TWI627276B - 新穎之卷曲乳酸桿菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）菌株 - Google Patents

新穎之卷曲乳酸桿菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）菌株 Download PDF

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Abstract

本發明是有關於一種鑑定為IP174178且以寄存編號I-464寄存於CNCM的單離卷曲乳酸桿菌，或與IP174178具有相同特徵的單離菌株。本發明亦有關於一種包括此一菌株的醫藥組成物或營養組成物，以及其用於治療或預防生殖器感染的用途。

Description

新穎之卷曲乳酸桿菌(LACTOBACILLUS CRISPATUS)菌株
本發明是有關於一種由健康組織樣本所分離的新穎特異性卷曲乳酸桿菌菌株，以及有關於具有相同特徵的任一種菌株和包含該菌株的組成物。
在健康女性中，泌尿生殖器菌叢包含將近50種不同的微生物物種。在這些微生物中，95%的族群是由不同的乳酸桿菌菌株(包括德得來因氏桿菌(Döderlein’s bacillus))所組成。這些乳酸桿菌藉由各種機制有助於保護免於病原體，包括製造過氧化氫、乳酸以及細菌素、抑制病原體附著與擴散。具體而言，這些乳酸桿菌藉由從存在於陰道黏液中的肝醣製造乳酸來維持酸性pH。因此，陰道菌叢中許多病原體(諸如陰道加德納菌、二路普雷沃爾菌、淋病雙球菌、黴漿菌、動彎桿菌屬以及尤其是白色念珠菌)的生長受到抑制。
因此，正常的陰道菌叢主要是由乳酸桿菌組成，在黏膜表面上形成保護性生物膜。陰道的特定乳酸桿菌尤其為卷曲乳酸桿菌、詹氏乳酸桿菌與陰道乳酸桿菌。
70-75%的女性在她們生育年紀期間至少感染一次陰門陰道念珠菌症，約40至50%會發生第二次。復發型陰門陰道念珠菌症的發病率(定義為每年至少4個事件，包括藉由真菌檢驗確認有2次)已估算為5-8%。這個良 性疾病對患者的生活品質有非常負面的衝擊，且產生龐大的健康照護支出。因為這個疾病為多因子病理機制，此病理學難以治療。
使用經口或陰道抗真菌劑的傳統維持療法必須持續至少6個月，但復發率仍然很高，其中60-70%女性於治療中止後在兩個月內復發。此外，抗真菌劑常有副作用，且其長期使用可能促使細菌性陰道炎發生。
細菌性陰道炎是因為正常陰道菌叢的性質與數量不平衡所致，其可能導致乳酸桿菌實質上完全消失(對厭氧性菌叢有益)，還有出現諸如陰道加德納菌與陰道阿托波氏菌的細菌(涉入細菌性陰道炎)。
細菌性陰道炎是陰道感染中最常見的一種，發生率為15%至30%。這種女性的良性病理學在懷孕期間可能會是嚴重的，因為它可能造成早產、低出生體重與自發性流產。
細菌性陰道炎與陰道微生物菌叢的其他不平衡現象通常是藉由抗生素療法來治療。這種治療有抗生素治療的典型缺點，且被證實越來越沒效。此外，其旨在消除病原體菌叢，但也摧毀了正常的有益菌叢。
有益乳酸桿菌的經口或陰道投藥已被描述會促進陰道健康並且治療生殖器感染。具體而言，專利申請案WO84/04675、WO2000/035465、US2002/0044926及WO2006/045475描述經口或陰道投與乳酸菌會促進陰道健康並預防陰門陰道念珠菌症復發。
較佳的乳酸桿菌為鼠李醣乳酸桿菌以及德得來因氏桿菌(陰道嗜酸乳酸桿菌)。專利案US6,093,394,、US6,468,526及US7,807,440和專利申請案US2010/0151026描述投與特定卷曲乳酸桿菌菌株。
