CN104694409B - 植物乳杆菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了植物乳杆菌及其用途，具体公开了植物乳杆菌及其在制备药物或食品中的用途、药物及食品，其中，该植物乳杆菌于2013年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位的地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2013391，保藏名称为植物乳杆菌Y‑9Lactobacillus plantarum Y‑9。本发明的植物乳杆菌具有优异的益生作用，耐酸和耐胆盐能力，能够长期保存，并能够有效用于降低血中胆固醇、降血压、提高免疫力、减肥或调节肠道菌群。

Description

植物乳杆菌及其用途
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体地，涉及植物乳杆菌及其用途，更具体，涉及植物乳杆菌及其在制备药物或食品中的用途、药物及食品。
背景技术
随着现代人类饮食习惯的不断变化，使摄入高脂质食物的量在整个饮食结构中占有较高的比例。再加上近年来出现的环境污染、工作学习压力大等问题，进而带来的高脂血症、高血压、免疫力降低、肥胖、肠道菌群失衡等疾病已经严重危害到人体健康。
肠道微生物的来源可分为原籍菌、外籍菌及共生菌群。它们与宿主环境形成相互依赖、相互制约的统一体。在人体肠道内永久定居的微生物群对人类健康的影响极其深远，小到消化道内环境、消化问题，大到胖瘦问题、高血脂、高血压、免疫力降低、肠道菌群紊乱等，人类的生命健康已经与它们息息相关。在正常生理情况下，主要表现为有益于宿主的微生物群落，但在病理情况下，也可能表现为对宿主有害的微生物群落。一个健康成人肠内拥有约4400多种微生物，其中99％微生物仅由30～40种细菌构成，主要为拟杆菌、双歧杆菌属、梭状芽孢杆菌、肠道球菌、真杆菌、梭形杆菌属、消化链球菌属、乳酸菌及埃希杆菌属等。肠道正常微生物群定植在宿主肠道粘膜，随宿主长期进化而形成。功能性乳酸菌及相关产品，可以改善肠道微生物组成，增加肠道蠕动，减少肠道内腐败物质，使排便处于理想状态，促进及维护肠道健康。
然而，关于具有益生功能的乳酸菌及相关产品的研究仍有待深入。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有较强耐酸耐胆盐能力，具有降胆固醇、降血压、提高免疫力、减肥、调节肠道菌群功效的植物乳杆菌及其在制备药物或食品中的用途。
因而，在本发明的第一方面，本发明提出了一种植物乳杆菌，其于2013年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位的地址为中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO:M2013391，保藏名称为植物乳杆菌Y-9Lactobacillus plantarum Y-9。根据本发明的实施例，本发明的植物乳杆菌不仅具有优异的益生作用，而且其耐酸和耐胆盐能力优异，即使在动物肠道内也能够发挥优异的益生作用，进而，对动物提供本发明的植物乳杆菌，其能够有效发挥降低血中胆固醇、降血压、提高免疫力、减肥、调节肠道菌群等功效。另外，本发明的植物乳杆菌保存后的生存性较高，因而本发明的植物乳杆菌能够长期保存。
需要说明的是，在本文中所使用的术语“动物”所指的动物种类不受特别限制。根据本发明的实施例，该动物可以为任何具有肠道器官的动物，优选哺乳动物，更优选大鼠、小鼠、人，最优选人。
在本发明的第二方面，本发明提供了所述植物乳杆菌在制备药物或食品中的用途。根据本发明的实施例，对动物提供本发明的植物乳杆菌，能够有效降低其血中胆固醇含量，降低其血压，提高其免疫力，减轻其体重及改善其肠道菌群。因而，所述药物或食品用于降低胆固醇、降血压、提高免疫力、减肥或调节肠道菌群。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种药物。所述药物包含：前面所述的植物乳杆菌；以及医药用无毒载体。发明人惊奇地发现，对动物提供本发明的药物，所述动物的血中胆固醇含量、血压及体重明显降低、免疫力显著提高以及肠道菌群的到明显改善，即本发明的药物能够有效发挥降低胆固醇、降血压、提高免疫力、减肥或调节肠道菌群等功效。由此，所述药物用于降低胆固醇、降血压、提高免疫力、减肥或调节肠道菌群。
