CN108295096B - 菌株在预防和治疗霉菌性、细菌性阴道炎制剂中的应用 - Google Patents

菌株在预防和治疗霉菌性、细菌性阴道炎制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种植物乳杆菌LP‑A3的筛选及通过调控阴道菌群在预防和治疗霉菌性、细菌性阴道炎中的应用，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14570，保藏日期为：2017年8月29日。LP‑A3是从严格入组的女性阴道分泌物中分离出来的，研究发现阴道来源益生菌适应阴道环境，能够通过口服到达阴道，且在阴道内活性高、定植能力强，能更好的调节阴道菌群，与其它益生菌互利共生。所以筛选自阴道的菌株对于预防和改善女性阴道炎效果更明显，应用前景更广。

Description

菌株在预防和治疗霉菌性、细菌性阴道炎制剂中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，更具体地说涉及菌株在预防和治疗霉菌性、细菌性阴道炎制剂中的应用。
背景技术
阴道炎是阴道粘膜及粘膜下结缔组织的炎症，是妇科门诊常见的疾病。常见的阴道炎有细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、老年性阴道炎等，近年来细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎等发病率有上升趋势。细菌感染常见的病原菌为混合型态的病原菌，如：阴道伽氏杆菌(Gardnerella vaginalis)、大肠杆菌
(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌
(Staphylococcus aureus)及链球菌属(Streptococcus)等，混合型态的病原菌适合生长在偏碱性的环境(pH>4.5)；霉菌感染较常见的病原菌系为白色念珠菌
(Candida albicans)，且白色念珠菌系喜爱生长于温热潮湿的环境，会造成阴部瘙痒、灼热、外阴红肿、小便疼痛等症状，抵抗力不足时易造成反复性感染。目前用于治疗阴道炎的方法多为抗生素或类固醇等药品，这些药物杀死病原菌的同时也会伤害体内的益生菌，会进一步造成阴道菌群失调，同时降低宿主免疫力，容易产生依赖性，造成阴道炎反复感染。阴道炎无法根治，易反复，给生活、工作带来很多不便，此外，还会进一步诱发盆腔炎、肾周炎、性交痛等疾病，给女性生殖健康带来不良影响。阴道炎还会导致不孕不育，因为正常情况下的阴道，是适合精子生存的，但患上阴道炎之后，阴道环境被破坏，pH值超过4.5，阴道内环境酸碱度的改变会使精子的活动力受到抑制。另外，患细菌性阴道病时，阴道内分泌物大量增多，分泌物中含有大量的白细胞，这些都会妨碍精子的成活，使精子数量减少，从而导致女性女性不孕。同时，阴道炎还会影响胎儿发育，引发早产、胎儿感染畸形等。
利用益生菌治疗妇女阴道疾病具有重大优势，妇女生殖道是一个非常复杂的微生态系统，乳酸菌作为其中的优势微生物，可维持阴道微生态环境平衡。当阴道中乳酸菌减少或消失时，会造成其他病原微生物的迅速生长，从而导致细菌性阴道炎、真菌性阴道炎发生。益生菌产品效果明显，不产生依赖性，安全无副作用。但是目前产品存在：菌株耐消化水平差，口服后仅有少量存活，活菌数低，无法起到益生效果；定植能力差，到达靶部位后很快被人体代谢，效果不持久；抑菌作用弱，仅对某种病菌起作用，效果不明显等问题。因此，寻找一种耐消化能力强、定植能力好，能抑制阴道感染病原菌生长、维持阴道pH恒定，且不破坏阴道菌群平衡的益生菌菌株非常必要。
发明内容
本发明针对现有技术的不足之处，提供一种植物乳杆菌LP-A3的筛选及通过调控阴道菌群在预防和治疗霉菌性、细菌性阴道炎中的应用。
本发明实现目的的技术方案如下：
