CN112458006A - 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病的格氏乳杆菌 - Google Patents

用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病的格氏乳杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新的用于预防和/或治疗生殖道感染和/或生殖道菌群紊乱的格氏乳杆菌菌株及其应用。本发明为解决现有的治疗生殖道感染的药物具有不同程度副作用、复发率高或创伤大等技术问题，筛选出一种新的用于预防和/或治疗生殖道感染和/或生殖道菌群紊乱的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13‑16，其能够产生乳酸和过氧化氢等分泌物，以抑制生殖道感染致病菌的生长，用于预防和/或治疗生殖道感染疾病，尤其降低复发率，毒副作用小，效力持久，同时其作为阴道优势乳杆菌，修复菌群紊乱，恢复阴道稳态。

Description

用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病的格氏乳杆菌
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新的用于预防和/或治疗生殖道感染的格氏乳杆菌菌株及其应用。
背景技术
女性生殖道环境常会受到激素水平波动、卫生情况控制不佳、季节变化、甚至心情不稳定等各种影响而造成菌群紊乱，进而导致病原菌入侵，引发细菌、霉菌、病毒等微生物感染，常见的有大肠杆菌、加德纳菌、白色念珠菌和HPV病毒等。生殖道感染疾病的临床症状表现为：阴道瘙痒灼热，分泌物异常，尿频尿痛，严重则会导致孕妇早产，宫颈癌等。据统计，我国育龄女性中生殖道微生物感染率高达80％，绝大多数细菌性或真菌性感染的患者接受的临床治疗手段是使用抗生素。抗生素在对抗病原菌的同时也会降低益生菌的丰度，不利于维持生殖道菌群稳态，从而增高复发风险。而针对HPV病毒感染患者，现在暂无完善的治疗方法，多采用定期筛查和随访的方式，严重则会进行手术治疗。
因此，亟需开发一种能够预防或治疗女性生殖道感染的同时，又不会影响生殖道环境益生菌的丰度的菌种或药物。
发明内容
女性的生殖健康和生殖道内生存的微生物菌群息息相关，也已有多项研究表明生殖道的菌群紊乱是导致细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎或HPV感染的直接原因。现代医学对生殖道炎症疾病的治疗主要集中在服用抗生素、放置抗生素栓剂等药物治疗。但抗生素药物治疗存在很多问题：第一，抗生素在杀死病原菌，消除炎症的同时也抑制了益生菌的生长，降低了益生菌的丰度，非常不利于生殖道维持稳态，大大增加了重复感染和复发的风险；第二，服用药物不能达到精准治疗的目的，只能广谱性的全身范围内作用，尤其容易损伤肝肾功能；第三，经常使用抗生素容易导致病原菌产生耐药性，这也是造成二次感染的重要原因。
在阴道菌群中，虽然存在个体差异，但绝大多数女性生殖道内的优势菌种是乳酸杆菌，且主要集中于四种：卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌和惰性乳杆菌。这些乳杆菌主要通过产生乳酸来维持阴道较低的pH值，从而抑制病原菌的入侵和生长，另外，乳杆菌还可合成过氧化氢以保证阴道内的厌氧环境，以防止好氧细菌的滋生。一旦菌群结构被破坏，病原菌便会感染生殖道，引发炎症，并且和乳杆菌形成竞争关系，从而破坏生殖道微生物稳态。此时，补充乳杆菌以维持健康的生殖道菌群结构比单一使用抗生素更有效。
本发明为解决现有技术中的药物具有不同程度副作用、复发率高或创伤大等技术问题。筛选出一种新的用于预防和/或治疗生殖道感染(尤其指人类中女性生殖道感染)的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16，其能够产生乳酸和过氧化氢等分泌物，以抑制生殖道感染致病菌的生长，用于预防和/或治疗生殖道感染疾病，尤其降低复发率，毒副作用小，效力持久。
为此，本发明一方面提供一株格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16，其保藏号为GDMCC No:60405。
本发明从约30,000株的人体共生单菌库里筛选出一株女性生殖道益生菌格氏乳杆菌 (Lactobacillus gasseri)TM13-16，该菌株是一株全新的分离株，该菌株已于2018年8月24 日在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC，广东省广州市越秀区先烈中路100号大院实验大楼5楼)保藏，其保藏编号为GDMCC No:60405。
本发明所述格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16采用改良版PYG培养基进行分离，鉴定后用MRS培养基传代保藏。在MRS培养基中培养48小时，TM13-16的菌落是白色不透明、光滑、圆形、边缘不规整，中间有白色凸起，菌落直径约0.5-1.5mm。在1000倍的显微镜下观察，菌体呈现细长杆状，革兰氏染色为阴性，没有芽孢和鞭毛产生。
本发明提供的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16，经研究发现其无质粒和转移元件等风险基因；同时表现出强共凝集能力和对人阴道上皮细胞的强粘附能力，有较强产L-乳酸、D-乳酸和过氧化氢的能力；生长能力强且高度耐酸碱；对大多抗生素敏感，对常见的阴道感染的致病菌有强抑菌能力，可用于预防和/或治疗生殖道微生物感染。