根据本发明的实施例，所述医药用无毒载体不受特别限制，只要能够使所述药物形成容易给药的剂型即可，本领域技术人员可以根据具体情况灵活选择。根据本发明的一些具体示例，所述医药用无毒载体为选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理食盐水的至少一种。由此，本发明的药物能够有效形成容易给药的剂型，进而便于进行给药，利于后续实验步骤的进行。
根据本发明的实施例，所述药物的剂型呈选自片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂的至少一种。由此，本发明的药物方便给药，便于后续实验步骤的进行。
根据本发明的实施例，本发明的药物进一步包括：稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂的至少一种。
根据本发明的实施例，所述药物的给药剂量不受特别限制，实际应用中，可以根据给药对象的健康状况灵活选择。根据本发明的一些实施例，将所述药物以4.0×109CFU活菌/天的剂量对动物进行给药。由此，被给药动物的血中胆固醇含量、血压及体重明显降低，免疫力显著提高，肠道菌群明显改善。
在本发明的第四方面，本发明还提供了一种食品。根据本发明的实施例，所述食品包含：前面所述的植物乳杆菌；以及食品学上可接受的添加剂。根据本发明的实施例，所述食品包含：前面所述的植物乳杆菌；以及食品学上可接受的添加剂。发明人惊奇地发现，给动物服用本发明的食品，所述动物的血中胆固醇含量、血压及体重明显降低、免疫力显著提高以及肠道菌群明显改善，即本发明的食品能够有效发挥降低胆固醇、降血压、提高免疫力、减肥或调节肠道菌群等功效。由此，所述食品用于降低胆固醇、降血压、提高免疫力、减肥或调节肠道菌群。
需要说明的是，本文中所使用的术语“食品”应作广义理解，其可以是任何可被食用的形式，即除了常规的食品形式外，本发明的食品还可以为保健品、饮品、发酵食品等，并且，发酵食品也包括动物的饲料。
根据本发明的实施例，所述食品的摄取剂量不受特别限制，实际应用中，可以根据实际状况灵活选择。根据本发明的一些实施例，将所述食品以4.0×109CFU活菌/天的剂量提供给动物。由此，服用过了本发明的食品的动物的血中胆固醇含量、血压及体重明显降低，免疫力显著提高，肠道菌群明显改善。
另外，需要说明的是，本发明的植物乳杆菌可以与通常的食品中所使用的食品材料配合食用。例如，谷类及薯类：谷类包括米、面、杂粮，薯类包括马铃薯、红薯等；动物性食物，包括肉、禽、鱼、奶、蛋等；豆类及其制品，包括大豆及其他干豆类；蔬菜水果类，包括鲜豆、根茎、叶菜、茄果等；纯热能食物，包括动植物油、淀粉、食用糖和酒类等。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得更加容易理解：
图1显示了根据本发明的一个实施例，分离获得的植物乳杆菌Y-9的电子显微镜照片。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：分离与筛选
（1）分离与纯化：以各种传统发酵食品为样品，具体操作如下：用无菌生理盐水梯度稀释样品后，将其涂布于MRS固体培养基（配方：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵（(NH4)2HC6H5O7）2.0g，葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g，吐温801.0ml，乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0g，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58g，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25g，蒸馏水1000ml，琼脂18.0g），置于37℃培养箱中培养24～48h，观察菌落形态特征，并挑取MRS固体培养基上乳酸菌的疑似菌落，分别转接到MRS液体培养基（配方：从MRS固体培养基配方中去掉琼脂）中进行纯培养。共分离出125株菌，然后对每株菌进行编号，依次标为Y-1、Y-2、Y-3......Y-125。
（2）菌株的筛选：对分离纯化得到的这125株菌进行酸及胆盐耐受力的测定，详细实验步骤见实施例4：酸及胆盐耐受力评价，从中筛选得到酸及胆盐耐受力最强的Y-9，其酸及胆盐综合耐受力达到了125.0%。Y-9来源于农家自制酸奶。
实施例2：生理生化指标的测定鉴定菌种