植物乳杆菌LP-A3在制备预防霉菌性阴道炎制剂中的应用，所述植物乳杆菌LP-A3的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14570，保藏日期为：2017年8月29日，分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
植物乳杆菌LP-A3在制备预防细菌性阴道炎制剂中的应用，所述植物乳杆菌LP-A3的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14570，保藏日期为：2017年8月29日，分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
植物乳杆菌LP-A3在制备治疗霉菌性阴道炎制剂中的应用，所述植物乳杆菌LP-A3的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14570，保藏日期为：2017年8月29日，分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
植物乳杆菌LP-A3在制备治疗细菌性阴道炎制剂中的应用，所述植物乳杆菌LP-A3的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14570，保藏日期为：2017年8月29日，分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
一种预防细菌性阴道炎或霉菌性阴道炎的制剂，包括植物乳杆菌LP-A3。
一种治疗细菌性阴道炎或霉菌性阴道炎的制剂，包括植物乳杆菌LP-A3。
本发明的优点和积极效果如下：
本发明中的植物乳杆菌LP-A3是从严格入组的女性阴道分泌物中分离出来的，研究发现阴道来源益生菌适应阴道环境，能够通过口服到达阴道，且在阴道内活性高、定植能力强，能更好的调节阴道菌群，与其它益生菌互利共生，所以筛选自阴道的菌株对于预防和改善女性阴道炎效果更明显，应用前景更广。
本发明提供的益生菌预防和治疗阴道炎方面比抗生素具有安全性高、不易反复等优点，和市售益生菌产品相比，本次从阴道内分离的植物乳杆菌LP-A3还具有以下几大特点：1.消化道耐受性好。2.抑菌作用更强，抑菌范围更广泛。3.可以通过口服顺利到达阴道，并且适应阴道环境，能大幅度增加阴道乳酸菌数量从而改善阴道健康。因此，植物乳杆菌LP-A3在相关保健品、食品和药品的开发应用中，尤其是女性日常保养产品的开发中，具有很大应用潜力。
附图说明
图1为饲喂其他益生菌的大鼠阴道益生菌涂片。
图2为饲喂LP-A3后大鼠阴道益生菌涂片。
图3为益生菌治疗后阴道感染人群阴道中益生菌情况。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明提供一种植物乳杆菌LP-A3的筛选及通过调控阴道菌群在预防和治疗霉菌性、细菌性阴道炎中的应用，其中植物乳杆菌名称为LP-A3，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14570，保藏日期为：2017年8月29日，分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillusplantarum。
本菌株LP-A3分离自18-22周岁健康未婚女性运动员体内(中国北京)，具有优秀的耐酸耐胆盐能力、胆盐水解酶活性和肠道定植能力，动物实验和人体试食实验表明，LP-A3分离自经严格筛选的18-22周岁女性运动员阴道，具有优秀的耐酸耐胆盐能力；能够直接或通过消化道定植在宿主阴道细胞，在抑制阴道致病菌生长的同时，调节阴道pH，维持阴道菌群平衡；该菌对引起阴道炎的多种细菌和霉菌，有很强的抑菌效果。以LP-A3为主要菌株开发的产品不仅可以用于女性日常保养，维持阴道微酸性环境，预防和治疗霉菌和细菌性阴道炎，还可以有效调节阴道菌群平衡从根本上提高阴道抗病性恢复阴道健康。本菌株的筛选、分离、鉴定过程如下：
