CN110484459A - 一株植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株植物乳杆菌及其应用，属于乳杆菌属的新菌株及其应用技术领域。本发明所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)nbk‑BC299，保藏编号为：CGMCC NO.16871。本发明的植物乳杆菌nbk‑BC299的菌粉和灭活菌粉均可有效增重小鼠体重；均能通过提高小鼠特异性细胞免疫，特异性体液免疫以及非特异性免疫等方面来提高小鼠免疫力；均能提高免疫细胞免疫活性，提高血清中抗体及多种细胞因子含量，有效增强免疫力低下小鼠的免疫力；另外，植物乳杆菌nbk‑BC299有良好的酸和胆盐耐受性，可保证足够数量的活菌到达肠道，发挥益生作用。
Description
技术领域
本发明涉及乳杆菌属的新菌株及其应用技术领域，尤其涉及一株植物乳杆菌及其应用。
背景技术
随着生活压力的不断增加，饮食作息等的不合理化，国民的身体状况大多处于亚健康状态。提高免疫力对摆脱亚健康状态、预防疾病等具有重要影响。而影响机体免疫力下降的因素很多，主要表现在机体的皮肤、黏膜等与机体免疫的第一屏障被破坏；自身心理因素，消极悲观的性格都会影响机体的免疫系统，造成免疫力低下；身体缺乏锻炼、过度疲劳也会对免疫系统产生影响；年龄的增长，身体的老化造成机体免疫反应下降；不合理的饮食，导致机体可能缺乏必要的营养物质，例如必需的氨基酸和维生素。
近年来，许多研究表明乳酸菌对机体有多种益生作用，包括免疫调节、改善过敏、调节肠道菌群的平衡，预防肠道疾病的发生和降低胆固醇的功能，尤其对乳酸菌的免疫调节增强免疫力能力最为突出。
但是现有技术公开的乳酸菌提高机体免疫力的效果较为单一，缺乏一种既能提高正常机体的免疫力，又能增强免疫力低下机体的免疫力的乳酸菌。
发明内容
本发明的目的在于提供一株植物乳杆菌及其应用，该植物乳杆菌既能提高正常机体的免疫力，又能增强免疫力低下机体的免疫力。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)nbk-BC299，保藏编号为：CGMCC NO.16871。
本发明提供了一种包括上述方案所述植物乳杆菌的制剂。
优选的，所述制剂中植物乳杆菌的浓度为1×109～4×1011cfu/g。
优选的，所述植物乳杆菌为活菌或灭活菌。
优选的，所述制剂的粒径为15～100目。
本发明还提供了上述方案所述制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将植物乳杆菌nbk-BC299接种至种子培养基，进行活化，得到一级种子液；
2)将步骤1)所述一级种子液接种至种子培养基，进行培养，得到二级种子液；
3)将步骤2)所述二级种子液接种至发酵培养基，进行发酵，离心发酵液，得到菌体；
4)对步骤3)所述菌体进行干燥、粉碎，得到制剂。
优选的，所述种子培养基包括以下质量百分数的原料：1％～3％葡萄糖、1％～1.5％蛋白胨、0.3％～0.8％酵母浸膏、0.3％～0.8％无水乙酸钠、0.2％～0.6％柠檬酸铵、0.01％～0.03％硫酸镁、0.04％～0.08％硫酸锰、0.05％～0.15％吐温80和余量的水；或者，所述发酵培养基包括以下质量百分数的原料：10％～15％蛋白酶解多肽、1.5％～2.5％葡萄糖、1.5％～2.5％蛋白胨、1％～2％酵母浸膏、0.4％～0.6％无水乙酸钠、0.4％～0.6％柠檬酸铵、0.04％～0.06％硫酸镁、0.04％～0.06％硫酸锰、0.06％～0.08％吐温80和余量的水；
所述种子培养基pH值为6.5～6.8。
本发明还提供了上述方案所述制剂在制备增加机体体重中的药品、饲料或饲料添加剂中的应用；所述制剂中的植物乳杆菌为活菌或灭活菌。
本发明还提供了上述方案所述制剂在制备增强机体免疫力的药品、食品、饲料或饲料添加剂中的应用；所述制剂中的植物乳杆菌为活菌或灭活菌。
本发明的有益效果：本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)nbk-BC299，保藏编号为：CGMCC NO.16871。该植物乳杆菌nbk-BC299的菌粉和灭活菌粉均可有效增重小鼠体重；并且，植物乳杆菌nbk-BC299的菌粉和灭活菌粉均能通过提高小鼠特异性细胞免疫，特异性体液免疫以及非特异性免疫等方面来提高小鼠免疫力；其次，植物乳杆菌nbk-BC299菌粉及其灭活菌粉能提高免疫细胞免疫活性，提高血清中抗体及多种细胞因子含量，能有效增强免疫低下小鼠免疫力；另外，植物乳杆菌nbk-BC299有良好的酸和胆盐耐受性，有足够数量的活菌可以到达肠道，发挥益生作用。
