CN116694503A - 一种具有润肠通便和提高免疫功能的植物乳杆菌Lp-HZ55 - Google Patents

一种具有润肠通便和提高免疫功能的植物乳杆菌Lp-HZ55 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一株具有润肠通便和提高免疫力功能的植物乳杆菌。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 20221778，分类命名为植物乳杆菌Lp‑HZ55Lactobacillus plantarum Lp‑HZ55，保藏日期为2022年11月14日。本发明的菌株Lp‑HZ55不管是活菌还是灭活状态，都可以有效调整小鼠肠道菌群结构，提高了结肠炎小鼠肠道菌群多样性，有益菌会生成乳酸和醋酸，保持肠道内酸性，酸性物质刺激，可以加快大肠蠕动，促进排便通畅，从而具有优良的润肠通便效果。此外，本发明的植物乳杆菌还具有显著的提高免疫力的功能。

Description

一种具有润肠通便和提高免疫功能的植物乳杆菌Lp-HZ55
技术领域
本申请涉及植物乳杆菌技术领域，主要涉及一种具有润肠通便和提高免疫功能的植物乳杆菌Lp-HZ55。
背景技术
益生菌是活的有机体，给予足够的量，会给宿主带来健康益处。有报道称益生菌已用于预防肠道细菌疾病和维持正常菌群。益生菌发挥益生作用的基本机制如下:(1)肠道菌群紊乱的定植和修复；(2)竞争排斥有害微生物和抗菌分子的产生；(3)细胞拮抗、细胞粘附和粘蛋白表达；(4)调节宿主的先天免疫和获得性免疫。
植物乳杆菌是目前被广泛关注的益生菌,普遍存在于果蔬的表面，具有很强的发酵产酸能力。同时研究表明植物乳杆菌具有较强的耐受人体胃肠道内不良环境的能力,容易定植在人体肠道中生长代谢产生乳酸等成分，在代谢的过程中会损耗一些维生素，同时合成叶酸等B族维生素，提高矿物元素的生物活性，进而达到为宿主提供必需营养物质、增强营养代谢、促进其生长的作用。此外，能产生乳酸，是一种重要的抗菌化合物，能降低肠道pH值，对大肠杆菌和梭状芽抱杆菌有抑制作用。同时使肠道内环境呈现偏酸性状态，有利于机体消化吸收更多的营养素。
本发明旨在提供一种具有润便通肠和提高免疫功能的植物乳杆菌。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于提供一种具有润便通肠和提高免疫功能的植物乳杆菌，以开放其实际的应用场景和领域。
第一方面，本申请筛选得到了一种植物乳杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 20221778，分类命名为植物乳杆菌Lp-HZ55Lactobacillusplantarum Lp-HZ55，保藏日期为2022年11月14。
第二方面，本申请实施例公开了所述的植物乳杆菌Lp-HZ55在润肠及通便方面的应用。
第三方面，本申请实施例公开了所述的植物乳杆菌Lp-HZ55在提高免疫力方面的应用。
第四方面，本申请实施例公开了所述的植物乳杆菌Lp-HZ55在缓解酒精性肝损伤保护肝脏方面的应用。
第五方面，本申请实施例公开了所述的一种具有润肠通便和提高免疫力功能的植物乳杆菌的菌粉的制备方法如下：
S1、制备种子悬液，将-20℃保藏的植物乳杆菌Lp-HZ55的甘油管融化取1mL接种到装有50～100mL MRS液体培养基中，30～35℃静置培养14～16h无菌生理水离心洗涤3次用无菌水将菌悬液调至适宜浓度备用；
S2、获得发酵液，所述发酵液是将所述种子悬液转接至所述发酵培养液中，于30～35℃，100～120rpm搅拌条件下通气发酵，发酵36～72h得到；
S3、离心收集，收集发酵完成的发酵液30ml置于无菌的50ml离心管中进行离心，收集上清液；