本采用以下实验例来说明本发明菌株的优越性。
1.植物乳杆菌LP-A3的分离及鉴定
1.1菌株样品：采集自18-22周岁未婚健康女性运动员阴道。
建立严格的采样标准，具体采样供体要求：
1.无性生活经历；2.无阴道炎症疾病，生理期正常；3.年龄在18-22周岁；4.饮食正常，无不良饮食习惯，无吸烟酗酒史，无吸毒史；5.大便正常，无习惯性便秘、习惯性腹泻；6.每周至少有五次以上中等强度运动习惯；7.体型匀称，18.5≤BMI≤23.9，腰臀比为≤0.8；8.作息时间正常，无不良作息习惯；9.皮肤健康，有光泽，无痤疮及其他皮肤疾病；10.无慢性病史，无既往精神疾病史。
采样时间要求：月经结束后5d-月经来潮前5d
1.2培养基：MRS培养基(Man Rogosa Sharp，MRS)，乳酸菌选择性培养基。
蛋白胨10.0g牛肉膏5.0g酵母粉4.0g葡萄糖20.0g吐温801.0mL磷酸氢二钾2.0g乙酸钠5.0g柠檬酸二铵2.0g硫酸镁0.2g硫酸锰0.05g琼脂粉15.0g蒸馏水1000mL
1.3菌种分离纯化：
用无菌棉棒阴道内取样，样品溶于适量MRS培养基中，用灭菌吸管吸取1mL培养液加入装有9mL无菌水的试管中(1:10)稀释，同法连续稀释成几个梯度的稀释液。取0.1mL三个适当稀释梯度的菌液涂于MRS琼脂平板培养基上，每个稀释度做3个平行试验。将培养皿倒置于生化培养箱内，37℃培养。
待菌落形成后，记录菌落形态，用接种环挑取单个菌落，纯化，到镜检不存在混杂菌为止。
将已经分离纯化的菌株转接到MRS斜面上，贴好标签，4℃下保藏。
1.4菌种鉴定
参照《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》,并对菌株LP-A3进行16s rDNA测序。经对比鉴定为植物乳杆菌。
2.耐胃液模拟实验
配制胃蛋白浓度为3.2g/L的MRS液体培养基(盐酸调节)，将活化好的植物乳杆菌以6％接种量接种于10mLpH自然和pH为2的上述培养基，37℃培养4h。连续稀释成适宜梯度的稀释液，计数。
对照菌株1和对照菌株2均为从市售益生菌产品中分离出的植物乳杆菌(下同)
3.耐肠液模拟实验
配制胰蛋白酶浓度为10g/L的MRS液体培养基，将活化好的植物乳杆菌以6％接种量分别接种于10mL含有0.15％和0.3％牛胆酸钠的上述培养基，37℃培养24h。连续稀释成适宜梯度的稀释液，计数。
4.植物乳杆菌LP-A3体外抑菌实验
以常见致病菌大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、加德纳杆菌、伤寒杆菌和肠球菌为指示菌，以活化好的植物乳杆菌LP-A3菌液为待检测菌，以MRS液体培养基作为对照，琼脂扩散法进行抑菌试验。
5.植物乳杆菌LP-A3上皮细胞吸附能力
本实验例使用人类子宫颈癌细胞株Hela细胞模拟阴道上皮细胞。Hela细胞培养稳定后，以5×104/mL的浓度接种在24孔板内，置于二氧化碳培养箱37℃培养24小时后，加入最终浓度为108CFU/mL的植物乳杆菌，置于二氧化碳培养箱37℃培养2小时，然后用PBS缓冲液缓慢冲洗，去除未吸附在阴道上皮细胞的植物乳杆菌，镜检，每个视野随机数五个细胞上植物乳杆菌黏附的数量，随机取五个视野。
6.动物实验
6.1.实验动物：雌性SD大鼠，体重为180±10g
6.2.实验分组及治疗
20只雌鼠按体重随机分为对照组和益生菌组，每组10只。对照组给予市售某品牌益生菌溶液灌胃，益生菌组给予LP-A3益生菌液灌胃，各组均给予标准饲料自由采食，连续饲养6周。
益生菌液制备：活化好的植物乳杆菌LP-A3加入冻干保护剂，冻干成菌粉并计数，将一定量的菌粉重悬于生理盐水中配制成的菌液进行灌胃。
灌胃剂量：5.0×107CFU/100g。
6.3实验指标