采用碳水化合物鉴定试剂条（生产企业名称：bioMerieux,sa，版本号：07945F-CN-2002/11），对实施例1中分离获得的Y-9进行碳水化合物测定。
用途及原理：API50CH采用50个生化试验用来对微生物的碳水化合物的代谢进行研究。API50CH试条由50个微量孔组成，用以研究碳水化合物及其衍生物底物的发酵。用API50CHL培养基接种试条，使底物水解，然后检测发酵试验。试条孵育过程中，试条上的小管内在厌氧环境下产酸，pH改变而使培养基中指示剂颜色变化，由此可观察到发酵作用。试条上第一孔中不含任何活性成分，以此作为阴性控制。
实验步骤：
（1）试条的准备
每条试条分别由5个小试条组成，每个小试条上有10个小管。
准备孵育盒（包括底盘和盖子）。
在盒子底盘一端的加长部分记录菌株的编号。
加10ml蒸馏水或去离子水于孵育盒底盘中，使其填满所有的孔，以保持湿润的气体环境。
从包装袋中取出2个试条（0-19,20-39），再把它们分为4个小试条（0-9,10-19,20-29,30-39）并全部放在孵育盒底盘中。取出另一个小试条（40-49）放在孵育盒底盘中上述4个试条的后面，即完成试条的准备。
（2）接种物的准备
在MRS固体培养基上接种Y-9，置于37℃培养箱中培养，然后使用棉试子从固体培养基上收集菌株，在API50CHL培养基中制备接种物（菌悬液）。菌悬液制备好后，应立即使用。
（3）接种试条
用无菌加样器按下述要求将菌悬液加到试条上的50个管中。
将孵育盒底盘向前轻轻倾斜，使加样器头靠在杯的边缘加入菌悬液，避免产生气泡，仅加满管的部分，管的上部（杯）不要加菌悬液，这样管内可保持厌氧环境。当菌悬液接种完成后，液面应避免出现新月形的凹陷或凸起。
根据被检细菌的生长需要，将试条放在37℃进行孵育24小时和48小时后，阅读试条，记录结果，见表1。
表1：碳水化合物测定结果（+表示阳性可利用此底物发酵，-表示阴性）
底物成分 48h 24h 底物成分 48h 24h
控制 - - 七叶灵柠檬酸铁 - -
甘露醇 - - 水杨苷 + +
赤藻糖醇 - - D-纤维二糖 + +
D-阿拉伯糖 - - D-麦芽糖 + +
L-阿拉伯糖 - - D-乳糖 + +
D-核糖 - - D-密二糖 - -
D-木糖 - - D-蔗糖 - -
L-木糖 - - D-海藻糖 - -
D-侧金盏花醇1 - - 菊粉 - -
甲基-βD吡喃木糖苷 - - D-松三糖 - -
D-半乳糖 + + D-棉子糖 - -
D-葡萄糖 + + 淀粉 - -
D-果糖 + + 糖原 - -
D-甘露糖 + + 木糖醇 - -
L-山梨糖 - - D-龙胆二糖 + +
L-鼠李糖 - - D-土伦糖 - -
卫茅醇 - - D-来苏糖 - -
肌醇 - - D-塔格糖 - -
甘露醇 + + D-岩藻糖 - -
山梨醇 - - L-岩藻糖 - -
甲基-αD-吡喃甘露糖苷 - - D-阿拉伯醇 - -
甲基-αD-吡喃葡萄糖苷 - - L-阿拉伯醇 - -
N-乙酰葡萄糖胺 + + 葡萄糖酸钾 - -
苦杏仁苷 + + 2酮基葡萄糖酸钾 + -
ARBULIN + + 5酮基葡萄糖酸钾 - -
将表1的结果输入API50CHL数据库得出Y-9为植物乳杆菌。
实施例3：16S rDNA菌种鉴定
将实施例1分离获得的菌株，按照如下步骤进行16S rDNA菌种鉴定：
（1）用灭菌的接种环蘸取菌液在MRS固体培养基上划线，37℃培养24h，得到单菌落。
（2）制备：超净工作台灭菌后点燃酒精灯，取出灭过菌的1.5ml离心管，吸取30μl双蒸水（ddH2O），在火焰附近用灭过菌的枪头挑取单个菌并于双蒸水中吸打混匀，使形成有一定浊度的菌悬液。
（3）预处理：-20℃冰箱（15min）——65℃水浴（10min）反复冻融三次，弹打后在掌上离心机上以6000r/m离心5s，使管壁液体回落。
（4）混Mix：取1.5ml，在管盖上标记上Mix，在冰上按以下反应体系（见表2）准备不加模板的反应预混液，加入各反应溶液的顺序为：ddH2O、10×LA PCR缓冲液、4×dNTPs、通用引物sgR、通用引物sgF、LA-Taq酶，配制完成后，振荡3秒混匀，然后以6000r/m离心5秒。
表2：PCR反应体系
组分 1次反应所需用量（μl）
ddH2O 18.1
10×GC PCR缓冲液 2.5
dNTPs 2.0
通用引物sgR 0.5
通用引物sgF 0.5
LA-Taq酶 0.4
模板 1.0
总体积 25.0
（5）分装Mix：取出2个200μl PCR离心管，标上与模板标号对应的编号，在冰上向每只管中分装24μl Mix，分装完成后全部盖上管盖。