S4、冻干菌悬液的制备，收集离心的菌体，加入配制好的保护剂涡旋混匀,得到冻干菌悬液,室温放置1h,使保护剂和菌体充分融合；
S5、真空冷冻干燥，于-80℃冰箱预冻2h，取出后立即放入冷冻干燥机中,避免因温度突然上升而致菌体受损。将样品置于冷冻干燥机中持续冻干24h(冷冻干燥机要预先开启,使冷阱温度降至-55℃工作时真空度降至1000Pa)。
本申请实施例中，步骤S1中MRS液体培养基具体为：蛋白陈10g/L,牛肉膏10g/L酵母粉5g/L,磷酸氢二钾2g/L,柠檬酸三2g/L乙酸钠5g/L,吐温-801mL/L,硫酸镁0.2g/L,硫酸0.05g/L,葡萄糖20/L(单独分装灭菌),pH6.5,121C灭菌20min。
本申请实施例中，步骤S2中空气量与罐容积之比为1:0.5～1(v/v.m)。
本申请实施例中，步骤S3中的离心条件为离心条件为4000r/min、10min、4℃，4000r/min、20min、4℃,6 000r/min、10min、4℃，6000r/min、20min、4℃。
本申请实施例中，步骤S4加入的保护剂体积为离心前培养液的1/5。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的菌株Lp-HZ55不管是活菌还是灭活状态，都可以有效调整小鼠肠道菌群结构，提高了结肠炎小鼠肠道菌群多样性，有益菌会生成乳酸和醋酸，保持肠道内酸性，酸性物质刺激，可以加快大肠蠕动，促进排便通畅，从而具有优良的润肠通便效果。此外，本发明的植物乳杆菌还具有显著的提高免疫力的功能。
(2)本发明的菌株在灭活状态也有效，可以显著拓宽菌株的应用场景，具有很大的技术进步。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为植物乳杆菌Lp-HZ55的单菌落照片。
图2为对小鼠体重检测的结果图。
图3为对小鼠体的DAI评分(体重评分+粪便稠度评分+肛门出血评分)结果图。
图4为维恩图。
具体实施方式
为了使本发明专利所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明内容，并不用于限定本发明专利。
实施例1植物乳杆菌的Lp-HZ55的筛选来源说明
申请人从泡菜中进行了大量筛选，筛选得到了数株具有良好保健功能的植物乳杆菌，其中本发明涉及的命名为植物乳杆菌Lp-HZ55。
参照现有技术，对菌株Lp-HZ55的鉴定
形态学鉴定
植物乳杆菌Lp-HZ55菌落为不透明的乳白色圆形凸起状，菌体较小，直径为2.2m左右，无芽孢、无鞭毛，菌落边缘整齐、表面光滑湿润有光泽。显微镜观察为紫色长短不一的杆状结构，为革兰氏阳性杆菌。筛选出来八株生长状态好的革兰氏阳性。附图1是Lp-HZ55在MRS固体培养基上的菌落形态。
生理生化鉴定
依据《伯杰氏细菌鉴定手册》与《常见细菌系统鉴定手册》对菌株Lp-HZ55进行生理生化相应指标测定，具体结果见表1所示，参考菌种鉴定手册可知菌株Lp-HZ55满足乳杆菌属细菌特征，可以初步确定其为乳杆菌属细菌。
表1菌株Lp-HZ55的生理生化特性鉴定结果
分子生物学鉴定
以菌株Lp-HZ55基因组为模板，利用细菌通用引物PCR扩增其16S DNA序列，PCR产物经琼脂糖电泳验证，发现仅有一条单一条带目的，条带大小在1500bp左右，与预期长度一致。将PCR扩增产物送交上海生工进行序列测定,获得的PCR产物测序结果与Genback中的16SrDNA序列进行比对,序列进行比对显示，Lp-HZ55序列与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum strainNWAFU1203,Lactobacillus plantarum strain lp-15)同源性达到99％再结合形态学特征及其生理生化特征，确定菌株Lp-HZ55为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，将菌株Lp-HZ55命名为植物乳杆菌Lp-HZ55，并将其保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No.M 20221778。