在這些菌株中，提到下列卷曲乳酸桿菌菌株： - 以寄存編號DSM 16735、16736、16738、16739、16740、16741、16742與16743寄存於DSMZ(德國)的卷曲乳酸桿菌菌株，如專利申請案EP 1 824 500中所述；此等菌株能夠定殖陰道黏膜並因而促進陰道健康；它們也具有附著至表皮細胞的良好特徵；- 以寄存編號I-3483、I-3484與I-3486寄存於CNCM(法國)的卷曲乳酸桿菌菌株，如專利申請案EP 1 812 023中所述；依據此等菌株附著至表皮細胞的能力篩選它們；它們對胃環境的酸性pH表現良好的抗性，以及證實有抗病原體效用；- 以寄存編號P-20558寄存於BCCM/LMG(比利時)的卷曲乳酸桿菌菌株；此菌株在棉塞輔助下與其他乳酸菌株一起使用來投與，此菌株具有能夠定殖陰道腔，包括在月經期間；以及- 以寄存編號202225寄存於ATCC(USA)的卷曲乳酸桿菌菌株，如EP 1 011 721 B1中所述；此菌株對表皮細胞附著良好、存活率長(尤其在有保存基質的情況下)，以及乳酸與H2O2的產量良好。
此等益生性菌株中的大多數是由健康女性的陰道樣本分離而來，無法使用肝醣作為可發酵碳源(Martín R.et al.,2008)。但是，這個特徵是有利的，因為陰道黏膜通常缺乏葡萄糖，且益生性菌株僅能在有可發酵碳源的情況下繼續生產乳酸。
本發明是有關於一種鑑定為IP174178的新穎單離卷曲乳酸桿菌菌株，在2012年6月22日以寄存編號CNCM I-4646寄存於CNCM，以及具有相同特徵的任一種卷曲乳酸桿菌菌株。
在下面說明中，任何提及卷曲乳酸桿菌IP174178者將意指此菌株以及任何具有相同特徵的卷曲乳酸桿菌菌株。
此新穎菌株IP174178具有下列結構性特徵：- 其生長在好氧-厭氧條件中；- 其重複序列-PCR(rep-PCR)形態呈現於第1圖中；- 其16S核醣體DNA序列呈現於SEQ ID NO：1中。
其主要功能性特徵為：- 其H2O2與乳酸生產率高(超過7 g/公升)；- 其能依賴肝醣作為唯一碳基質而生長；- 其對膽汁具有抗性；- 其抑制病原體發展的能力。
本發明亦有關於包括至少109 CFU此菌株卷曲乳酸桿菌IP174178單獨或與其他益生性菌株或其他活性成分組合的醫藥組成物。
本發明亦有關於此菌株IP174178供預防並治療復發型或非復發型生殖器感染的用途。
本發明是有關於一種鑑定為IP174178且以寄存編號I-4646寄存於CNCM的新穎單離卷曲乳酸桿菌菌株，以及與此單離菌株具有相同特徵的任一種單離卷曲乳酸桿菌菌株。
術語”乳酸桿菌”意指所有乳酸桿菌細菌、革蘭氏陽性細菌、不動的，具有不同外型與大小，且為兼性厭氧菌。大多數乳酸桿菌將乳糖與其他單糖轉化成乳酸。它們在陰道與腸胃道中被發現且它們構成腸與陰道菌叢的 主要組份。
在歐洲、美國及日本，卷曲乳酸桿菌是陰道菌叢的主要物種之一(Antonio,MAD et al.,1999)。
單離菌株卷曲乳酸桿菌IP174178具有下列功能性特徵：- 其H2O2與乳酸產量高(超過7 g/公升)；- 其能依賴肝醣生長，肝醣是由陰道黏膜分泌的一種內源性基質；- 其對酸性pH及膽汁具有抗性；- 其抑制病原體發展的能力；- 附著於陰道表皮細胞。