大鼠固定后，用无菌棉棒插入大鼠阴道，取阴道分泌物于装有1mL生理盐水的离心管，混匀，稀释成合适的梯度，在添加20g/L碳酸钙的MRS琼脂平板进行乳酸菌计数。
7.人群实验
采用自身对照试验设计，选择符合纳入标准并保证配合试验的志愿者90名，按志愿者的阴道健康状况随机分为益生元组(仅服用益生元)，其他益生菌组(服用其他品牌益生菌产品)和LP-A3组(服用LP-A3)。连续服用益生菌30天，活菌数为1×1010CFU/d，实验期间不改变原来的饮食及性生活习惯。
实验前后分别用无菌棉棒插入阴道，沾取阴道分泌物于装有1mL生理盐水的离心管，混匀，稀释成合适的梯度，在添加20g/L碳酸钙的MRS琼脂平板进行乳酸菌计数。
实验结果
1.植物乳杆菌LP-A3的分离及鉴定
植物乳杆菌LP-A3的形态学观察结果如表1。
表1植物乳杆菌LP-A3的形态学观察
Figure BDA0001521965920000061
将菌株LP-A3的16srDNA序列与GenBank中已知序列进行Blast比对,从数据库中获得相关的种属的16srDNA,构建系统发育树,并通过菌种的细胞形态、生理生化特征和16srDNA序列等实验数据综合确定该菌株属于乳杆菌属,最终确定为植物乳杆菌。
2.耐胃液模拟实验结果
植物乳杆菌LP-A3在pH为2和2.5的条件下4h后的存活率如表2所示。结果表明该菌具有较强的耐酸能力，能耐受胃液的消化。
表2植物乳杆菌LP-A3耐酸能力
Figure BDA0001521965920000062
3.耐肠液模拟实验结果
植物乳杆菌LP-A3在含有牛胆酸钠的培养基中37℃培养24h后的存活率如表3所示。结果表明该菌具有较强的耐胆盐能力。
表3植物乳杆菌LP-A3耐胆盐能力
Figure BDA0001521965920000063
4.植物乳杆菌植物乳杆菌LP-A3体外抑菌实验
观察抑菌环的大小,取3个平行的平均值作为实验结果。结果见表4。
表4植物乳杆菌LP-A3抑菌效果
Figure BDA0001521965920000071
体外抑菌实验显示，植物乳杆菌LP-A3的体外抑菌效果优于市售益生菌产品中已商业化的植物乳杆菌。并且该菌株不仅对阴道炎常见致病菌：大肠埃希菌，白色念珠菌，加德纳杆菌有较强的抑制作用，对多种消化道致病菌也有较强的抑制作用。
5.上皮细胞吸附能力
表4植物乳杆菌LP-A3细胞粘附结果
Figure BDA0001521965920000072
由上表可知，植物乳杆菌LP-A3对，肠上皮细胞和阴道上皮细胞有很强的吸附能力，能够长时间定植在阴道内，可以通过“占位效应”抑制阴道致病菌吸附在阴道上皮细胞，说明该菌可有效预防、治疗霉菌性、细菌性阴道炎。
在本次筛选实验，共从37位供体阴道内分离出乳酸菌126株，经耐胃液模拟实验、耐肠液模拟实验、体外抑菌实验和细胞吸附能力验证，其中植物乳杆菌LP-A3的耐酸耐胆盐能力、吸附能力、抑菌能力最强，证明其具有进一步开发潜力。因此，对植物乳杆菌植物乳杆菌LP-A3进行下一步动物实验和人群实验验证。
6.动物实验
实验大鼠灌胃LP-A3和其他益生菌产品1个月后，用棉棒取对照组和益生菌组阴道分泌物稀释至1mL生理盐水后，取100μL涂于琼脂平板，计数每毫升稀释液中益生菌的数目，结果如下表所示：
表5灌胃植物乳杆菌LP-A3后阴道中乳酸菌计数结果
分组 其他益生菌组 LP-A3组
益生菌数(CFU/mL稀释液) 67 1.14×10<sup>4</sup>
对照组和益生菌组阴道分泌物稀释于1mL生理盐水后，取100μL涂于琼脂平板，结果如图1(灌胃其他市售益生菌)和图2(灌胃益生菌LP-A3)所示。
7.人群实验
选取90位具有不同阴道感染症状的病人进行益生菌和益生元口服治疗，治疗周期30d，治疗结束后对患病人群症状改善情况进行问卷调查，调查结果如表6所示，试食植物乳杆菌LP-A3菌粉30d后，益生菌组阴道乳酸菌计数显著高于对照组。
表6食用益生菌后阴道感染人群临床症状改善情况
Figure BDA0001521965920000081