附图说明
图1表示实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉小鼠免疫器官指数的影响；
图2表示实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠血液白细胞总数的影响；
图3表示实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠血清细胞因子的影响；
图4表示实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠体重的影响；
图5表示实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠血液中白细胞总数的影响；
图6表示实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠血清细胞因子含量的影响；
图7表示实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠血清TNF-α及INF-γ含量的影响；
图8表示实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠血清IgG的影响。
生物保藏说明
植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)nbk-BC299，于2018年12月05日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCC NO.16871。
具体实施方式
本发明提供了一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)nbk-BC299，保藏编号为：CGMCC NO.16871；所述植物乳杆菌nbk-BC299是从武汉当地居民家中采集的自然发酵的酸白菜中分离、鉴定获得，本发明对所述分离的方法没有特殊限定，采用本领域常规菌株分离方法即可；所述鉴定的方法优选为分子生物学鉴定，更优选为16S全长测序。
本发明提供了一种包括上述方案所述植物乳杆菌的制剂，所述制剂中植物乳杆菌的浓度优选为1×109～4×1011cfu/g，更优选为2×109～3×1010cfu/g；所述制剂的粒径优选为15～100目，更优选为20～80目；本发明的具体实施过程中，所述植物乳杆菌为活菌或灭活菌。
本发明还提供了上述方案所述制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将植物乳杆菌nbk-BC299接种至种子培养基，进行活化，得到一级种子液；
2)将步骤1)所述一级种子液接种至种子培养基，进行培养，得到二级种子液；
3)将步骤2)所述二级种子液接种至发酵培养基，进行发酵，离心发酵液，得到菌体；
4)对步骤3)所述菌体进行干燥、粉碎，得到制剂。
本发明首先将植物乳杆菌接种至种子培养基，进行活化，得到一级种子液；本发明对所述植物乳杆菌的接种量没有特殊限制；所述种子培养基优选的包括以下质量百分数的原料：1％～3％葡萄糖、1％～1.5％蛋白胨、0.3％～0.8％酵母浸膏、0.3％～0.8％无水乙酸钠、0.2％～0.6％柠檬酸铵、0.01％～0.03％硫酸镁、0.04％～0.08％硫酸锰、0.05％～0.15％吐温80和余量的水；更优选的，所述种子培养基包括以下质量百分数的原料：1.5％～2.5％葡萄糖、1％～1.3％蛋白胨、0.5～0.8％％酵母浸膏、0.5％～0.7％无水乙酸钠、0.4％～0.5％柠檬酸铵、0.02％硫酸镁、0.06％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水；所述种子培养基的pH值优选为6.5～6.8，更优选为6.6～6.7。本发明中，所述活化的条件为厌氧条件；所述活化的温度优选为30～42℃，更优选为32～38℃，最优选为35～37℃；所述活化的时间优选为10～24h，更优选为12～22h，最优选为13～20h。