依賴肝醣生長的能力為相對罕見，且對於想要在生殖道中發展的菌株來說是尤其有益，在生殖道中通常沒有葡萄糖，且在生殖道中唯一碳源為肝醣。因此即便在沒有葡萄糖的情況下，此菌株仍能持續生產乳酸(見表5)。
本發明亦有關於一種包括菌株卷曲乳酸桿菌IP174178的醫藥組成物。
在本發明的組成物中，每公克組成物的細菌數目較佳大於108，且尤其是介於108及1010。依據本發明的一個典型態樣，該組成物包括至少109 CFU的卷曲乳酸桿菌菌株。術語”CFU”意指”菌落形成單位”且測量單位通常為熟習技藝者認可來定量能夠建立菌落的細菌。
較佳地，卷曲乳酸桿菌菌株經冷凍乾燥。該菌株可以是組成物中唯一經冷凍乾燥的元素，但較佳該菌株於冷凍乾燥步驟之前或之後在包括添加其他組成成分的介質中被冷凍乾燥。
依據本發明的另一典型態樣，該醫藥組成物進一步包括熟習技藝者熟 知的保存基質及/或賦形劑，並視情況選用其他具有互補作用的活性成分。
依據本發明的一個典型態樣，該組成物呈粉末形式，其能置於膠囊中，或其可併入任何適當類型的載體(諸如乳劑或營養組成物)中。
具體而言，此組成物可包括下列活性成分：激素及/或抗發炎劑及/或殺菌劑及/或抗真菌劑。習於技藝者將能夠決定可與菌株卷曲乳酸桿菌IP174178有利偶合的活性成分。
依據本發明的一個較佳態樣，該組成物包括硫代硫酸鈉，較佳濃度為至少100 mg/克粉末，包括介於108及1010 CFU的卷曲乳酸桿菌IP174178。下面的實例例示說明稱為”調配物A”的組成物，其在冷凍乾燥前包括113 g/l硫代硫酸鈉，以及最終230 mg硫代硫酸鈉/g粉末。硫代硫酸鈉的存在能夠強化菌株IP174178的抗病原體效用(見表6C)。
依據本發明之組成物亦可包括其他乳酸桿菌菌株。
依據本發明，醫藥組成物可經調配供陰道投藥或供經口投藥。具體而言，測試要被經口投與的細菌對膽汁的抗性、其等對酸性pH的抗性以及其等在有膽汁存在下生長的能力。本發明菌株IP174178具有此等能使其被經口投與的特徵。
關於供經口投與的醫藥組成物，適當的調配物為錠劑、膠囊、粉末、顆粒、溶液與口服懸浮液。
關於供陰道投藥的醫藥組成物，適當的調配物為乳劑、膠囊及陰道栓劑與棉塞。
依據本發明的組成物具體而言意欲要使用在治療生殖器感染，諸如陰道炎與念珠菌症。
術語”陰道炎”意指一種陰道微生物菌叢的不平衡現象。其特徵在於乳 酸桿菌消失且病原性細菌(諸如上面列出的彼等)倍增。
術語”念珠菌症”意指一種由念珠菌屬的酵母菌造成的陰道感染。此等感染與病原體存在有關，具體而言屬於白色念珠菌、陰道加德納菌、黴漿菌或動彎桿菌屬的家族。
白色念珠菌在念珠菌屬中是最為重要且最為熟知的酵母菌物種。它會造成主要為消化與生殖器黏膜的真菌感染(念珠菌症(candidiasis)，也被稱為念珠菌症(candidosis))。
陰道加德納菌是一種具有型態為多型態桿狀的細菌或球桿菌。它是一種在陰道炎(非特異型陰道炎)病例中常見的細菌，不論是作為唯一的病原性細菌或與其他細菌組合。其生產能影響人類細胞的打孔毒素。其亦可在血液與尿液以及在咽部中發現。
術語”黴漿菌”意指超過一百個物種之細菌家族，其等不會製造細胞壁且因此對靶定細胞壁的抗生素(青黴素或β-內醯胺)家族不具敏感性。此等細菌是許多性傳染病的病因。具體而言，人黴漿菌是生殖器感染(尿道炎、子宮頸炎、陰道炎、輸卵管炎)與不孕的主因，而生殖道黴漿菌是一種靈長類動物呼吸道及生殖道的寄生性細菌；因此，其可能造成生殖器感染。
動彎桿菌屬是一種厭氧性革蘭氏陽性細菌，被發現通常與細菌性陰道炎的陰道加德納菌相關聯。
