整体观察结肠发现(图10)：与正常组小鼠相比，DSS模型组小鼠均可见结肠部肿大并残留血性大便，结肠标本肉眼观察可见水肿，而益生菌(BF_15和LGG)预防组结肠出现水肿，但并未见明显的肠内出血。结肠长度结果显示(图11)：正常小鼠的结肠长度为：正常对照组小鼠结肠长度为6.72±0.32cm；模型组小鼠结肠长度分别为：4.43±0.32cm，与正常对照组相比明显缩短，且差异显著(P<0.01)；益生菌(BF_15和LGG)组小鼠结肠长度为5.41±0.26cm和5.37±0.34cm，虽比正常组明显缩短(P<0.01)，但还是显著长于模型组(P<0.01)。小鼠近端结肠HE染色结果显示(图12)：正常对照组小鼠结肠黏膜上皮组织完整，结构清晰，上皮细胞排列紧密；模型组均可见广泛隐窝结构破坏，溃疡形成，上皮细胞排列紊乱，杯状细胞丢失，大量炎症细胞浸润，呈典型炎症样变；与模型组相比，益生菌BF_15和LGG干预组，粘膜上皮排列较为整齐，未出现大面积溃疡，隐窝腺体较为完整，杯状细胞较为丰富，少量炎性细胞浸润。以上结果表明：菌株BF_15能够缓解DSS诱发的结肠肿胀缩短及组织炎症损伤的程度，并且与LGG相当。

(3)结肠组织中氧化应激指标测定

按照检测试剂盒说明书，首先对结肠组织进行前处理：取小鼠结肠组织，加入9倍体积预冷的生理盐水，组织匀浆机匀浆后离心取上清液，采用考马斯亮蓝法测定样品上清蛋白浓度；然后取测定好浓度的不同处理组的结肠组织匀浆上清，同时按照各指标的试剂盒说明书，分别对氧化应激指标：MDA、T-SOD、GSH-Px及能量代谢指标：超微量总ATP酶进行测定。

利用酶联免疫(ELISA)的方法对小鼠结肠组织进行氧化应激(MDA、T-SOD、GSH-Px)及能量代谢(超微量总ATP酶)指标的测定，结果见图13。由图13可知：与正常对照组相比，DSS诱导溃疡性结肠炎模型组小鼠结肠组织中MDA的含量显著升高(1.99±0.21 VS 0.55±0.12)(P<0.01)，而T-SOD、GSH-PX及ATP酶活力均显著下降(100.79±9.84 VS 135.11±3.75、16.23±3.52 VS 27.48±1.06、11.28±2.05 VS 22.98±1.92)(P<0.01)；益生菌(BF_15/LGG)组对DSS诱发的以上指标的变化均有缓解作用：相对模型组，MDA的含量显著降低(P<0.01)，而T-SOD、GSH-PX及ATP酶的酶活力显著提高，但仍不能恢复到正常水平(P<0.01)。结果表明，DSS导致小鼠结肠的抗氧化能力及能量代谢水平的降低，而早期灌胃BF_15可显著缓解这一趋势，且与LGG相当。

(4)血清中细胞因子的测定

按试剂盒说明书，将取好的小鼠全血置于1.5mL离心管中静置1h后，2000rmp/min离心10min，收集血清，用ELISA法测定血清中IL-6、IL-17A、TNF-α、IFN-γ、IL-10及sIgA的含量。

利用ELISA的方法，检测了小鼠血清中的炎症因子(IL-6、IL-17A、TNF-α、IFN-γ、IL-10)及sIgA的含量，如图14所示。由图14可知：与正常组相比，DSS模型组小鼠血清中的促炎因子IL-6(105.42±14.24 VS 78.58±11.18)、IL-17A(5.93±0.66 VS 5.20±0.55)、TNF-α(501.17±100.91 VS 418.68±40.56)和IFN-γ(615.09±89.25 VS 487.47±64.50)的分泌量显著增加(P<0.01)；抑炎因子IL-10(565.92±79.40 VS 689.43±90.76)和sIgA(9.75±1.29 VS 14.26±2.00)的分泌量显著降低(P<0.01)。益生菌(BF_15/LGG)组对DSS诱发的以上指标的变化均有缓解作用：相对模型组，小鼠血清中的促炎因子IL-6(89.24±12.60、93.88±11.16)、IL-17A(5.73±0.55、5.62±0.41)、TNF-α(459.69±25.69、453.07±22.97)和IFN-γ(544.72±73.00、519.24±71.16)的分泌量显著降低(P<0.01)；抑炎因子IL-10(656.84±66.01、638.18±65.21)和sIgA(12.79±1.77、13.11±1.74)的分泌量显著增加(P<0.01)，虽然不能恢复到正常水平，但与正常差异不显著(P>0.05)。结果表明，DSS诱发小鼠结肠的炎症反应，而早期灌胃BF_15可显著缓解这一趋势，且与LGG相当。