本发明在得到一级种子液后，将一级种子液接种至种子培养基，进行培养，得到二级种子液；所述一级种子液的接种量在种子培养基所占的体积百分比优选为2％～5％，更优选为2％～4％；所述培养的方式优选为厌氧培养；所述培养的温度优选为30～38℃，更优选为33～37℃；所述培养的时间优选为13～18h，更优选为14～16h；所述培养的设备优选为发酵罐；所述培养的作用是进一步扩大植物乳杆菌的活菌数，为下一步发酵做好准备。
本发明在得到二级种子液后，将二级种子液接种至发酵培养基，进行发酵，离心发酵液，得到菌体；所述二级种子液的接种量优选为在种子培养基所占的体积百分比优选为2％～6％，更优选为3％～5％；所述发酵优选为厌氧发酵；所述发酵的温度优选为35～40℃，更优选为36～38℃；所述发酵的时间优选为6～10h，更优选为7～8h；所述发酵的作用是显著提高菌体密度，同时降低生产设备的成本，满足提高比生产率、降低生产成本、加快产品商品化进程的竞争需求；所述离心的时间优选为20～40min，更优选为30min；所述离心的温度优选为0～8℃，更优选为2～6℃。
本发明中，所述发酵培养基优选的包括以下质量百分数的原料：1％～3％葡萄糖、0.5％～1.5％蛋白胨、0.3％～0.8％酵母浸膏、0.3％～0.8％无水乙酸钠、0.1％～0.3％柠檬酸铵、0.04％～0.08％硫酸镁、0.01％～0.03％硫酸锰、0.05％～0.15％吐温80和余量的水；或者，所述发酵培养基优选包括以下质量百分数的原料：1.5％～2.5％葡萄糖、1.5％～2.5％蛋白胨、1％～2％酵母浸膏、0.4％～0.6％无水乙酸钠、0.4％～0.6％柠檬酸铵、0.04％～0.06％硫酸镁、0.04％～0.06％硫酸锰、0.06％～0.08％吐温80和余量的水；所述发酵培养基的pH值优选为6.3～6.5，更优选为6.4。本发明提供的发酵培养基适宜大规模工业化生产，满足高密度发酵时的微生物营养需求。
本发明具体实施过程中，所述发酵液中的活菌数≥1×109cfu/mL时，即可停止发酵；所述发酵液中活菌数的测定方法优选的依据GB4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》绘制生长曲线，根据生长曲线进行判定；所述测定的频率优选为发酵3h后每小时测定一次。
当本发明中所述制剂中的植物乳杆菌为活菌时，将得到的菌体与冻干保护剂混合，进行乳化包埋，得到乳化液；所述菌体与冻干保护剂的质量比优选为1:0.8～1.5，更优选为1:1～1.2；所述冻干保护剂优选的包括以下质量份的原料：脱脂乳1～3份、甘油水溶液1～5份和水3～10份，更优选的，所述冻干保护剂包括以下质量份的原料：脱脂乳2份、甘油水溶液2～3份和水5～8份；所述脱脂乳中脱脂奶粉的质量百分含量优选为8％～15％，更优选为10％～12％；所述甘油水溶液中甘油的体积百分含量优选为3％；所述脱脂粉和甘油来源于市售。
本发明中，所述乳化包埋的时间优选为10～40min，更优选为20～30min；所述乳化包埋的温度优选为10～25℃，更优选为15～20℃。
本发明中，将菌体进行乳化包埋的目的在于保护植物乳杆菌的活性，降低后续的冷冻干燥步骤对植物乳杆菌活菌数和活性的影响。
本发明在获得乳化液后，对乳化液进行预冷冻、真空冷冻干燥、粉碎，得到制剂；所述预冷冻的温度优选为-40～-35℃，更优选为-38℃；所述预冷冻的时间优选为1～3h，更优选为2h；所述真空冷冻干燥的温度优选为-40℃～-10℃，更优选为-30℃～-20℃；所述真空冷冻干燥的时间优选为12～60h，更优选为20～40h，最优选为25～35h；所述真空冷冻干燥的真空度优选为0.1～0.3mbar，更优选为0.2mbar；本发明对所述粉碎的时间、温度和设备没有特殊限制，以粉碎后的制剂的粒径为15～100目即可。
当本发明中所述制剂中的植物乳杆菌为灭活菌时，将得到的菌体干燥、粉碎，得到制剂；所述干燥的温度优选为40～50℃，更优选为45℃；所述干燥的时间优选为3～7d，更优选为4～5d；本发明对所述粉碎的时间、温度和设备没有特殊限制，以粉碎后的制剂的粒径为15～100目即可。
本发明还提供了上述方案所述所述制剂在制备增加机体体重中的药品、饲料或饲料添加剂中的应用；所述机体包括免疫力正常机体和免疫力低下机体；所述制剂中的植物乳杆菌为活菌或灭活菌。