本發明亦有關於一種營養組成物，包括菌株卷曲乳酸桿菌IP174178，或具有類似特徵的菌株。此一營養組成物將以食品組成物或食品補充品的形式提供。
食品組成物將由菌株卷曲乳酸桿菌IP174178組成，較佳經冷凍乾燥、與食品產品(諸如乳製品、脂質、含有穀物的產品、甜食或飲料)混合。
在本發明上下文中，該食品補充品具體而言可呈膠囊或明膠或植物材 料之軟膠囊的形式來提供。
本發明亦有關一種醫學裝置，其包括如上面所述組成物之一者，此醫學裝置具體而言為陰道棉塞、壓舌板、衛生棉、生殖器用皂等。
本發明亦有關於單離菌株卷曲乳酸桿菌IP174178供預防及治療生殖器感染(諸如陰道炎與念珠菌症)的用途。
投藥的最佳模式、給藥時間表及本發明組成物的劑型可依據一般考量建立適於某位患者之醫藥治療的要件來決定，諸如，例如患者的年齡或體重、患者整體狀態的嚴重性、對治療之耐受性及觀察到的副作用。
依據本發明的另一態樣，單離菌株卷曲乳酸桿菌IP174178用於在未帶有感染的女性體內維持有益的陰道菌叢。
依據本發明的又另一個態樣，單離菌株卷曲乳酸桿菌IP174178用來在抗生素治療後回復有益的陰道菌叢。
第1圖：依據重複序列-PCR之呈樹狀圖形式的基因型型態比對的圖式。
第2圖：依據重複序列-PCR之呈相似度矩陣形式的基因型型態比對的圖式。
第3圖：菌株IP174178附著至陰道表皮細胞的測試。
實施例 實施例1-分離與篩選菌株卷曲乳酸桿菌IP174178
對分離自健康女性的10個菌株施行7種試驗，並針對其生產過氧化氫(H2O2)的能力進行預篩選。這些測試為：在經修飾MRS培養基中的生 長(Man JC et al.,1960)；生產H2O2的能力、生產乳酸、附著至陰道細胞株之細胞的能力、抑制某些生殖器病原體的能力(圓盤抑制法)以及咪唑尼達唑抗性。
在這些基本測試之後，鑑定出特別感興趣的三個菌株，具體而言是針對其等H2O2及乳酸的高產量，這三個菌株在有肝醣的情況下是生長測試的主體，僅菌株IP174178具有使用肝醣作為碳源的能力，肝醣是由陰道黏膜分泌的內源性基質。此外，這個菌株在有膽汁的情況下表現出最佳生長。
所得結果如下：
實施例2-生化型態
由VITEK II Compact system(bioMérieux)得到生化型態，VITEK II Compact system是一種用於藉由比較發酵特定糖類的能力來鑑別細菌的自動化系統。吾人得到下列生化型態：11033303414010。
實施例3-基因型型態
在DiversiLab system(bioMérieux)上建立菌株IP174178的基因型型態。其對應於基因體的非編碼重複序列內的擴增DNA。這些片段的排列及大小對各個菌株來說是獨一無二的，且因而使其能夠針對各菌株建立獨有的型態(見第1圖)。
吾人接而將這個重複序列-PCR型態與26個卷曲乳酸桿菌菌株所具者比對，26個卷曲乳酸桿菌菌株包括11個保存於巴斯德研究所的菌株，俾以確認該菌株的獨有特徵(見第2圖)。在各個情況下，菌株IP174178包含許多差異性，證實其獨特性。
此外，菌株IP174178能夠僅只依賴肝醣生長(其對於移植於陰道黏膜中是個優點)，且具有H2O2及乳酸的高生產率。
實施例4-特定寡核苷酸的定序及鑑定
使用Roche 454技術進行菌株IP174178的定序。在這個工作之後，進行註解。結束時，鑑定出1982個編碼蛋白質的基因。
定序操作使其能夠對菌株進行互補分子生物作業，俾以界定出特異性PCR引子對。
在結束時，選出三個PCR引子且這三個PCR引子在30個循環的擴增步驟期間對菌株具有特異性。