（6）加模板：离心管逐一开盖加入对应模板，即菌的水悬液，阴性对照中什么都不加。
（7）PCR上机：PCR程序如下
（8）PCR下机及电泳检测：程序运行结束后，取出样品，取3μl电泳检测。
（9）检测后若条带单一明亮，测序。
分离获得的菌株16S测序结果为：
AGGCGGCTGGTTCCTAAAAGGTTACCCCACCGACTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACTGAGAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGTTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACCAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTGATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTATCCATGTCCCCGAAGGGAACGTCTAATCTCTTAGATTTGCATAGTATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCATTCATCGTTTACGGTATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCATACTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCACTTCTTCGGTTGAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTCTCAGATATGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCATGGTGAGCCGTTACCCCACCATCTAGCTAATACGCCGCGGGACCATCCAAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTCAAGCTCAGACCATGCGGTCCAAGTTGTTATGCGGTATTAGCATCTGTTTCCAGGTGTTATCCCCCGCTTCTGGGCAGGTTTCCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCACTCAAATGTAAATCATGATGCAAGCATCAATCAATACCAGAGTTCGTTCGACTGCATGTA（SEQ ID NO：1）。
将测序结果采用BLAST工具在NCBI数据库中进行比对，分离获得的菌株的16SrDNA碱基序列与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum WCFS1,complete genome)显示出99%的同源性，表明分离获得的菌株为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。将该菌株命名为植物乳杆菌Y-9，其于2013年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2013391，保藏名称为植物乳杆菌Y-9。
实施例4：酸及胆盐耐受力评价
按照以下步骤，对实施例1分离获得的植物乳杆菌Y-9进行酸及胆盐耐受力测试：
（1）菌株的活化：将供试菌株转接于MRS液体培养基中，于37℃培养24h，以5%的接种量传代2次，然后于37℃培养15h，备用。
（2）MRS培养基的配制：分别配制固体和液体两种培养基，固体的倒好平板，备用。
（3）人工胃液的配制：取稀盐酸16.4ml加水约800ml与胃蛋白酶10g，摇匀后，加水稀释成1000ml，即得，然后用水及稀盐酸将其pH调为2.5，用0.2μm微孔滤膜过滤后待用。
（4）胆盐溶液的配制：取0.3g胆盐加入到100ml蒸馏水中，配制成0.3%胆盐溶液，用0.2μm微孔滤膜过滤后待用。
（5）菌株的酸及胆盐耐受力的评价：
实验组：取培养好的菌液170μl加入到1.53ml的人工胃液中，充分混匀后置于37℃恒温培养箱中培养2h，再从该混和液中取170μl加入到1.53ml的0.3%胆盐溶液中，混匀后放在37℃恒温培养箱中培养1h；
对照组：取菌液170μl加入到1.53ml的无菌水中，充分混匀后置于4℃冰箱中2h，再从该混和液中取170μl加入到1.53ml的无菌水中，混匀后放在4℃冰箱中1h；