本发明另一方面提供所述的格氏乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备产品中的应用，所述产品用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病。
在本发明的一些实施方案中，所述女性生殖道菌群紊乱相关疾病为生殖道感染。
在本发明的一些实施方案中，所述生殖道感染包括选自细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、好氧性阴道炎、老年性阴道炎和病毒感染中的至少之一。
在本发明的另一些实施方案中，引起所述细菌性阴道炎的细菌为引起女性生殖道感染的常见细菌，包括大肠杆菌(E.coli ATCC35218)、加德纳杆菌(Gardnerellavaginalis BNCC337545)、棒状杆菌、嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性厌氧菌。
在本发明的一些实施方案中，引起所述霉菌性阴道炎的霉菌为引起女性生殖道感染的常见假丝酵母菌，包括白假丝酵母菌(白色念珠菌Candida albicans SC5314)、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌和都柏林假丝酵母菌等。
在本发明的另一些实施方案中，引起所述生殖道病毒感染的病毒为引起女性生殖道感染的常见病毒，包括HPV、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒等。
在本发明又一方面提供所述的格氏乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备产品中的应用，所述产品用于抗菌、粘附阴道上皮细胞和/或宫颈细胞、产乳酸、产H2O2。
在本发明的一些实施方案中，所述产品为食品、药物或者保健品。其中，所述食品可以是益生菌酸奶、益生菌片、益生菌固体饮料等。
在本发明的一些实施方案中，所述格氏乳杆菌的给药剂量为105-1012CFU/天。
本发明又一方面提供一种食品、药物或保健品，所述食品、药物或保健品包括所述的格氏乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液。
在本发明的一些实施方案中，所述食品、药物或者保健品选自预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病的产品、抗菌的产品、粘附阴道上皮细胞和/或宫颈细胞的产品、产乳酸的产品、产H2O2的产品中的至少之一。
本发明又一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包括所述的格氏乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液。
在本发明的一些实施方案中，所述药物组合物呈单剂量形式，所述药物组合物含有日剂量为105-1012CFU的所述的格氏乳杆菌。
在本发明的另一些实施方案中，所述药物组合物呈适于外用或者口服的剂型。
本发明中所用的“生殖道感染”是指动物中的雌性或人类中女性的生殖道感染。
目前，也有报道利用乳杆菌预防或治疗女性生殖道感染，例如鼠李糖乳杆菌GR-1和罗伊氏乳杆菌RC-14的组合菌，这两株菌已经被公认且被广泛商业化，作为维护女性生殖道健康的益生菌菌株。产品的品牌很多，有Jarrow Formulas,Blackmores，Renew life和Clinicans。但其菌种非生殖道优势菌种，且相关临床研究仅限于欧美人群，缺少亚洲人群疗效评估。
利用抗生素和栓剂进行治疗又存在诸多缺点。例如，甲硝唑、替硝唑、克林霉素等抗生素，其作用是杀死入侵的厌氧病原细菌，从而治疗细菌性阴道炎。但同时也抑制了阴道益生菌乳杆菌的生长，无法重建健康的菌群结构。咪康唑、克霉唑等栓剂，主要用于霉菌性阴道炎，其作用机制是抑制念珠菌等真菌细胞膜的固醇合成，影响细胞膜通透性，抑制真菌生长，导致死亡。该药物常用于栓剂，具有一定使用限制性，造成诸多不便，且不正当使用会造成二次感染。
而口服益生菌的方法干预肠道菌群调节免疫系统，局部使用补充生殖道乳酸杆菌的丰度，减少传统抗生素治疗带来的弊端，在抑制或清除病原菌的同时帮助菌群恢复稳态，大大提高治愈率，降低复发率，帮助HPV转阴，有效治疗或预防生殖道微生物感染疾病，解决临床一大难题。
本发明的发明人从诸多人体共生单菌库里筛选出一株女性生殖道益生菌格氏乳杆菌 (Lactobacillus gasseri)TM13-16，该菌株是一株全新的分离株，其具有较强产L-乳酸、 D-乳酸和过氧化氢的能力，强耐酸碱，并对大多抗生素敏感，同时有很强的共凝集能力，对人阴道上皮细胞也表现出强粘附能力，此外，对常见的阴道感染的致病菌有强抑菌能力的格氏乳杆菌TM13-16，可作为食品、保健品、外用或口服药品开发以预防、治疗或辅助治疗女性生殖道感染的病症。本发明中的格氏乳杆菌通过产生乳酸和过氧化氢等分泌物，以抑制生殖道感染致病菌的生长，用于预防和/或治疗生殖道感染疾病，尤其降低复发率，毒副作用小，效力持久。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
保藏信息：
菌株名称：Lactobacillus gasseri TM13-16
保藏日期：2018年8月24日
保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)
保藏编号：GDMCC No:60405
保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1：格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16的基因组图谱；
图2：格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16的益生通路注释结果；