实施例2菌株的肠道性能测试
现有技术研究表明，益生菌通过肠胃道后活菌数至少达到105～106CFU/g或mL才会对消费者的健康产生有益的影响。胃肠道耐受能力测定结果见表2，植物乳杆菌Lp-HZ55在经过段时间唾液和胃蛋白酶以及一系列pH梯度处理后，其活菌数并没有太大的改变，表明其在低H(2.3～4.0)的条件下具有较强的耐受力:后经1％胆汁处理10in后，菌株的存活率为79.02％；最后通过0.3％胆汁和0.1％胰酶的共同处理60in，菌株存活率为72.92％，说明菌株Lp-HZ55存活率受胆汁的影响相对来说要更大，但其活菌数仍保持在107CFU/mL以上。结果表明菌株Lp-HZ55对模拟肠胃液具有良好的耐受性。
参考现有技术的检测方法对菌株胃肠道耐受试验：
取18h的菌液6000r/min4℃离心10min，用10mM磷酸盐缓冲液(PhosphateBuffered Saline，PBS pH＝7.0)洗涤两次，备用。将菌沉淀用10mM PBS(pH＝7.0)制备的唾液溶液重悬至初始体积。用HCL调节菌悬液pH梯度,在37℃育1.5h左右。酸处理后将菌悬液离心洗,重悬于1％(wv)的猪胆汁中至初始体积,在37℃下孵育10min；将菌悬液离心洗涤重悬于PBS(0.1MpH8.0)制备的胆汁-胰酶溶液(分别为0.3％和0.1％w/v)中，并在37℃下孵育1h。在不同时间取样并进行菌落计数，试验重复3次。存活率公式如下:
存活率(％)＝logNF/logNO*100
式中:No:初始菌落数；N:最终菌落数
表2胃肠道耐受能力测定
实施例3植物乳杆菌Lp-HZ55在润肠通便方面的应用
本实验采用构建小鼠结肠炎模型来对植物乳杆菌Lp-HZ55在肠道方面的性能进行评价。
本申请实施例还公开了植物乳杆菌Lp-HZZ55菌粉的制备方法。将制备出的菌粉用于润肠通便提高免疫功能。该方法具体包括以下步骤：
制备种子悬液，将-20℃保藏的植物乳杆菌Lp-HZ55的甘油管融化取1mL接种到装有50～100mL MRS液体培养基中，30～35℃静置培养14～16h无菌生理水离心洗涤3次用无菌水将菌悬液调至适宜浓度备用；
获得发酵液，所述发酵液是将所述种子悬液转接至所述发酵培养液中，于30～35℃，100～120rpm搅拌条件下通气发酵，发酵36～72h得到；
离心收集，收集发酵完成的发酵液30ml置于无菌的50ml离心管中进行离心，收集上清液；
冻干菌悬液的制备，收集离心的菌体，加入配制好的保护剂涡旋混匀,得到冻干菌悬液,室温放置1h,使保护剂和菌体充分融合；
真空冷冻干燥，于-80C冰箱预冻2h，取出后立即放入冷冻干燥机中,避免因温度突然上升而致菌体受损。将样品置于冷冻干燥机中持续冻干24h(冷冻干燥机要预先开启,使冷阱温度降至-55C工作时真空度降至1000Pa)。
具体的实例1：
S1、制备种子悬液，将-20℃保藏的植物乳杆菌Lp-HZ55的甘油管融化取1mL接种到装有50～100mL含有蛋白陈10g/L,牛肉膏10g/L酵母粉5g/L,磷酸氢二钾2g/L,柠檬酸三2g/L乙酸钠5g/L,吐温-80 1mL/L,硫酸镁0.2g/L,硫酸0.05g/L,葡萄糖20/L(单独分装灭菌),pH6.5,121C灭菌20min的MRS液体培养基中，30～35℃静置培养14～16h无菌生理水离心洗涤3次用无菌水将菌悬液调至适宜浓度备用；