然后，同时将实验组及对照组进行梯度稀释，分别稀释到10-4和10-5，然后从每个稀释度中取10μl在倒好的MRS固体平板上点样，每组做三个平行，即每个平板上点12个样品，在37℃恒温培养箱中培养48h。
（6）实验结果：酸及胆盐耐受力（生存率%）=实验组菌落个数/对照组菌落个数，结果表明植物乳杆菌Y-9的酸及胆盐耐受力为125.0%，是125株菌中酸及胆盐耐受力最高的一株。
实施例5：菌株保存性的测定
将实施例1分离获得的植物乳杆菌Y-9活化三代后，保存于灭菌的10%脱脂乳中，采用梯度稀释涂平板的方法计活菌数，结果为3.0×109CFU/ml，放入-20℃冰箱保存4周，然后取出检测，其活菌数仍为2.7×109CFU/ml，表明其具有高保存性。
实施例6：体外胆固醇去除率
按照以下步骤检测实施例1分离获得的植物乳杆菌Y-9的体外胆固醇去除率，具体如下：
（1）菌株的活化：将供试菌株转接于MRS液体培养基中，于37℃培养24h，以5%的接种量传代2次后，于37℃培养15h，待用。
（2）MRS培养基的配制：配制液体MRS培养基，灭菌待用；
（3）测定乳酸菌的降胆固醇能力：
配制含有胆固醇的MRS培养基（培养液MRSO-CHOL）：由MRS液体培养基、巯基乙酸钠、胆盐和无菌牛血清组成，其中，巯基乙酸钠在培养液MRSO-CHOL中的浓度为2g/L，胆盐在培养液MRSO-CHOL中的浓度为0.3%，将加有巯基乙酸钠和胆盐的MRS液体培养基50ml经115℃灭菌15min，再与50ml无菌牛血清混合配制成培养液MRSO-CHOL。
实验组：活化菌液按10%接种量即170μl接种于1.53ml培养液MRSO-CHOL中。
对照组：1.53ml没有接种菌株的培养液MRSO-CHOL。
将这两组样品放置于37℃恒温培养箱培养48h后，取出摇匀，4000r/m离心15min，取上清液，用总胆固醇测定试剂盒（试剂盒名称：总胆固醇测定试剂盒，公司：浙江东瓯诊断产品有限公司）测定上清中胆固醇含量，并计算胆固醇的去除率，其中，胆固醇去除率=对照组胆固醇与实验组胆固醇的差值/对照组胆固醇含量。
（4）实验结果：植物乳杆菌Y-9的体外胆固醇消除率为87.8%。
实施例7：降胆固醇动物实验
（1）实验菌株的制备：将活化两次的植物乳杆菌Y-9接种于MRS液体培养基中，于37℃培养18h，6000r/m离心10min，用灭菌生理盐水洗涤后收集菌体。然后，加入10%灭菌脱脂乳1200ml，调整菌数约2.0×109CFU/ml，再将菌悬液分为两等份：（1）活菌，（2）死菌（置于115℃20min），然后将活菌和死菌分别按每日使用量分装于15ml离心管（服用剂量为每天2ml/只，每组7只，共4组：活菌组、死菌组、高脂组、正常对照组，需灌胃28天，所以活菌组28管、每管14ml，死菌组28管、每管14ml）。
（2）实验动物分组及饲养方式：
Wistar系5周龄大鼠28只，购进后，自由饲喂至第7天，平均分为4组，每组7只；
活菌组：灌胃10%脱脂乳活菌悬液，饲喂高脂饲料；
死菌组：灌胃10%脱脂乳死菌悬液，饲喂高脂饲料；
高脂组：灌胃10%脱脂乳，饲喂高脂饲料；
正常对照组：灌胃0.9%生理盐水，饲喂标准饲料。
每天每只2ml灌胃，持续28天，然后停止灌胃，各组饲料、水不变持续28天。
（3）样品采集与分析测试：正式试验前、试验后第14天、第28天以及停止灌胃后28天共4个时间段进行采血。采血方法为绝食一夜后，于大鼠尾静脉采血，凝血后4000r/m离心10min分离血清，利用试剂盒（试剂盒名称：总胆固醇测定试剂盒，公司：浙江东瓯诊断产品有限公司）和酶标仪（公司：Molecular Devices，型号：Spectra MAX190）测定胆固醇。
（4）结果及分析：实验结果见表3。
表3：胆固醇浓度
由表3的结果可知，停止灌胃后28天活菌组胆固醇（TC）比高脂组显著降低（P=0.027<0.05），可能是由于植物乳杆菌Y-9在大鼠体内定植并发挥了作用，表明灌胃活菌对高脂血症大鼠具有降胆固醇作用。
实施例8：降血压动物实验
（1）实验材料：原发性高血压大鼠（SHR）20只，随机分成2组，每组10只，分别是PBS缓冲液对照组，活菌组。
（2）实验方法：按照每天每只2ml的剂量，PBS缓冲液对照组大鼠灌服PBS缓冲液，活菌组大鼠灌服10%脱脂乳活菌悬液（配制方法见实施例7）。试验期为24天，自第1天起，各组连续灌服15天，每天进行血压检测。
（3）结果与分析：血压测定结果如表4。
表4：血压测定结果
时间 活菌组（mmHg） 对照组（mmHg）