图3A：格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16与商业菌株L-乳酸的比较；
图3B：格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16与商业菌株D-乳酸的比较；
在图中3A和3B中，RC-14表示罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)RC-14，GR-1表示鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GR-1，D表示德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)，TM13-16表示本发明中的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16；
图4：实施例9中各实验组中格氏乳杆菌的菌数；
图5：实施例9中个实验组中加德纳杆菌的菌数。
具体实施方式
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例的实验中所用到的试剂，如无特殊说明，均可通过市售获得。
实施例1：格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16的分离鉴定
1、样品采集
分离样品来自于一位健康人粪便，将粪便采集至无菌的样品管中，1h内带回实验室进行分选。
2、分离纯化
收集的新鲜样品立刻转移至厌氧操作箱中，取0.2g样品于1ml无菌的PBS(磷酸缓冲液)中，充分震荡混匀，然后进行梯度稀释涂布，培养基采用改良版PYG培养基，具体配方是(1L)：胰蛋白胨8g，大豆蛋白胨2g，多聚蛋白1g，干酪素1g，酵母粉10g，牛肉膏 5g，葡萄糖5g，K2HPO4 2g，麦芽糖0.5g，纤维二糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，硫化钠0.25g， Tween 800.5mL，Cysteine-HCl·H2O 0.5g，甘油0.5mL，乙酸钠5g，血红素5mg，维生素 K11μL，无机盐溶液(每升无机盐溶液含有CaCl2·2H2O 0.25g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO4 1g，KH2PO4 1g，NaHCO3 10g，NaCl 2g)40mL，刃天青1mg，加入蒸馏水至1L，调节pH 至6.8～7.0。涂布的平板置于37℃厌氧培养，厌氧的气体组分为N2：CO2：H2＝90：5：5。培养3天后，挑取单菌落进行划线分离，获得每株单菌的纯培养菌株。
3、菌种保藏
对获得的纯培养菌株进行培养，至浓度约为109CFU/mL，取400μL菌液添加40％甘油 400μL，使其甘油浓度达到20％，然后进行-80℃超低温保藏。
按照如下操作步骤制作菌株真空冻干粉，并保藏至广东省微生物菌种保藏中心GDMCC No:60405。
将安瓿管和保护剂经高压灭菌待用，对过夜培养的菌液进行划线，37℃培养24h，观察未发现杂菌污染后进行以下操作。菌液经离心收集并用灭菌生理盐水洗涤，加入2～3mL 脱脂牛奶保护剂，悬浮制成菌落数为108～1010个/mL菌悬液，并分装在无菌安瓿管中，置于-80℃冰箱中预冻1～2小时。按照《冷冻干燥机标准操作规程》，在冷冻干燥机中进行冷冻干燥8～20h，直至冻干为止。冻干后取出样品安瓿管，按照《真空安瓿熔封机标准操作规程》，将安瓿管颈部棉塞以下处用强火焰拉细进行熔封。
4、16S rDNA鉴定
将获得的分离菌株在液体PYG培养基中培养24h，取1mL菌液进行10000r/min离心5min，收集菌体，提取基因组DNA。以基因组DNA作为模板，使用16S rDNA通用引物进行PCR扩增，扩增体系为：10×PCR buffer，3μL；dNTP，2.5μL；27F (5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’，如SEQ ID NO:1所示)，0.5μL；1492R (5’-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’，如SEQ ID NO:2所示)，0.5μL；Taq酶，0.3μL；模板，1μL；ddH2O，18.2μL。PCR扩增条件为：95℃预变性4min，然后95℃变性30s，57℃退火40s，72℃延伸1min30s，30个循环。将获得的16S rDNA扩增产物进行电泳检测、纯化、3730测序，获得长度为1569bp的16S rDNA序列(SEQ ID No:3)。将这段序列在genebank 中进行blast比对分析，获得TM13-16的鉴定结果为格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)。
格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16的16S rDNA序列如下：
ATGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGC GAGCTTGCCTAGATGAATTTGGTGCTTGCACCAGATGAAACTAGATACAAGCGAGCGGCGGACGGG TGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAAGAGACTGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCG GATAACAACACTAGACGCATGTCTAGAGTTTAAAAGATGGTTCTGCTATCACTCTTGGATGGACCTG CGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGA CTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCT TCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAA GCTCTGTTGGTAGTGAAGAAAGATAGAGGTAGTAACTGGCCTTTATTTGACGGTAATTACTTAGAAA GTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATT GGGCGTAAAGCGAGTGCAGGCGGTTCAATAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGGAGAA TTGCATCAGAAACTGTTGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGA ATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGG CTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCT AAGTGTTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTA CGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT AATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCAGTGCAAACCTAAGAGATTAGGTG TTCCCTTCGGGGACGCTGAGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAATGAGA CTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGG CTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGAAGCGAACCTGCGAAGGCAAGCGGATCTCTGA AAGCCGTTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCG CGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAG TCTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGATAACCTTTATAGGAGTCAGCCGTCTAAGGTAGGACAGATGA TTAGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTT
5、TM13-16的生理生化特征
在MRS培养基(购自环凯微生物科技公司)中培养48小时，TM13-16的菌落是白色不透明、光滑、圆形、边缘不规整，中间有白色凸起，菌落直径约0.5-1.5mm。在1000倍的显微镜下观察，菌体呈现细长杆状，革兰氏染色为阴性，没有芽孢和鞭毛产生。TM13-16 的过氧化氢酶反应为阳性，糖醇发酵阳性，兼性厌氧，碳源利用情况使用API 50 CHL试剂盒进行检测。结果如表1(+，表示阳性反应；-，表示阴性反应；W表示弱阳性反应)。
表1 TM13-16碳源利用结果
编号 反应 结果 编号 反应 结果
1 对照 + 26 七叶灵 +
2 甘油 - 27 水杨苷 +
3 赤藻糖醇 - 28 D-纤维二糖 +
4 D-阿拉伯糖 - 29 D-麦芽糖 +
5 L-阿拉伯糖 - 30 D-乳糖 +
6 D-核糖 - 31 D-蜜二糖 W
7 D-木糖 - 32 D-蔗糖 +
8 L-木糖 - 33 D-海藻糖 +
9 D-侧金盏花醇 - 34 菊粉 W
10 甲基-βD吡喃木糖苷 - 35 D-松三糖 W
11 D-半乳糖 + 36 D-棉子糖 W
12 D-葡萄糖 + 37 淀粉 W
13 D-果糖 + 38 糖原 -
14 D-甘露糖 + 39 木糖醇 -
15 L-山梨糖 W 40 D-龙胆二糖 +
16 L-鼠李糖 - 41 D-土伦糖 -
17 卫矛醇 - 42 D-来苏糖 -
18 肌醇 - 43 D-塔格糖 +
19 甘露醇 - 44 D-岩藻糖 -
20 山梨醇 + 45 L-岩藻糖 -
21 甲基-αD吡喃甘露糖苷 - 46 D-阿拉伯醇 -
22 甲基-αD吡喃葡萄糖苷 - 47 L-阿拉伯醇 -
23 N-乙酰葡萄糖胺 + 48 葡萄糖酸钾 -
24 苦杏仁苷 + 49 2-酮基葡萄糖酸钾 -
25 熊果苷 W 50 5-酮基葡萄糖酸钾 -
实施例2：格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16的基因组测序及物种分类和功能基因分析
1、基因组测序
将过夜培养的TM13-16菌液，在7,227g 4℃下离心10分钟，将得到的沉淀重悬于1mL Tris-EDTA中，加入50μL 10％SDS和10μL蛋白酶K(20mg/mL)在55℃下水浴2小时，使细胞裂解，并用酚-氯仿法提取DNA。并用Illumina Hiseq 2000平台对其进行测序，测序长度为双向500bp，并用SOAPdenovo对reads进行组装。经过评估后，用GCskew分析全基因组GC含量及可视化全基因组序列及功能分布(图1)。
2、菌株基因组物种分类
使用Checkm软件对全基因组序列进行比对分析，得出与该基因组最相近的物种信息为厚壁菌门-芽孢杆菌纲-乳杆菌目-乳杆菌科-乳杆菌属-格氏乳杆菌种，注释到的基因组数量为58，注释到的标记数量为449，基因组的完整度为99.22％，污染程度为0.78％。