本发明还提供了上述方案所述植物乳杆菌或所述制剂在制备增强机体免疫力的药品、食品、饲料或饲料添加剂中的应用；所述机体包括免疫力正常机体和免疫力低下机体；所述增强机体免疫力优选的包括增加机体免疫器官的指数、增加机体血液中白细胞总数、降低机体免疫系统的损伤、提高正常机体特异性细胞免疫功能、调节免疫低下机体特异性体液免疫和非特异性免疫功能；所述制剂中的植物乳杆菌为活菌或灭活菌。
下面结合实施例对本发明提供的一株植物乳杆菌及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1植物乳杆菌nbk-BC299的筛选及鉴定
采集自然发酵的酸白菜(武汉当地居民家中采集)，经研磨后，无菌生理盐水稀释至适当梯度(103～107)，于MRS琼脂平板上采用四区划线法划线后，在37℃培养箱中厌氧培养48h。挑选单菌落，镜检，划线，进一步纯化得到植物乳杆菌nbk-BC299。经鉴定(鉴定方法为16S全长测序)为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌nbk-BC299。
实施例2一种包含植物乳杆菌nbk-BC299活菌的菌粉的制备方法
按质量百分数计，种子培养基：2％葡萄糖、1.2％蛋白胨、0.5％酵母浸膏、0.5％无水乙酸钠、0.4％柠檬酸铵、0.02％硫酸镁、0.06％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水，pH值6.5。
按质量百分数计，发酵培养基：2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.5％酵母浸膏、0.5％无水乙酸钠、0.2％柠檬酸铵、0.06％硫酸镁、0.02％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水，pH值为6.4。
按质量份计，冻干保护剂：10％脱脂乳2份、3％甘油2份和水5份。
制备方法
1)将植物乳杆菌接种到装有种子培养基的试管中活化(37℃，16h)，得到一级种子液；
2)将一级种子液按照质量百分比为3％的接种量转接至种子培养基中得到二级种子液，培养条件为37℃，厌氧培养15h；
3)将二级种子液接入发酵培养基中进行高密度发酵，二级种子液接至发酵培养基中的接种量为5％(质量百分比)，培养条件为36℃，厌氧培养8h，待发酵液中菌体密度达到1×109cfu/mL，收集发酵液，离心(8000r/min，30min)获得菌体；
4)将菌体加入保护剂(菌体:保护剂的质量比为1:1.2)进行乳化包埋，乳化时间25min；
5)将乳化液在-38℃下预冷冻2h，将预冷冻后的乳化液进行真空冷冻干燥(48h，-20℃)，真空度为0.2mbar；真空冷冻干燥后将其粉碎至20目，得到制剂，所得制剂的活菌数为3.2×1011cfu/g。
实施例3一种包含植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌的灭活菌粉的制备方法
按质量百分数计，种子培养基：2％葡萄糖、1.2％蛋白胨、0.5％酵母浸膏、0.5％无水乙酸钠、0.4％柠檬酸铵、0.02％硫酸镁、0.06％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水，pH值6.8。
按质量百分数计，发酵培养基：2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.5％酵母浸膏、0.5％无水乙酸钠、0.2％柠檬酸铵、0.06％硫酸镁、0.02％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水，pH值为6.4。
制备方法：
1)将植物乳杆菌接种到装有种子培养基的试管中活化(37℃，16h)，得到一级种子液；
2)将一级种子液按照质量百分比为3％的接种量转接至种子培养基中得到二级种子液，培养条件为37℃，厌氧培养15h；
3)将二级种子液接入发酵培养基中进行高密度发酵，二级种子液接至发酵培养基中的接种量为5％(质量百分比)，培养条件为36℃，厌氧培养8h，待发酵液中菌体密度达到109cfu/mL，收集发酵液，离心(8000r/min，30min)获得菌体；