第1天 200.636±0.252 201.039±0.615
第2天 199.506±1.352 200.365±0.531
第3天 198.128±1.957 200.859±0.873
第4天 196.381±0.458 202.453±1.759
第5天 195.593±0.632 201.898±1.329
第6天 195.016±2.167 201.321±0.915
第7天 194.357±1.279 200.402±2.190
第8天 192.753±1.093 202.213±1.646
第9天 189.083±2.344 201.831±0.897
第10天 186.215±3.156 202.319±1.668
第11天 184.189±2.133 201.867±1.756
第12天 180.912±2.658 201.211±1.587
第13天 178.121±1.699 200.326±2.257
第14天 174.737±2.438 201.731±0.783
第15天 170.329±3.034 201.598±2.113
第16天 170.964±2.196 202.653±0.778
第17天 171.523±1.634 201.377±1.653
第18天 172.647±1.857 201.409±1.324
第19天 174.251±2.039 200.630±3.032
第20天 176.821±3.156 202.521±2.120
第21天 177.207±2.758 202.188±2.007
第22天 179.787±1.634 201.375±1.683
第23天 181.085±1.102 201.621±0.363
第24天 182.967±0.839 202.019±0.266
应用SPSS统计软件分析实验数据。从表4的结果中可以看出：灌服植物乳杆菌Y-9活菌后，SHR大鼠于第2天血压明显降低，达到199.506±1.352mmHg，PBS缓冲液对照组为200.365±0.531mmHg；随着实验时间的延长，至第15d停药，活菌组与PBS缓冲液对照组相比，呈显著下降趋势，且于第15天达到最低，为170.329±3.034mmHg(P＜0.01)。停药后，继续测定各组大鼠血压情况，结果表明，停药后活菌组大鼠血压呈上升趋势，PBS对照组血压无变化；至第24d，活菌组大鼠血压为182.967±0.839mmHg(P＜0.05)，显著低于PBS缓冲液对照组的202.019±0.266mmHg。实验结果表明，本发明的植物乳杆菌Y-9具有降血压的作用。
实施例9：对小鼠免疫力影响实验
（1）实验动物、分组情况、动物饲喂方式及血清的样品采集同实施例7。
（2）采用mouse IFN-γ预包被ELISA kit试剂盒（生产企业名称：深圳市达科为生物技术有限公司，版本号：DKW12-2000-096）和酶标仪（公司：Molecular Devices，型号：Spectra MAX190）进行IFN-γ的测定。IFN-γ，亦称为Ⅱ型干扰素，是由有丝分裂原活化的T淋巴细胞分泌的一种抗病毒活性物质。该蛋白与IFN-β或各种IFN-α家族蛋白没有显著的同源性。IFN-γ主要由T淋巴细胞和自然杀伤细胞分泌，其分泌是由抗原刺激和细胞因子如IL-12诱导产生的。
（3）结果分析，见表5。
表5：IFN-γ测定结果
由表5的结果可知，停止灌胃28天后，高脂组与正常对照组比较IFN-γ水平显著升高（P=0.015<0.05），活菌组、死菌组与高脂组比较IFN-γ水平显著降低（P<0.05）。且观察后发现高脂组大鼠与其他组比较行动缓慢，毛发缺乏光泽等，活菌组、死菌组与正常组表现都比较正常且毛发很有光泽等。因此，植物乳杆菌Y-9一种可能的作用机制是抑制IFN-γ的过量分泌，从而抑制B细胞增殖分泌抗体，达到治疗目的。
实施例10：对肥胖大鼠体重改善实验
实验动物、分组情况及动物饲喂方式同实施例7，每周对大鼠进行体重测定。实验结果见表6。
表6：大鼠体重变化
由表6的结果可知，停止灌胃后第28天，高脂组体重显著高于其他任何组（P<0.05），活菌组体重显著低于高脂组（P=0.014＜0.05），死菌组体重极显著低于高脂组（P=0.009<0.01），表明灌胃活菌或死菌都具有使高脂大鼠减轻体重的功效。
实施例11：调节肠道菌群动物实验
（1）实验动物、分组情况及动物饲喂方式同实施例7，每周用灭菌离心管在超净台内收集新鲜大鼠粪便，-20℃保藏。