3、益生功能基因及安全性分析
为了检查在TM13-16中与治疗生殖道感染疾病相关的代谢通路是否完善，我们分别从 KEGG的prokaryoties的数据库中，选出了与乳酸合成(Lactic acid synthesis)、过氧化氢产生 (Peroxide hydrocarbon production)和短链脂肪酸合成(short-chainfatty acid synthesis)所有相关的酶，分别建立单独的数据库。使用blastx将TM13-16的全基因序列分别与这些数据库比对，选择e-value大于等于0.01，identity大于等于60的注释结果，相关通路的酶的基因拷贝数多少用颜色深浅表示，注释到基因便证明菌株有该功能，基因拷贝数越多则证明功能越强(图2)，基因组未注释到抗生素抗性基因、毒力因子、质粒、转移元件、噬菌体及病毒，证明该菌株可安全使用。
实施例3：格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16产生的生物活性物质
TM13-16的生物活性物质主要考察代谢产物中的L-乳酸含量，D-乳酸含量和过氧化氢产生情况。
1、样品预处理
将菌株TM13-16接种至MRS培养基中，分别在好氧和厌氧条件下，于37℃培养24h。
各取1mL菌液进行8000r/min离心5min，取上清，待检测L-乳酸和D-乳酸含量。
再各取1mL菌液加入溶菌酶(终浓度为1mg/mL)，37℃静置15min，8000r/min离心5min，取上清，待检测过氧化氢浓度。
2、测定方法
用L-Lactic Acid(L-Lactate)Assay Kit和D-Lactic Acid(D-Lactate)AssayKit(购自 Megazyme Inc.US)按照标准操作手册测得L-乳酸和D-乳酸含量。
用过氧化氢测定试剂盒(比色法)(购自南京建成生物工程研究所)按照标准操作手册测得过氧化氢含量。
3、实验结果见表2。
表2 TM13-16乳酸及过氧化氢产量测定
Figure RE-GDA0002904613690000091
4、与商业菌株比较
本发明选择格氏乳杆菌GDMCC 60092以及市售鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus GR-1)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri RC-14)和德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii) 作为对照试验，实验方法同上，结果表明在厌氧条件下，TM13-16的乳酸产量显著高于其他菌株，尤其是L-乳酸，结果见图3A和3B。同时，本发明与格氏乳杆菌GDMCC 60092的产酸能力进行比较，TM13-16(7.9844g/L乳酸总量)高于格氏乳杆菌GDMCC 60092的乳酸产量(5.8280g/L乳酸总量)。
实施例4：格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16抑制生殖道感染致病菌的能力鉴定
1、TM13-16抑制大肠杆菌E.coli的能力鉴定
首先将2.5μL过夜培养的TM13-16和格氏乳杆菌GDMCC 60092的菌液分别点种在MRS固体培养基上，在厌氧条件下，于37℃培养24h，获得菌斑。配制含有0.5％琼脂的LB培养基， 121℃高温高压灭菌20min后，待温度降至50-60℃，再将500μL 107CFU/mL的E.coli与10mL 该半固体培养基混合，并倒入点种有TM13-16菌斑的平板上，待培养基凝固后，在厌氧条件下，于37℃培养24h后，观察并测量得TM13-16抑菌圈直径大小为1.37±0.17cm，格氏乳杆菌GDMCC 60092抑菌圈直径大小为0.73±0.21cm，说明本发明中的格氏乳杆菌TM13-16对大肠杆菌的抑制能力优于格氏乳杆菌GDMCC 60092。
2、TM13-16抑制加德纳杆菌Gardnerella vaginalis BNCC337545的能力鉴定
首先将2.5μL过夜培养的TM13-16和格氏乳杆菌GDMCC 60092菌液分别点种在MRS固体培养基上，在厌氧条件下，于37℃培养24h，获得菌斑。配制含有0.5％琼脂的加德纳杆菌哥伦比亚血平板培养基，121℃高温高压灭菌20min后，待温度降至50-60℃，再将500μL107CFU/mL的Gardnerella vaginalis BNCC337545与10mL该半固体培养基混合，并倒入点种有TM13-16菌斑的平板上，待培养基凝固后，在厌氧条件下，于37℃培养24h后，观察并测量得抑菌圈直径大小为0.74±0.26cm，格氏乳杆菌GDMCC 60092抑菌圈直径大小为 0.59±0.22cm，说明本发明中的格氏乳杆菌TM13-16对加德纳杆菌的抑制能力优于格氏乳杆菌GDMCC 60092。。
3、TM13-16抑制白色念珠菌Candida albicans SC5314的能力鉴定
将过夜活化的TM13-16和格氏乳杆菌GDMCC 60092分别与SC5314共同接种至改良PYG培养基中，在厌氧条件下，于37℃培养24h，获得混合菌液。将其连续稀释并涂布于 PDA真菌培养平板，在好氧条件下，于37℃培养24h后，菌落计数。同时用只接种了TM13-16 的作为阴性对照，用只接种了SC5314的作为阳性对照。计数结果显示TM13-16为8.21x103 CFU/mL；格氏乳杆菌GDMCC 60092为1.02x104CFU/m；阳性对照组为8.60x105CFU/mL；阴性对照为0CFU/mL。结果表明格氏乳杆菌TM13-16可以有效抑制白色念珠菌Candida albicansSC5314的生长，并且抑制效果明显优于格氏乳杆菌GDMCC 60092。