實施例5-製備”調配物A”
在下列培養基中培育菌株IP174178：116 g/l牛奶、15 g/l右旋糖、10 g/l經自溶的酵母菌、2 ml/1 Tween。
在接種培養基之後，在37℃的溫度下藉由適當的恆溫控制裝置維持發酵持續48至72小時。在發酵結束後，將已達到計數超過或等於108 CFU/ml的培養物倒入混合槽內。快速震盪培養物以破壞粗產物並加入下列冷凍乾燥佐劑：110 g/l牛奶、101.5 g/l FOS、9.5 ml/l麩胺酸鈉、5.25 g/l抗壞血酸、113 g/l硫代硫酸鈉。
接著依據習於技藝者熟知的標準條件進行冷凍乾燥：在不鏽鋼盤上以無菌的方式攪動細菌、在-40℃下快速冷凍，接著在-22℃下進行昇華操作。接著在37℃下進行培育。
繼而在經控制的大氣下將所得產物壓碎並過濾。所得粉末可有利地與1%硬脂酸鎂混合，俾益於填充膠囊。
由此所得的粉末分配於尺寸”0”膠囊中，以每個膠囊350 mg粉末的數量。
實施例6-菌株IP174178及”調配物A”的功能性特徵
與如實施例5中所出現般，將鑑定為IP174178的菌株與呈其”調配物A”者以平行或單獨測試，以測定其功能性特徵。
在下面的實施例中，用語”純菌株”或”單獨菌株”或”菌株IP174178”意指沒有佐劑的菌株IP174178，且尤其是沒有調配物A的化合物，在保存於冷凍小瓶的標準保存介質中之後由瓊脂上單離的菌落而來。
抗微生物活性 證實過氧化氫的產量：
將乳酸菌培養在補充有維生素B12、過氧化酶與四甲基聯苯胺的MRS瓊脂培養基中。在厭氧生活中培育48小時後，將培養皿與環境氧氣接觸而產生過氧化氫的菌落快速地轉為藍色。0至5的任意標尺用來註記H2O2產量的強度。
上面報導的結果說明：‧依據所用任意標尺，過氧化氫產量為最高；‧該菌株以實際上相同的方式使用葡萄糖以及肝醣，代謝路徑能夠合成D-乳酸及L-乳酸。因為肝醣在陰道環境中是主要碳源之一，這個菌株具有在活體內生產乳酸所需的特徵。
抑制白色念珠菌及陰道加德納菌的生長
目標：評估乳酸桿菌菌株抑制病原性菌株(白色念珠菌)生長的能力：對陰道加德納菌施用適用於此病原體的相同程序。
程序的說明：
測量病原體單獨以及在乳酸桿菌菌株培養物存在下的生長，測量滴定量為T0至T28h。
用於製備接種物以及用於讀取滴定量的培養基：- 用於白色念珠菌的薩蒲洛氏培養液及薩蒲洛氏瓊脂(在37℃)- 用於乳酸桿菌菌株的MRS培養液/瓊脂。
測試中所使用的培養液為病原體培養基和益生菌培養基的均質混合物。
準備測試：
製備接種物：
- 白色念珠菌：培養在薩蒲洛氏培養液-0.3 ml於30 ml中，在37℃下48小時。
- 益生性菌株：
‧調配物A：0.35 g調配物A粉末置於10 ml的MRS培養液中-於37℃培養箱中48小時。
‧純菌株IP174178 ：0.2 ml的純菌株，來自在瓊脂上分離的菌落，預先保存於冷凍小瓶的保存介質中，置放在10 ml的MRS培養液中-於37℃培養箱中48小時。
製備對照念珠菌：
為製造對照念珠菌，將接種病原性菌株(滴定量接近1．108 CFU/ml)的5 ml薩蒲洛氏培養液置換成5 ml的非接種MRS培養液。
使接種物接觸：
在此等不同形態下將5 ml病原性菌株置換成5 ml本發明菌株。
在T0、T4h、T24h及T28h時取得樣本並測定滴定量。結果表示為CFU/ml。在三個比較的情況下，於T0時以CFU計的濃度當然不同(因為工作條件)，但在T0的數值為相同量級，因而差異性對結果不具影響。