（2）粪便样品中宏基因组DNA的提取：采用液氮冻融-CTAB法：取1.0g粪便样品洗涤处理，将洗脱的菌体于1.5ml离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化（约5min），反复冻融3次，加0.1ml10％SDS和10.0μl10mg/ml的蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200rpm摇动2h，室温下12000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中。上清液与等体积的氯仿于12000g离心10min（为了使沉淀、水相和有机相分层），吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0.1倍体积的醋酸钠，1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70％乙醇洗涤沉淀2次回溶备用。
（3）PCR扩增反应体系为1×PCR缓冲液（含有2.5mmol/L MgCl2）、上下游引物3pmol、dNTPs200mmol/L和1μl50ng/μl提取的DNA模板，用水补齐到50μl。扩增循环条件为94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，循环30次。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检验合格后，通过产物纯化、安捷伦2100生物分析仪定量混匀，上样测序。焦磷酸测序按照454RocheGS-FLX的标准流程进行测试。
（4）数据分析：获得的数据提取高质量序列、划分操作分类单元等依据Mothur程序包来完成。原始数据需要经过质量控制，需满足序列引物完全匹配、序列长度大于150bp、序列中不存在有争议的碱基、多聚体结构不得超过7个、每50个碱基质量值平均不低于35。通过序列的聚类以给定非相似度0.03水平上划分OTU，选用每一OTU代表序列进行注释，采用BLAST比对方法细菌于SILVA数据库进行注释。系统发育树构建由Megan程序包依据OTU注释信息完成。信息分析的结果为停止灌胃28天后，活菌组、死菌组、高脂组、正常对照组中有害菌的比例分别为4.9%、6.2%、30.7%、9.6%。活菌组、死菌组与高脂组、正常对照组比较有害菌比列明显降低（P=0.021<0.05），表明本发明的植物乳杆菌Y-9具有抑制有害菌的作用，从而达到调节肠道菌群的目的。
实施例12：药物及食品的制备
（1）植物乳杆菌片剂：
配方：植物乳杆菌Y-9的乳酸菌冻干粉（采用冻干机将乳酸菌配制成的菌悬液在无菌环境下冷冻成固态，抽真空将水分升华干燥而成的粉状固体状态）5.5%、奶粉31%、低聚果糖31%、低聚半乳糖31%、硬脂酸镁1.5%。将其混合均匀后，压片制成片剂。
（2）植物乳杆菌发酵酸奶：
将鲜牛奶或复原奶灭菌，冷却后分装，添加保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌Y-9的乳酸菌冻干粉，先于42℃前发酵7h，再于4℃后发酵10h后制成。
（3）植物乳杆菌发酵酸豆乳：
将豆奶粉用水溶解后灭菌，冷却后分装，添加保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌Y-9的乳酸菌冻干粉，先于42℃前发酵7h，再于4℃后发酵10h后制成。
（4）以上药品及食品的药效试验
实验方案：同实施例7、8、9、10、11，其中灌胃的样品改为以上三种药品及食品捣碎后加无菌水制成的悬液，调整菌数约2.0×109CFU/ml。
实验结果见下表：
表7：胆固醇浓度
由表7的结果可知，停止灌胃后28天植物乳杆菌药物及食品组胆固醇（TC）比高脂组显著降低（P=0.039<0.05），可能是由于植物乳杆菌Y-9在大鼠体内定植并发挥了作用，表明灌胃活菌对高脂血症大鼠具有降胆固醇作用。
表8：血压测定结果
应用SPSS统计软件分析实验数据。从表8的结果中可以看出：灌服三种药品及食品后，SHR大鼠于第2天血压明显降低，达到199.610±0.983mmHg，199.854±1.297mmHg，200.365±0.531mmHg。PBS缓冲液对照组为200.781±0.682mmHg；随着实验时间的延长，至第15d停药，灌服三种药品及食品组与PBS缓冲液对照组相比，呈显著下降趋势，且于第15天达到最低，为170.758±2.698mmHg(P＜0.01)，171.784±3.587mmHg(P＜0.01)，171.321±1.588mmHg(P＜0.01)。停药后，继续测定各组大鼠血压情况，结果表明，停药后活菌组大鼠血压呈上升趋势，PBS对照组血压无变化；至第24d，灌服三种药品及食品组大鼠血压为183.087±0.757mmHg(P＜0.05)，182.349±1.007mmHg(P＜0.05)，184.066±2.376mmHg(P＜0.05)显著低于PBS缓冲液对照组的201.183±1.775mmHg。实验结果表明，本发明的植物乳杆菌片剂、植物乳杆菌发酵酸奶、植物乳杆菌发酵酸豆乳具有降血压的作用。