实施例5：格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16的抗生素敏感情况
考察TM13-16对常见15种抗生素的敏感情况，采用药敏纸片法进行实验，取培养至对数期的TM13-16的菌液100μL进行平板涂布，将抗生素药敏片贴在平板表面，37℃培养48h，测量抑菌圈大小，其结果如表3。
表3 TM13-16的抗生素敏感情况
抗生素 抑菌圈直径(cm) 抗生素 抑菌圈直径(cm)
氨苄西林 3 头孢曲松 3
杆菌肽 0 万古霉素 1.9
青霉素 3.5 苯唑西林 1.5
卡那霉素 1.5 阿莫西林 2.5
四环素 3 阿奇霉素 1.8
呱啦西林 3.1 克林霉素 0
红霉素 2.8 庆大霉素 0
氯霉素 2.7
结果显示，TM13-16对杆菌肽、克林霉素和庆大霉素有抗性，对其他12种抗生素敏感，可以安全使用。
实施例6：格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16对酸和胆盐的耐受能力
因人益生菌到达肠道需要经过胃和小肠，因此需要经历pH2.5左右的胃酸和0.3％浓度的胆盐。只有具有酸和胆盐耐受的菌株才能到达肠道发挥益生作用。所以本实施例对TM13-16的酸和胆盐耐受情况作了考察。
1、TM13-16的酸耐受情况
分别配制pH 2、pH 3、pH 4、pH 4.5、pH 7的MRS培养基，将100μL浓度为1.2E+9 过夜培养的TM13-16菌液接种至不同pH的MRS培养基中，37℃培养24h后对菌液进行平板涂布计数。结果显示TM13-16在pH 2、pH 3、pH 4、pH 4.5、pH 7的条件下不仅可以存活，而且可以生长(表4)。
表4 TM13-16的酸耐受情况
Figure RE-GDA0002904613690000111
2、TM13-16的胆盐耐受情况
分别配制含有0.05％、0.1％、0.2％、0.3％胆盐的MRS培养基，将100μL浓度为1.2E+9 过夜培养的TM13-16菌液接种至不同胆盐含量的MRS培养基中，37℃培养24h后对菌液进行平板涂布计数。结果显示TM13-16在0.05％、0.1％、0.2％、0.3％胆盐的条件下不仅可以存活，而且可以生长(表5)。
表5 TM13-16的胆盐耐受情况
Figure RE-GDA0002904613690000112
结果表明：本发明的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16对酸和胆盐耐受能力强。
实施例7：格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16定植能力的评估
1、TM13-16自凝集能力的评估
将过夜培养的TM13-16菌液分装10mL在15mL试管中，取最上层菌液，用紫外分光光度计测得OD600处的吸光值。室温静置30min，再取最上层菌液，用紫外分光光度计测得OD600 处的吸光值。比较前后的吸光值，差值越大表示自凝集能力越强。TM13-16表现出了较好的自凝集能力(表6)。
表6 TM13-16的自凝集能力
Figure RE-GDA0002904613690000113
2、TM13-16与人宫颈癌细胞Hela粘附能力的评估
将培养好的Hela细胞进行消化，用不含双抗的1640完全培养液(GIBCO，购自于沃卡威北京生物技术有限公司)稀释细胞，血球计数板计数(方法见下)，使细胞浓度达到约 2×105cell/mL，滴加1mL于细胞培养皿(12或6孔板)中，于5％CO2-95％空气培养箱中37℃孵育至完全分化。
待细胞长成致密单层后，用灭菌的PBS缓冲液漂洗细胞2次，然后每孔加入lmL1640培养液和1mL过夜培养并调整至108CFU/mL的菌悬液，轻轻摇晃混匀，于37℃、5％CO2的孵箱继续孵育，每株菌样品重复三孔。
孵育90min后，取出六孔培养板，弃细菌悬液，单细胞层用灭菌的PBS缓冲液洗涤细胞5次，除去未粘附的细菌，然后加入无水甲醇固定20min。取上述经无水甲醇固定的细胞玻片，进行革兰氏染色。干燥后镜下观察计数，计算20个随机视野内100个细胞上粘附的细菌数，计算得每个细胞平均粘附46.25±22.41个。
本发明选择格氏乳杆菌GDMCC 60092作为对照试验，实验方法同上，结果显示每个Hela细胞平均粘附25.23±2.12个格氏乳杆菌GDMCC 60092，表明TM13-16与人宫颈癌细胞Hela的粘附能力更强。粘附能力越强，证明菌株的定植能力更强，更容易存留在阴道环境内进行繁殖，进而起到抑制致病菌、保护阴道粘膜、恢复阴道菌群的功能，达到治疗或预防阴道感染症状的疗效。
3、TM13-16与人阴道上皮细胞VK2E6/E7粘附能力的评估
将培养好的VK2E6/E7细胞(购于北京北纳创联生物技术研究院)进行消化，用不含双抗的1640完全培养液稀释细胞，血球计数板计数(方法见下)，使细胞浓度达到约2×105cell/mL，滴加1mL于细胞培养皿(12或6孔板)中，于5％CO2-95％空气培养箱中37℃孵育至完全分化。
待细胞长成致密单层后，用灭菌的PBS缓冲液漂洗细胞2次，然后每孔加入lmL1640培养液和1mL过夜培养并调整至108CFU/mL的菌悬液，轻轻摇晃混匀，于37℃、5％CO2的孵箱继续孵育，每株菌样品重复三孔。
孵育90min后，取出六孔培养板，弃细菌悬液，单细胞层用灭菌的PBS缓冲液洗涤细胞5次，除去未粘附的细菌，然后加入无水甲醇固定20min。取上述经无水甲醇固定的细胞玻片，进行革兰氏染色。干燥后镜下观察计数，计算20个随机视野内100个细胞上粘附的细菌数，计算得每个细胞平均粘附107.35±61.88个。
本发明选择格氏乳杆菌GDMCC 60092)作为对照试验，实验方法同上，结果显示每个 VK2E6/E7细胞平均粘附31.2±4.25个格氏乳杆菌GDMCC 60092，表明TM13-16与人阴道上皮细胞VK2E6/E7的粘附能力更强。粘附能力越强，证明菌株的定植能力更强，更容易存留在阴道环境内进行繁殖，进而起到抑制致病菌、保护阴道粘膜、恢复阴道菌群的功能，达到治疗或预防阴道感染症状的疗效。