二、植物乳杆菌BF_15对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群紊乱的调节

1、高通量测序试验流程

本实验同样将采集的小鼠结肠内容物干冰寄送至美吉生物医药科技有限公司(上海)，公司对样品进行图15所示试验流程。全部样本按照正式实验条件进行，每个组别4个重复。(正常对照组(CK)：CK_1、CK_2、CK_3、CK_4，DSS模型组(M)：M_1、M_2、M_3、M_4，BF_15干预组(BF_15)：BF_15_1、BF_15_2、BF_15_3、BF_15_4，LGG干预组(LGG)：LGG_1、LGG_2、LGG_3、LGG_4)。

2、生物信息学分析

Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析，基于OTU可以进行多种多样性指数分析，基于OTU聚类分析结果，可以对OTU进行多种多样性指数分析，以及对测序深度的检测；基于分类学信息，可以在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。在上述分析的基础上，可以对多样本的群落组成和系统发育信息进行多元分析和差异显著性检验等一系列深入的统计学和可视化分析。

首先经Illumina高通量测序后发现：4组(正常对照组组、DSS模型组、BF_15干预组、LGG干预组)，16个样本总共获得11,96074条有效的16S rRNA基因序列(即通常说的原始序列：Raw reads)。经筛选，过滤，优化，共获得5,98037条高质量的序列，2454个OTUs，这些OUT可以规划为9个门(phylum)，14个纲(class)，18个目(order)，34个科(family)，83个属(genus)，125个种(species)。其中正常对照组有9个门，14个纲，18个目，33个科，80个属，120个种；DSS模型组有9个门，14个纲，15个目，29个科，65个属，99个种；BF_15组有8个门，13个纲，14个目，28个科，69个属，106个种；LGG组有9个门，14个纲，16个目，32个科，76个属，111个种。

然后对各组的稀释曲线及coverage指数进行分析，结果见图16(A/B)。由图16A可知：随着测序量的增大，OTU数量由最初的直线上升逐渐变缓；同时，图16B可知：四组的coverage值均在99％以上，提示本次测序的序列基本可覆盖样本中绝大多数菌群种类。由此表明：目前测序量足够检测到绝大部分物种，可以进行下一步分析。

为了分析益生菌(BF_15/LGG)对DSS诱发小鼠肠道菌群失调的缓解作用，首先基于UniFrac距离对样品进行weighted PCA分析，然后采用柱形图更为直观和形象地展示了各组样本中在门水平和属水平的微生物物种组成情况，结果如图17。

主成分分析(PCA)可用于评估不同处理组间菌群整体结构是否也具有明显差异，由图17A可知：随着DSS的应用，样本间发生了较为明显的区分：首先每组组内小鼠样本均聚成各自较为独立的区域(仅有个别样本发生偏离现象)，并且组内的差异性明显小于组间的差异性；其次与CK组比，单纯DSS处理的M组各样本的位置全部集中在左下侧，而同样用DSS处理的益生菌干预组(BF_15/LGG)偏离M组并逐渐偏向CK组，由此表明一方面DSS造模成功，诱发了肠道菌群紊乱，另一方面益生菌的早期灌胃能在一定程度上缓解DSS诱发的小鼠肠道菌群失调。

由图17B可知：与正常对照组(CK)相比，模型组(M)经过为期7d的DSS干预其肠道菌群的组成在门水平上发生了明显的改变：拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁杆菌门(Firmicutes)是其中绝对的优势菌门，但比例已经发生了改变，Firmicutes相对丰度由33.52％降到33.48％，变化不大；而Bacteroidetes丰度由49.92％明显降至28.02％；而变形菌门(Proteobacteria)(4.65％VS 5.99％)、无壁菌门(Tenericutes)(0.54％VS4.12％)丰度却有所提升；除此以外疣微菌门(Verrucomicrobia)的相对丰度也由8.04％提高到为27.33％，并成为了除Bacteroidetes，Firmicutes以外的优势菌门之一。相对模型组，益生菌(BF_15/LGG)的干预组缓解了DSS诱发的Bacteroidetes的相对丰度的降低(30.85％、29.29％)以及Proteobacteria、Tenericutes相对丰度提高，然而对于Verrucomicrobia的相对丰度不但没有抑制，反而极大促进了该菌门相关菌群的增殖(33.84％、42.68％)。同时由图17C可知，DSS干预组(M)F/B(Firmicutes/Bacteroides)的比率高于正常对照组(CK)，但差异不显著(50％VS 20％，P＞0.05)，而益生菌(BF_15/LGG)的早期灌胃使得F/B值均降低，但差异均不显著。