4)将菌体进行干燥，干燥温度为45℃(3d)；干燥后将其粉碎至20目，得到植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉。
实施例4实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉在提高正常小鼠免疫力中的应用
1.试验材料：
实验动物：SPF级BALB/c雄性小鼠30只，18～22g；
试验对象：以实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉为样品。
2.动物分组、造模及给药方法
30只SPF级BALB/c雄性小鼠，按体重随机分为3组，实验期间灌胃方案如下：
A)空白对照组：每天灌胃生理盐水0.1mL/10g.bw，连续30d。
B)nbk-BC299灭活菌粉组：称取0.01g nbk-BC299灭活菌粉于320mL无菌生理盐水中，即得nbk-BC299灭活菌粉灌胃液，灌胃剂量为0.1mL/10g.bw，连续30d；
C)nbk-BC299菌粉组：称取0.01g nbk-BC299菌粉于320mL无菌生理盐水中，即得nbk-BC299菌粉灌胃液，灌胃剂量为0.1mL/10g.bw，连续30d。
3.实验期间记录小鼠体重和精神面貌，实验结束后，禁食不禁水12h后，摘眼球取血法处死小鼠，采取迟发性超敏反应(delay type hyper—sensitivity，DTH)测定小鼠耳片肿胀度、测试小鼠巨噬细胞吞噬能力，测定小鼠免疫器官指数，测定小鼠血液中白细胞数等指标。脾脏与胸腺作为体内的主要免疫器官，其脏器指数对于巨噬细胞的吞噬活性、细胞免疫及体液免疫等功能具有重要影响。胸腺和脾脏指数能反映免疫器官发育和免疫细胞的功能状况，从而间接反映了机体的免疫水平；白细胞计数能反映免疫系统的损伤程度；细胞因子是机体活化的淋巴细胞产生的免疫活性物质，具有免疫调节特性，在免疫系统中发挥重要的作用。细胞因子分泌量的多少，在一定程度上能够反映机体免疫系统免疫应答的水平和状态。
4.实验结果参见表1～表4和图1～图3，其中图1表示实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉小鼠免疫器官指数的影响；图2表示实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠血液白细胞总数的影响；图3表示实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠血清细胞因子的影响。
由图1的结果可以看出，实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉均能显著增加小鼠免疫器官的指数。
由图2的结果可知，与空白组相比，实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉均能增加小鼠血液中白细胞总数，说明实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉能有效降低免疫系统的损伤程度，起到调节免疫的作用。
图3的实验结果表明，实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉能显著增加小鼠血清中IL-2的含量，实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉还能显著增加小鼠血清中IL-10的含量，但是实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠血清中IL-6的含量无显著影响。表明，实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠血清细胞因子的含量有一定的调节作用。
表1实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠体重的影响
注：*表示与空白组相比P＜0.05。
由表1的结果可知，实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉均可有效增重小鼠体重。