4、细胞计数
将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上；然后吸出细胞悬液少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3分钟；最后镜检，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的(细胞数/mL＝4大格细胞总数/4×10000)。
实施例8：格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16的大鼠毒性试验
本实施例所选取的大鼠为SD雌性大鼠，7周龄，体重250g±50g，大鼠饲养环境为SPF 级，实验动物分为6组，分别为3组灌胃组和3组阴道灌洗组。每组10只，共60只，均用标准饮食饲喂。
灌胃组：分3组，以不同剂量灌胃，每只大鼠经口灌胃0.5ml新鲜菌液，浓度分别为1×105、1×109、1×1012CFU/mL，每天1次，连续3天，从第1天灌胃起连续观察至第7天，大鼠均应健康存活、体重增加。
阴道灌洗组：分3组，以不同剂量灌洗阴道，每只大鼠用0.2mL新鲜菌液灌洗阴道，浓度分别为1×105、1×109、1×1012CFU/mL，每天1次，连续3天，从第1天灌洗起连续观察至第7天，大鼠均应健康存活、体重增加。
上述实验结果表明，向大鼠施用0.2×105～0.5×1012CFU天剂量的格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16，不会对大鼠的健康造成影响，未发现毒性反应，表明在该剂量下是较为安全的。
实施例9：格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16治疗大鼠生殖道感染的能力
本实施例所选取的大鼠模型为生殖道加德纳菌感染的小鼠模型，采用SD雌性大鼠，7 周龄，体重250g±250g，大鼠饲养环境为SPF级实验动物分为3组，分别为模型组、格氏乳杆菌TM13-16组、格氏乳杆菌GDMCC 60092组。每组10只，共30只，均用标准饮食饲喂。
实验分为适应期，建模期，干预期和观察期。适应期：标准饮食饲喂大鼠7天。在造模前三天皮下注射0.5mgβ-estradiol-3-benzoate，保持大鼠假发情现象。造模前观察并记录大鼠阴道是否红肿和溢液，是否有红斑和颗粒物表型特征；建模期：用过夜培养的阴道加德纳菌(购于北京北纳创联生物技术研究院)(PBS菌液)冲洗大鼠阴道，每天一次，连续冲洗3天，第4天观察并记录阴道是否红肿和溢液，是否有红斑和颗粒物等表型特征，选择符合建模要求的大鼠进行试验。干预期：共7天，模型组大鼠不作处理；格氏乳杆菌 TM13-16组和格氏乳杆菌GDMCC 60092组大鼠用分别用这两种菌株的PBS菌液冲洗大鼠阴道，每次总活菌量不低于1×108CFU/mL，每天冲洗1次，连续冲洗7天。定时观察并记录大鼠阴道是否红肿和溢液，是否有红斑和颗粒物表型特征。观察期：干预结束后3天，观察并记录大鼠阴道是否红肿和溢液，是否有红斑和颗粒物表型特征。在每次观察大鼠表型的同时，取大鼠阴道冲洗液，用定量PCR的方法检测加德纳菌的清除情况及格氏乳杆菌的定植情况。
结果显示，格氏乳杆菌TM13-16组可以定植大鼠阴道内，且定植能力优于格氏乳杆菌 GDMCC 60092组(图4)，同时有改善大鼠阴道加德纳杆菌感染并抑制其复发的效果(图5和表7)。
表7小鼠阴道表型记录结果
Figure RE-GDA0002904613690000141
本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、“一些实施方案”或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 深圳华大生命科学研究院
<120> 用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病的格氏乳杆菌
<130> PIDC3202922
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat catggctcag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagggttacc ttgttacgac tt 22
<210> 3
<211> 1569
<212> DNA
<213> 格氏乳杆菌TM13-16（Lactobacillus gasseri TM13-16）
<400> 3
atgagagttt gatcctggct caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg 60
agcgagcttg cctagatgaa tttggtgctt gcaccagatg aaactagata caagcgagcg 120
gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcccaagaga ctgggataac acctggaaac 180
agatgctaat accggataac aacactagac gcatgtctag agtttaaaag atggttctgc 240
tatcactctt ggatggacct gcggtgcatt agctagttgg taaggtaacg gcttaccaag 300
gcaatgatgc atagccgagt tgagagactg atcggccaca ttgggactga gacacggccc 360
aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc 420
aacgccgcgt gagtgaagaa gggtttcggc tcgtaaagct ctgttggtag tgaagaaaga 480
tagaggtagt aactggcctt tatttgacgg taattactta gaaagtcacg gctaactacg 540
tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggatttatt gggcgtaaag 600
cgagtgcagg cggttcaata agtctgatgt gaaagccttc ggctcaaccg gagaattgca 660
tcagaaactg ttgaacttga gtgcagaaga ggagagtgga actccatgtg tagcggtgga 720
atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc tctctggtct gcaactgacg 780
ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag gattagatac cctggtagtc catgccgtaa 840
acgatgagtg ctaagtgttg ggaggtttcc gcctctcagt gctgcagcta acgcattaag 900
cactccgcct ggggagtacg accgcaaggt tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc 960
acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga 1020
catccagtgc aaacctaaga gattaggtgt tcccttcggg gacgctgaga caggtggtgc 1080
atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc 1140
ttgtcattag ttgccatcat taagttgggc actctaatga gactgccggt gacaaaccgg 1200
aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct 1260
acaatggacg gtacaacgag aagcgaacct gcgaaggcaa gcggatctct gaaagccgtt 1320
ctcagttcgg actgtaggct gcaactcgcc tacacgaagc tggaatcgct agtaatcgcg 1380
gatcagcacg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg 1440
agagtctgta acacccaaag ccggtgggat aacctttata ggagtcagcc gtctaaggta 1500
ggacagatga ttagggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta ggagaacctg cggctggatc 1560
acctccttt 1569

Claims (10)

1.一株格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)TM13-16，其保藏号为GDMCC No:60405。
2.权利要求1所述的格氏乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备产品中的应用，其特征在于，所述产品用于预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述生殖道菌群紊乱相关疾病为生殖道感染；
任选地，所述生殖道感染包括选自细菌性阴道炎、霉菌性阴道炎、滴虫性阴道炎、好氧性阴道炎、老年性阴道炎和病毒感染中的至少之一。
4.权利要求1所述的格氏乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液在制备产品中的应用，其特征在于，所述产品用于抗菌、粘附阴道上皮细胞和/或宫颈细胞、产乳酸、产H2O2。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为食品、药物或者保健品。
6.根据权利要求2-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品为药物，所述药物的给药剂量为105-1012CFU/天。
7.一种食品、药物或保健品，其特征在于，所述食品、药物或保健品包括权利要求1所述的格氏乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液。
8.根据权利要求7所述的食品、药物或保健品，其特征在于，所述食品、药物或者保健品选自预防和/或治疗生殖道菌群紊乱相关疾病的产品、抗菌的产品、粘附阴道上皮细胞和/或宫颈细胞的产品、产乳酸的产品、产H2O2的产品中的至少之一。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的格氏乳杆菌或其发酵产物或其菌悬液或其培养液，
任选地，所述药物组合物呈单剂量形式，所述药物组合物含有日剂量为105-1012CFU的所述的格氏乳杆菌。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物呈适于外用或者口服的剂型。
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