S2、获得发酵液，所述发酵液是将所述种子悬液转接至所述发酵培养液中(脱脂乳粉(50g/L)、大豆分离蛋白(8g/L)葡萄糖(20g/L)、牛肉膏(8g/L)、NaCl(23g/L)、MgSO4·7H2O(2g/L)、司盘S-80(1g/L)、调节pH＝5.80，121℃灭菌20min)，于30～35℃，100～120rpm搅拌条件下通气发酵，发酵36～72h得到，空气量与罐容积之比为1:0.5～1(v/v.m)。；
S3、离心收集，收集发酵完成的发酵液30ml置于无菌的50ml离心管中进行离心，离心条件为4000r/min、10min、4℃，4 000r/min、20min、4℃,6 000r/min、10min、4℃，6000r/min、20min、4℃，弃去上清液，收集菌泥；
S4、冻干菌悬液的制备，收集离心的菌体，加入配制好的保护剂涡旋混匀,加入的保护剂体积为离心前培养液的1/5，得到冻干菌悬液,室温放置1h,使保护剂和菌体充分融合；
S5、真空冷冻干燥，于-80C冰箱预冻2h，取出后立即放入冷冻干燥机中,避免因温度突然上升而致菌体受损。将样品置于冷冻干燥机中持续冻干24h(冷冻干燥机要预先开启,使冷阱温度降至-55C工作时真空度降至1000Pa)。
灭活菌粉的制备：除将上述步骤S3中得到的上清液在121℃度下处理30分钟，得到灭活菌，其余步骤与上述步骤相同。
对比例1：为此，本申请还提供了一种利用现有的植物乳杆菌，以作为对比例1。其步骤与上述实施例1相同，区别仅在于其发酵所用菌种为Lactobacillus plantarum LP45的保藏号为CGMCCNo.8072，并通过上述步骤，亦得到Lp45菌粉。
动物实验：
本实验选取用的小鼠为5周龄、体重均一的雄性小鼠60只，初始体重为22±2.7g，从北京HFK生物科学有限公司购得。为使小鼠适应周围环境将这60只小鼠适应性饲养一周，饲养条件:湿度4％，在24±2℃的恒定温度下进行黑夜/白天循环，自由饮水、摄食。
实验分组及模型构建：
将60只小鼠随机分组，分为5个组，每组12只，每笼4只，采用剪耳标记。
(1)正常组:自由进食基础饲料和水，不进行任何干预，每天观察小鼠生活情况，每周称量体重并收集粪便。
(2)造模组:自由进食基础日粮和水，从第22天开始至第29天，连续8天，每天饲喂含2.5％(w/v)葡聚糖硫酸钠硫酸葡聚糖溶液40mL，每天称量体重并收集粪便样品。
(3)活菌实施组:自由进食基础日粮和水，从第22天开始至第29天，连续8天，每天饲喂添加含2％(w/v)硫酸葡聚糖溶液40mL和5％质量分数活菌状态植物乳杆菌菌粉Lp-HZ55的饲料；同时，每天称量体重并收集粪便样品。
(4)对比例组:自由进食基础日粮和水，从第22天开始至第29天，连续8天，每天饲喂添加含2％(w/v)硫酸葡聚糖溶液40mL和5％植物乳杆菌Lp45的饲料；同时，每天称量体重并收集粪便样品。
(5)灭活组:自由进食基础日粮和水，从第22天开始至第29天，连续8天，每天饲喂添加含2％(w/v)硫酸葡聚糖溶液40mL和5％质量分数灭活状态植物乳杆菌菌粉Lp-HZ55的饲料；同时，每天称量体重并收集粪便样品。
小鼠肠道组织病理学测试
在第30天，对试验小鼠进行24h的禁食后，在二氧化碳气氛下室息小鼠，同时采用颈椎脱位处死。处死后，取出小鼠结肠，测量长度并进行纪录。用镊子抓住肠缘，取出中段大概1cm的结肠。切除后，检查有无粘膜缺损、出血或溃疡性病变，然后用生理盐水冲洗肠腔，再立即4％多聚甲醛整夜固定过夜，将每笼4只小鼠切除掉的结肠置于50mL EP管中，用于制作结肠石蜡切片并进行HE染色。取出胸腺和脾脏，进行称重，计算免疫器官指数。