表2实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对DNFB致小鼠DTH的影响
注：*表示与空白组比较，P<0.05；**表示与空白组比较，P<0.01。
表2结果显示：灌胃nbk-BC299菌粉组以及nbk-BC299灭活菌粉组后，小鼠耳片肿胀度有不同程度提高，其中灌胃nbk-BC299菌粉组小鼠耳片肿胀度增加极显著(P<0.01)，灌胃nbk-BC299灭活菌粉组小鼠耳片肿胀度增加显著(P<0.05)，且两组之间有显著性差异(P<0.05)，说明实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉均可提高正常小鼠特异性细胞免疫功能。
表3植物乳杆菌nbk-BC299菌粉及其灭活菌体对正常小鼠血清溶血素生成的影响
注：*表示与空白相比P<0.05。
如表3所示，灌胃nbk-BC299菌粉组以及nbk-BC299灭活菌粉组后，小鼠的半数溶血值(HC50)与空白组相比较有不同程度的增加，其中灌胃nbk-BC299菌粉组半数溶血值(HC50)显著增加(P<0.05)，灌胃nbk-BC299灭活菌粉组小鼠半数溶血值(HC50)显著增加(P<0.05)，且两组之间无显著性差异(P>0.05)，说明实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉均可调节免疫低下小鼠特异性体液免疫。
表4植物乳杆菌nbk-BC299菌粉及其灭活菌粉对正常小鼠单核巨噬细胞吞噬功能的影响
注：*表示实验组与空白比较P<0.05。
如表4所示，灌胃植物乳杆菌nbk-BC299菌粉组以及nbk-BC299灭活菌粉组后，与空白组比较，小鼠单核巨噬细胞碳粒廓清指数K，吞噬指数α均显著增加(P<0.05)，说明实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉均能提高免疫低下小鼠非特异性免疫功能。
综上所述，实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉通过提高小鼠特异性细胞免疫，特异性体液免疫以及非特异性免疫等方面来提高小鼠免疫力。
实施例5实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉在增强免疫低下小鼠免疫力中的应用
1、试验材料：
实验动物：SPF级BALB/c雄性小鼠50只，4～6周龄，18～22g；
试验对象：以实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉为样品。
2、动物分组、造模及给药方法
空白组小鼠腹腔注射生理盐水0.1mL/10g.bw，持续3d；实验组及模型组小鼠腹腔注射环磷酰胺80mg·kg-1·d-1，注射量为0.1mL/10g.bw，持续3d，造成免疫低下模型。
A)空白对照组：每天灌胃生理盐水0.1mL/10g.bw，连续14d。
B)模型组：每天灌胃生理盐水0.1mL/10g.bw，连续14d；
C)nbk-BC299灭活菌粉组：称取0.01g nbk-BC299灭活菌粉于320mL无菌生理盐水中，即得nbk-BC299灭活菌粉灌胃液，灌胃剂量为0.1mL/10g.bw，连续14d；
D)nbk-BC299菌粉组：称取0.01g nbk-BC299菌粉于320mL无菌生理盐水中，即得nbk-BC299菌粉灌胃液，灌胃剂量为0.1mL/10g.bw，连续14d；
在实验期间每天记录各组小鼠体重和精神状态。
3、指标测定：灌胃2周后，称重，摘眼球取血处死小鼠，收集小鼠血液，测定小鼠白细胞总数、巨噬细胞吞噬能活性、NK细胞活性、血清中相关细胞因子和IgG含量。NK细胞是机体重要的细胞毒性淋巴细胞，能通过释放细胞因子对机体进行免疫功能调节，植物乳杆菌nbk-BC299菌粉及其灭活菌粉能增强NK细胞的杀伤活性，对提高机体的免疫反应起到极其重要的作用；单核-巨噬细胞吞噬活性时衡量机体非特异性免疫功能的重要标志之一；细胞因子是机体活化的淋巴细胞产生的免疫活性物质，具有免疫调节特性，在免疫系统中发挥重要的作用。细胞因子分泌量的多少，在一定程度上能够反映机体免疫系统免疫应答的水平和状态。