表9：IFN-γ测定结果
由表9的结果可知，停止灌胃28天后，高脂组与正常对照组比较IFN-γ水平显著升高（P=0.021<0.05），灌服三种药品及食品组、死菌组与高脂组比较IFN-γ水平显著降低（P<0.05）。且观察后发现高脂组大鼠与其他组比较行动缓慢，毛发缺乏光泽等，活菌组、死菌组与正常组表现都比较正常且毛发很有光泽等。因此，本发明的植物乳杆菌片剂、植物乳杆菌发酵酸奶、植物乳杆菌发酵酸豆乳具有提高免疫力的作用。
表10：大鼠体重变化
由表10的结果可知，停止灌胃后第28天，高脂组体重显著高于其他任何组（P<0.05），灌服三种药品及食品组体重显著低于高脂组（P=0.019＜0.05），因此，本发明的植物乳杆菌片剂、植物乳杆菌发酵酸奶、植物乳杆菌发酵酸豆乳具有使高脂大鼠减轻体重的功效。
信息分析的结果为停止灌胃28天后，植物乳杆菌片剂组、植物乳杆菌发酵酸奶组、植物乳杆菌发酵酸豆乳组、高脂组、正常对照组中有害菌的比例分别为5.5%、6.1%、5.8%、30.3%、10.2%，因此，本发明的植物乳杆菌片剂、植物乳杆菌发酵酸奶、植物乳杆菌发酵酸豆乳具有改善高脂大鼠肠道菌群的功效。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种植物乳杆菌，其于2013年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位的地址为中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO:M2013391，保藏名称为植物乳杆菌Y-9Lactobacillus plantarum Y-9。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备药物或食品中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，所述药物或食品用于降低胆固醇、降血压、提高免疫力、减肥或调节肠道菌群。
4.一种药物，其特征在于，所述药物包含：
权利要求1所述的植物乳杆菌；以及
医药用无毒载体。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物用于降低胆固醇、降血压、提高免疫力、减肥或调节肠道菌群。
6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述医药用无毒载体为选自葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、糊精、脂肪酸甘油酯、聚乙二醇、羟乙基淀粉、乙二醇、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、氨基酸、明胶、白蛋白、水、生理食盐水的至少一种，
任选地，所述药物的剂型呈选自片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、冻干制剂的至少一种。
7.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，进一步包括：
稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂的至少一种。
8.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，将所述药物以4.0×109CFU活菌/天的剂量对动物进行给药。
9.一种食品，其特征在于，所述食品包含：
权利要求1所述的植物乳杆菌；以及
食品学上可接受的添加剂。
10.根据权利要求9所述的食品，其特征在于，所述食品用于降低胆固醇、降血压、提高免疫力、减肥或调节肠道菌群，
任选地，所述食品的服用剂量为4.0×109CFU活菌/天。
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