血清采集
试验期结束后，对试验小鼠进行24h的禁食后，采用摘眼球法采血2mL放入灭菌离心管中，静置30min，待有血清析出后，以3000rpm离心，收集血清，分装于1.5mL离心管中置于-20℃保存。
粪便样品处理
分别称取大鼠粪便样品各2g,置于装有玻璃珠和200mL 0.1％蛋白胨稀释液的灭菌磨口三角瓶中，剧烈震荡直至粪便样品混匀。然后将粪便样品进行梯度稀释至灭菌的装有9mL 0.1％蛋白胨稀释液的厌氧管内。
实验结果如图2所，正常组小鼠体重基本维持不变，且保持稳定。硫酸葡聚糖溶液处理第4天开始，模型组和对比例组小鼠体重出现明显下降。说明实施例中Lp-HZ55的添加能缓解小鼠体重的降低。疾病活动指数结果如图3所示，硫酸葡聚糖溶液处理第6天开始，硫酸葡聚糖溶液处理的小鼠DAI值增加，但采食Lp-HZ55的小鼠DAI评分一直与正常组差别不大，表明Lp-HZ55对硫酸葡聚糖溶液诱导的小鼠结肠炎表观性状具有抑制作用。同时发现，灭活的植物乳杆菌Lp-HZ55也对小鼠结肠炎有较为显著的抑制效果。
在硫酸葡聚糖溶液诱导的小鼠模型中，典型的结肠炎症表现为结肠长度缩短。我们对不同组小鼠的结肠长度进行了测量，目的是确定植物乳杆菌对结肠炎发展和严重程度的影响，正常组和对比例组结肠长度相差不多，也是最长的，模型组处理组最短，与正常组相比，模型组小鼠的结肠长度显著缩短，而实施例组结肠长度与模型组相比，增加了结肠长度，说明添加植物乳杆菌Lp-HZ55可缓解硫酸葡聚糖溶液诱导引起的小鼠结肠长度降低。
组别 小鼠结肠长度(cm)
正常组 10±0.4
模型组 7.8±0.5
活菌实施组 10.3±0.4
对比例组 9.2±0.5
灭活组 9.8±0.3
对小鼠结肠组织进行HE染色，根据结果可知，模型组小鼠结肠黏膜层局部坏死，纤维组织增生同时伴有炎性细胞浸润，隐窝结构受损，并且肠道完整性也被破坏，局部黏膜下层水肿伴有炎性细胞浸润；而实施例组处理小鼠结肠形态相对完整，没有明显病变。
胸腺作为中枢免疫器官之一，是T细胞分化、发育、成熟的场所；脾脏是成熟淋巴细胞定居的场所，其作为体内产生抗体的主要器官，能够参与免疫激活。由表3可知模型组胸腺指数显著低于正常组。实施例组结果已经与正常组几乎一样。脾脏是主要的免疫器官，也是最大的髓外造血器官。根据脾脏指数可知对比例组和实施例组与模型组相比有所缓解，当然实施例组更显著。表3中同样显示出了血清指标。模型组的免疫球蛋白A(IgA)与正常组相比有所降低，通过喂食植物乳杆菌Lp-HZ55的实施例，的指标已经和正常组相差无几。模型组的免疫球蛋白G(IgG)和免疫球M(IgM)都有所升高，对比例组和实施例组相对缓解，实施例组几乎与正常组无差异。说明植物乳杆菌Lp-HZ55可以提高小鼠的免疫力。同时也测试了灭活组的相关免疫指数，惊奇的发现植物乳杆菌Lp-HZ55灭活以后也有一定的活性，可以在一定程度上提高小鼠免疫力。
通过测试小鼠粪便内生物多样性获得Venn图。由图4可知在正常组，模型组，实施例组和对比例组中共有496个OTUs是相同的，该结果显示存在一个强大的核心微生物群。实施例组显示出最多的独特OTUs(60)个,说明植物乳杆菌Lp-HZ55可以增加小鼠肠道微生物多样性，有益菌会生成乳酸和醋酸，保持肠道内酸性，酸性物质刺激，可以加快大肠蠕动，促进排便通畅，从而具有优良的润肠通便效果。此外，本发明的植物乳杆菌还具有显著的提高免疫力的功能，可能的原因比较复杂，原因之一可能是良好的肠道菌群结构会提升肠道免疫功能。
表3各组免疫指数统计