4、试验结果参见表5和图4～8。其中图4表示实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠体重的影响；图5表示实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠血液中白细胞总数的影响；图6表示实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠血清细胞因子含量的影响；图7表示实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠血清TNF-α及INF-γ含量的影响；图8表示实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠血清IgG的影响。
从图4的结果可以看出，在造模结束后，实验组和模型组小鼠相比于空白组，体重均有下降，随着nbk-BC299菌粉组合灭活菌粉组灌胃时间的延长，实验组小鼠的体重逐渐恢复至接近空白组小鼠的水平，而模型组小鼠的体重呈现出下降趋势，表明植物乳杆菌nbk-BC299菌粉及其灭活菌粉对免疫低下小鼠的体重均有一定的恢复作用。
从图5的结果可以看出，植物乳杆菌nbk-BC299菌粉及其灭活菌粉能显著增加免疫低下模型小鼠体内的白细胞总数。
图6的实验结果表明，植物乳杆菌nbk-BC299菌粉及其灭活菌粉能显著增加小鼠血清中IL-4、IL-10和IL-12的含量，表明nbk-BC299菌粉及其灭活菌粉对小鼠血清细胞因子的含量有一定的调节作用。
从图7的结果可以看出，植物乳杆菌nbk-BC299菌粉及其灭活菌粉能显著降低模型小鼠血清TNF-α含量，增加INF-γ含量，有调节小鼠血清炎症因子含量的作用。
从图8的结果可以看出，植物乳杆菌nbk-BC299菌粉及其灭活菌粉能显著增加模型小鼠血清IgG抗体含量，提高机体免疫应答能力。
注：同系列之间相同字母表示差异不显著，不同字母则表示差异显著，P<0.05。
表5实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉和实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉对小鼠NK细胞吞噬活性和巨噬细胞吞噬能力的影响
注：同列之间相同字母表示差异不显著，不同字母则表示差异显著，P<0.05
由表5的结果可以看出，植物乳杆菌nbk-BC299菌粉及其灭活菌粉对巨噬细胞的吞噬活性有显著提升能力，表明植物乳杆菌nbk-BC299菌粉及其灭活菌粉有活化巨噬细胞的作用，从而提高小鼠的非特异性免疫功能。
综上所述，经腹腔注射环磷酰胺后，小鼠各指标都出现显著性差异(P<0.05)，表明免疫低下小鼠模型建立成功。植物乳杆菌nbk-BC299菌粉及其灭活菌粉能提高免疫细胞免疫活性，提高血清中抗体及多种细胞因子含量，能有效增强免疫低下小鼠免疫力。
实施例6实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉在发酵胡萝卜汁中的应用
按质量分数百分比计，30％浓缩胡萝卜汁、70％软化水。接种发酵剂，植物乳杆菌nbk-BC299：保加利亚乳杆菌nbk-lb001的活菌数的比例为10:1，接种量为1×107CFU/mL。混匀，37℃厌氧发酵24h，最终pH3.60，发酵终止，即得到具有增强免疫功能的发酵胡萝卜汁。
实施例7实施例3的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉在制备固体饮料中的应用
以质量百分数计，将实施例2制备的植物乳杆菌nbk-BC299灭活菌粉2％、低聚果糖10％、低聚木糖10％、赤藓糖醇32％和抗性糊精46％进行混合，得到具有增强免疫功能的复合益生菌制剂。
实施例8实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉的耐酸特性
将实施例1得到的nbk-BC299菌粉分别以2％(w/v)的接种量接于pH为6.0和pH为2.0的MRS培养基中培养3h后采用平板计数法进行活菌计数，结果参见表6。
表6实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉的耐酸特性验证结果
由表6可以看出，在pH 2.0的条件下，植物乳杆菌nbk-BC299在3h后仍有足够数量的活菌可以通过胃部环境。