由图17D可知，与正常对照组相比，模型组(M)经过为期7d的DSS干预其肠道菌群的组成在属水平上发生了明显的改变：拟杆菌科S24-7属(norank_f_Bacteroidales_S24-7_group)、毛螺菌属(Lachnospiraceae NK4A136_group)、norank_f_Erysipelotrichaceae和脱硫弧菌属(Desulfovibrio)的相对丰度均明显下降，而瘤胃球菌属(Ruminococcaceae_UCG-014)、拟杆菌属(Bacteroides)和Odoribacter等的相对丰度上升，除此以外艾克曼菌属(Akkermansia)的相对丰度也由8.04％提高到为27.33％，并且该菌属隶属于Verrucomicrobia。相对模型组，益生菌(BF_15/LGG)的早期灌胃组提高了norank_f_Bacteroidales_S24-7_group、Lachnospiraceae NK4A136_group的丰度，但差异不显著；LGG组对Ruminococcaceae_UCG-014、Bacteroides丰度的升高有所抑制，但BF_15对此没有抑制作用；对Akkermansia菌属的相对丰度两益生菌组(BF_15/LGG)不但没有抑制，反而极大促进了其增殖。由此可知，在属的水平上看，DSS明显改变了肠道菌群结构，而益生菌的早期灌胃对于这一趋势变化具有一定的缓解作用。

在上述基础上，通过对不同处理组中的不同样本间在门和属水平的菌群组成进行深入剖析，由图17E可知：在门水平上，模型组、益生菌(BF_15和LGG)早期灌胃组经DSS处理后，肠道菌群中均出现Verrucomicrobia，并成为优势菌门之一，而CK组中，除CK_3外，其他三个样本的菌群中不存在/微量的Verrucomicrobia菌门；同样，由图17F可知：在属水平，模型组、益生菌(BF_15和LGG)早期灌胃组经DSS处理后肠道菌群中均出现Akkermansia菌属，并成为优势菌属之一，而CK组中，除CK_3外，其他三个样本的菌群中不存在/微量的Akkermansia菌属；最终在种水平确定结肠炎小鼠肠道菌群中以优势菌群存在的菌株为：Akkermansia muciniphila。由此可知，DSS诱发小鼠肠道菌群紊乱，而BF_15的早期干预缓解了这一趋势的变化。

应用实施例1植物乳杆菌BF_15在酸奶中的应用

1、菌种活化及发酵剂制备

先用改良MRS液体培养基活化植物乳杆菌BF_15,37℃培养18h,然后将V以3％的接种量接种于装有10mL灭菌牛奶的试管中,振荡摇匀,于37℃培养至牛乳成凝固状态。如此传代培养至第3次,得到活化菌种,冷藏备用。

2、发酵制备酸奶样品

将乳粉∶水为1∶5复溶，经115℃杀菌15min,加5％的白砂糖,冷却至42℃后接入4％植物乳杆菌BF_15。分装,于37℃下培养至凝乳(6-8h),转移至4℃冰箱中冷藏。

应用实施例2植物乳杆菌BF_15在发酵果蔬汁中的应用

分别取芒果汁、香蕉汁、紫薯汁、芦荟汁、胡萝卜汁、大蒜汁、姜汁，稀释至Brix＝12后，于95℃下灭菌5min。待料液冷却至30℃后，将植物乳杆菌581以0.002％(1.0×107CFU/mL)的添加量接种到发酵基料中，37℃下进行发酵。在发酵后16h后得到发酵果蔬汁。

应用实施例3植物乳杆菌BF_15在青贮饲料中的应用

收割后的初花期苜蓿材料在室温晾晒至水分在60％左右,将切成2cm左右长短的100g苜蓿材料放入青贮袋中,每个青贮袋中加入100μL植物乳杆菌BF_15菌液，混匀，抽真空后密封，室内25℃放置。其中，不加菌的青贮饲料作为对照。青贮95天后得到青贮饲料。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株母乳婴儿源植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BF_15，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.19252。

2.权利要求1所述的母乳婴儿源植物乳杆菌在制备调节机体免疫力组合物中的应用。

3.权利要求1所述的母乳婴儿源植物乳杆菌在抗氧化组合物中的应用。

4.权利要求1所述的母乳婴儿源植物乳杆菌在制备具有通过调节肠道菌群预防溃疡性结肠炎组合物中的应用。

5.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的保藏编号为CGMCC NO.19252的母乳婴儿源植物乳杆菌。

6.一种食品，其特征在于，包含权利要求1所述的保藏编号为CGMCC NO.19252的母乳婴儿源植物乳杆菌。

7.一种食品添加剂，其特征在于，包含权利要求1所述的保藏编号为CGMCC NO.19252的母乳婴儿源植物乳杆菌。

8.一种微生物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的保藏编号为CGMCC NO.19252的母乳婴儿源植物乳杆菌。

9.一种保健品，其特征在于，包含权利要求1所述的保藏编号为CGMCC NO.19252的母乳婴儿源植物乳杆菌。

10.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的保藏编号为CGMCC NO.19252的母乳婴儿源植物乳杆菌。

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