以上结果表明植物乳杆菌Lp-HZ55通过调整小鼠肠道菌群结构，提高了结肠炎小鼠肠道菌群多样性，抑制了肠道内致病菌的丰度，抑制了由DSS诱导结肠炎引起的肠道菌群多样性降低、结构和组成紊乱等现象，而提高了结肠炎小鼠肠道菌群多样性，有益菌会生成乳酸和醋酸，保持肠道内酸性，酸性物质刺激，可以加快大肠蠕动，促进排便通畅，从而具有优良的润肠通便效果。同时植物乳杆菌Lp-HZ55能刺激小鼠免疫器官细胞的增殖，从而进免疫器官发育，提高免疫器官指数，增强机体免疫力，完善免疫系统。
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一株具有润肠通便和提高免疫力功能的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Lp-HZ55，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.M 20221778，分类命名为植物乳杆菌，保藏日期为2022年11月14。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌Lp-HZ55在制备润肠及通便方面制品上的应用。
3.根据权利要求1所述的植物乳杆菌Lp-HZ55在制备提高免疫力方面制品的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其中植物乳杆菌Lp-HZ55为活菌或者灭活状态。
5.根据权利要求1所述的具有润肠通便和提高免疫力功能的植物乳杆菌Lp-HZ55的菌粉的制备方法，其特征在于步骤如下：
S1、制备种子悬液，将-20℃保藏的植物乳杆菌Lp-HZ55的甘油管融化取1mL接种到装有50～100mL MRS液体培养基中，30～35℃静置培养14～16h无菌生理水离心洗涤3次用无菌水将菌悬液调至适宜浓度备用；
S2、获得发酵液，所述发酵液是将所述种子悬液转接至所述发酵培养液中，于30～35℃，100～120rpm搅拌条件下通气发酵，发酵36～72h得到；
S3、离心收集，收集发酵完成的发酵液30ml置于无菌的50ml离心管中进行离心，收集上清液；
S4、冻干菌悬液的制备，收集离心的菌体，加入配制好的保护剂涡旋混匀,得到冻干菌悬液,室温放置1h,使保护剂和菌体充分融合；
S5、真空冷冻干燥，于-80℃冰箱预冻2h，取出后立即放入冷冻干燥机中,避免因温度突然上升而致菌体受损。将样品置于冷冻干燥机中持续冻干24h，所述冷冻干燥机要预先开启,使冷冻温度降至-55℃工作时真空度降至1000Pa。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤S1中MRS液体培养基具体为：蛋白陈10g/L,牛肉膏10g/L酵母粉5g/L,磷酸氢二钾2g/L,柠檬酸三2g/L乙酸钠5g/L,吐温-801mL/L,硫酸镁0.2g/L,硫酸0.05g/L,葡萄糖20/L，pH＝6.5,121C灭菌20min。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤S2中空气量与罐容积之比为1:0.5～1(v/v.m)。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤S3中的离心条件为4000r/min、10min、4℃，4 000r/min、20min、4℃,6 000r/min、10min、4℃，6000r/min、20min、4℃。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤S4加入的保护剂体积为离心前培养液的1/5。
10.一种食品或药品，其含有权利要求1-4所述的植物乳杆菌Lp-HZ55。
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