实施例9实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉的耐胆盐特性
将实施例1得到的nbk-BC299菌粉分别以2％(w/v)的接种量接于胆盐浓度为0％(w/v)和胆盐浓度为0.4％的MRS培养基中培养3h后采用平板计数法进行活菌计数，结果参见表7。
表7实施例2的植物乳杆菌nbk-BC299菌粉的耐胆盐特性验证结果
由表7可以看出，在0.4％的胆盐浓度下，植物乳杆菌nbk-BC299有较好的胆盐耐受性。
结合实施例8和实施例9的结果可以看出，植物乳杆菌nbk-BC299有良好的酸和胆盐耐受性，有足够数量的活菌可以到达肠道，发挥益生作用。
由以上实施例可知，本发明提供了一株植物乳杆菌nbk-BC299，该植物乳杆菌nbk-BC299的菌粉和灭活菌粉均可有效增重小鼠体重；并且，植物乳杆菌nbk-BC299的菌粉和灭活菌粉均能通过提高小鼠特异性细胞免疫，特异性体液免疫以及非特异性免疫等方面来提高小鼠免疫力；其次，植物乳杆菌nbk-BC299菌粉及其灭活菌粉能提高免疫细胞免疫活性，提高血清中抗体及多种细胞因子含量，能有效增强免疫低下小鼠免疫力；另外，植物乳杆菌nbk-BC299有良好的酸和胆盐耐受性，有足够数量的活菌可以到达肠道，发挥益生作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)nbk-BC299，保藏编号为：CGMCCNO.16871。
2.一种包括权利要求1所述植物乳杆菌的制剂。
3.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于，所述制剂中植物乳杆菌的浓度为1×109～4×1011cfu/g。
4.根据权利要求2或3所述的制剂，其特征在于，所述植物乳杆菌为活菌或灭活菌。
5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述制剂的粒径为15～100目。
6.权利要求2～5任意一项所述制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将植物乳杆菌nbk-BC299接种至种子培养基，进行活化，得到一级种子液；
2)将步骤1)所述一级种子液接种至种子培养基，进行培养，得到二级种子液；
3)将步骤2)所述二级种子液接种至发酵培养基，进行发酵，离心发酵液，得到菌体；
4)对步骤3)所述菌体进行干燥、粉碎，得到制剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括以下质量百分数的原料：1％～3％葡萄糖、1％～1.5％蛋白胨、0.3％～0.8％酵母浸膏、0.3％～0.8％无水乙酸钠、0.2％～0.6％柠檬酸铵、0.01％～0.03％硫酸镁、0.04％～0.08％硫酸锰、0.05％～0.15％吐温80和余量的水；
所述种子培养基pH值为6.5～6.8。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下质量百分数的原料：1％～3％葡萄糖、0.5％～1.5％蛋白胨、0.3％～0.8％酵母浸膏、0.3％～0.8％无水乙酸钠、0.1％～0.3％柠檬酸铵、0.04％～0.08％硫酸镁、0.01％～0.03％硫酸锰、0.05％～0.15％吐温80和余量的水；或者，所述发酵培养基包括以下质量百分数的原料：10％～15％蛋白酶解多肽、1.5％～2.5％葡萄糖、1.5％～2.5％蛋白胨、1％～2％酵母浸膏、0.4％～0.6％无水乙酸钠、0.4％～0.6％柠檬酸铵、0.04％～0.06％硫酸镁、0.04％～0.06％硫酸锰、0.06％～0.08％吐温80和余量的水；
所述发酵培养基的pH值为6.3～6.5。
9.权利要求2～5任意一项所述制剂在制备增加机体体重中的药品、饲料或饲料添加剂中的应用；所述制剂中的植物乳杆菌为活菌或灭活菌。
10.权利要求2～5任意一项所述制剂在制备增强机体免疫力的药品、食品、饲料或饲料添加剂中的应用；所述制剂中的植物乳杆菌为活菌或灭活菌。
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| GR01 | Patent grant | ||
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