Figure BDA0001521965920000091
通过对人群临床改善情况进行分析，服用益生元、市售其他益生菌产品和植物乳杆菌LP-A3均对阴道感染人群临床症状有改善作用，但是益生元组的改善率仅有10％，市场上某品牌益生菌组的改善率能够达到63.3％，植物乳杆菌LP-A3的改善率能够达到90％，人体实验证明，LP-A3比其他产品有更好的改善作用，尤其是在改善白带异常、瘙痒和异味方面有更好的改善作用。
通过对益生菌治疗前后阴道感染人群阴道中的益生菌情况分析，益生元、其他益生菌组和LP-A3都能够提高阴道中益生菌的数量，其中LP-A3组的提高能力最为显著(如图3所示)。由该实验结果可以知道，LP-A3能够通过消化道到达生殖道，并且在生殖道进行定植。阴道中乳酸菌的数量是阴道健康的重要指标，一定数量的乳酸菌不仅能够直接抑菌，还能够通过调控阴道pH抑制致病菌繁殖。增加生殖道益生菌的数量可能是LP-A3改善阴道感染人群症状的主要原因。
综上所述：植物乳杆菌LP-A3具有优秀的耐酸耐胆盐能力，证明植物乳杆菌LP-A3经口摄入后，能够顺利经过消化道，到达靶点发挥益生作用；该菌对引起阴道炎的细菌和霉菌都有很强的抑菌效果，可以全面预防和缓解各种病菌引起的阴道炎；该菌具有很好的细胞吸附能力，说明该菌可以高效定植在体内，可以更有效、更长久的抑制病菌生长，防止阴道炎反复发生，还可以调节阴道微生态环境。动物实验和人体试验结果表明，该菌可以通过口服经消化道到达阴道，增加阴道菌群中益生菌数量，从而预防、缓解阴道炎，防止阴道炎反复发生。人体实验证明，植物乳杆菌LP-A3能够明显缓解阴道炎症状，增加阴道内乳酸菌数量，安全性高，效果明确。
益生菌预防和治疗阴道炎方面比抗生素具有安全性高、不易反复等优点，和市售益生菌产品相比，本次从阴道内分离的植物乳杆菌LP-A3还具有以下几大特点：
1.消化道耐受性更好。
2.抑菌作用更强，抑菌范围更广泛。
3.可以通过口服顺利到达阴道，并且适应阴道环境，能大幅度增加阴道乳酸菌数量从而改善阴道健康。
因此，植物乳杆菌LP-A3在相关保健品、食品和药品的开发应用中，尤其是女性日常保养产品的开发中，具有很大应用潜力。

Claims (4)

1.植物乳杆菌LP-A3在制备预防霉菌性阴道炎制剂中的应用，所述植物乳杆菌LP-A3的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14570，保藏日期为：2017年8月29日，分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
2.植物乳杆菌LP-A3在制备预防细菌性阴道炎制剂中的应用，所述植物乳杆菌LP-A3的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14570，保藏日期为：2017年8月29日，分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
3.植物乳杆菌LP-A3在制备治疗霉菌性阴道炎制剂中的应用，所述植物乳杆菌LP-A3的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14570，保藏日期为：2017年8月29日，分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
4.植物乳杆菌LP-A3在制备治疗细菌性阴道炎制剂中的应用，所述植物乳杆菌LP-A3的保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.14570，保藏日期为：2017年8月29日，分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。
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