表6C. 白色念珠菌的抑制-在菌株IP174178的調配物中硫代硫酸鈉濃度的影響
調配物A1及調配物A2是藉由如對調配物A所進行者來製備，除了調配物A1不含有硫代硫酸鈉而調配物A2僅含有50 g/l硫代硫酸鈉。在三種情況下測量白色念珠菌生長的抑制。
在此表中，結果表示為在T0與各取樣點(T4h、T24h及T28h)之計數間CFU數目降低的十進位對數(log10)。
結果呈現在上面，在表6A-6C中，其指出：
‧病原性白色念珠菌生長的抑制為完全24小時，不論是由純菌株或由調配物A中的菌株。但是，僅調配物A能夠在24小時後達到完全抑制。
‧在單獨菌株或在呈其調配物A形式的存在下，病原性陰道加德納菌生長的抑制在共培養24小時後為完全的；然而使用呈其調配物A的菌株，病原體生長的抑制更快(4小時後)。
‧調配物A中硫代硫酸鈉的存在使其對菌株IP174178的抗病原體效用成為可能。此外，硫代硫酸鈉的濃度越高，則在24小時所觀察到的抑制越大。
抗胃液性
依據個體以及尤其是日期，胃的pH在2.5與5之間改變。在pH=2.5、 3及4的培養基中測試菌株IP174178單獨或呈調配物A形式的抗性。結果表示為細菌隨時間降低的數量。
結果顯示，在90分鐘之後，於pH=3或4下，細菌損失少，少於一個log10。在pH=2.5下的抗性較低，尤其當菌株以其調配物A形式來使用時。
於3%膽汁存在下，亦隨時間(60、120、180及240分鐘)測試對膽汁的抗性。結果是藉由比較在無膽汁對照培養基中與在含有3%膽汁的培養基中的存活細菌數目來表示。
在240分鐘(4小時)之後，在沒有膽汁的情況下培育的對照以及有膽汁的培養基之間的差異性小於一個十進位對數，表示細菌IP174178的生長僅受膽汁存在些微影響。
對抗生素的抗性
對陰道表皮細胞CRL-2616的附著
結果呈現於第3圖中，且僅與單獨菌株IP174178有關。隨著時間，IP174178細菌對CRL-2616細胞的附著百分比增加，並在3小時後達到15%附著，而感染倍增率為10或1。
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Claims (13)

  1. 一種鑑定為IP174178且以寄存編號I-4646寄存於CNCM的卷曲乳酸桿菌的單離菌株。
  2. 一種醫藥組成物，包括如申請專利範圍第1項之菌株。
  3. 如申請專利範圍第2項之醫藥組成物，其包括至少109CFU的該菌株。
  4. 如申請專利範圍第2或3項之醫藥組成物，其進一步包括保存基質。
  5. 如申請專利範圍第2或3項之醫藥組成物，其進一步包括硫代硫酸鈉。
  6. 如申請專利範圍第2或3項之醫藥組成物，其經調配供陰道投藥或供經口投藥。
  7. 如申請專利範圍第2項之醫藥組成物，其用於治療生殖器感染。
  8. 如申請專利範圍第7項之醫藥組成物，其中該生殖器感染係選自陰道炎及念珠菌症。
  9. 一種醫學裝置，其含有如申請專利範圍第7項之醫藥組成物。
  10. 一種營養組成物，包括如申請專利範圍第1項的菌株。
  11. 一種如申請專利範圍第1項之菌株用於製備預防及治療生殖器感染之醫藥品的用途。
  12. 如申請專利範圍第11項之用途，其中該生殖器感染係選自陰道炎及念珠菌症。
  13. 一種如申請專利範圍第1項之菌株用於製備維持或恢復有益的陰道菌叢之醫藥品的用途。
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