CN117599154A - 含有乳杆菌菌株和乳酸菌素的组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种组合物,公开了含有乳杆菌和乳酸菌素的组合物,所述组合物中乳杆菌活菌数不低于1×106CFU,组合物包含1×106~1×1010CFU乳杆菌及20~150mg的乳酸菌素。本发明组合物可用以治疗和/或预防细菌性阴道病、需氧性阴道炎等阴道感染,可在食品、药物、卫生产品等领域应用。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌技术领域,具体地,涉及含有乳杆菌菌株和乳酸菌素的组合物及其用途。
背景技术
在健康育龄女性阴道中,乳杆菌是优势菌群,占阴道菌群的70%以上。研究表明,女性生殖道内的乳杆菌主要通过产乳酸、产抑菌素来抑制病原微生物。
我国妇产科门诊患者中,生殖道感染占40.2%-55.6%。至少有2 亿人次患生殖道感染相关疾病,其中复发患者有1亿人次,由此产生的医疗费用每年高达200多亿元。调查显示,99.3%的妇科门诊阴道感染有症状患者存在阴道微生态失衡。2016年,中华医学会妇产科分会感染协作组提出阴道感染的本质是“阴道微生态失衡”。阴道微生态如果长期处于异常状态,阴道对致病微生物的抵抗力降低,往往是阴道感染反复发作或继发新感染的重要原因。
常见的阴道感染有:细菌性阴道病(BV)、外阴阴道假丝酵母菌病(VVC)、滴虫阴道炎(TV)、需氧菌性阴道炎(AV),均伴随着乳杆菌减少或消失。常规阴道感染治疗方案以“抗菌”为主,抗生素如克林霉素治疗后,BV致病菌得到抑制的同时也抑制了阴道内乳杆菌的生长。甲硝唑虽有文献报道给药剂量下不会抑制乳杆菌生长,但也无法促进乳杆菌的恢复。另外,使用抗生素后的复发率和耐药率很高。抗生素仅能抑制浮游的阴道加德纳菌,短暂控制症状,无法完全清除生物膜及在其内的阴道加德纳菌,一旦停止治疗,生物膜内的菌将再次复苏、繁殖、扩散,导致BV复发(隋龙等. 加德纳菌生物膜在复发性细菌性阴道病中的作用研究[C]//中华女性生殖道感染峰会.2014.)。一项多中心、前瞻性、开放对照试验结果显示,即使延长抗生素疗程也难以降低复发,反而增加VVC和其它不良反应发生率(SobelJack D,Ferris Daron,SchwebkeJane et al. Am. J. Obstet. Gynecol., 2006, 194:1283-9.)。隋龙等人(2014)的研究表明,甲硝唑耐药率 63.8%,克林霉素耐药率 24.1%(国外研究为 67%)。生物膜降低了细菌对抗菌药物的敏感性,增强对抗菌药物的耐药性,且致病菌株耐药性可以通过移动遗传元件获得,因此抗生素的治疗效果越来越弱甚至变得无效。
2016年,中华医学会妇产科分会感染协作组提出阴道感染的本质是“阴道微生态失衡”,提倡将阴道感染治疗目标由“对症治疗”转变为“恢复阴道微生态平衡”,由单纯的“杀灭病原菌”转变为“抗病原微生物—修复黏膜—恢复乳杆菌”的治疗模式。阴道内乳杆菌可干扰阴道加德纳菌生物膜的形成,应用阴道微生态制剂可恢复以有功能的乳杆菌为主的弱酸性环境,促进阴道微生态的平衡和免疫调节,减少阴道感染的反复发作。但是,外源添加的乳杆菌是以冻干休眠的状态给予,需在阴道内经过复苏、繁衍、定植过程才能发挥抑菌作用,阴道给予冻干乳杆菌产生的抑菌素、乳酸的量不能达到最佳的抑菌效果,使其难以治愈阴道感染。
上海交通大学药学院对目前用益生菌治疗细菌性阴道炎的临床研究表明,近10年的5个实验中,4个实验表示益生菌对减少BV复发有效果,仅1个实验表明乳杆菌对BV有治疗作用。对于益生菌联合抗生素治疗BV的8个临床实验中,2个实验结果表明在传统抗生素治疗后加用益生菌治疗没有显著治疗作用,5个实验表明在传统的抗生素治疗后加用益生菌对提高BV治愈率有显著作用,1个实验表示是否有显著差异与所选菌株有关系(钱志祥,陈代杰.益生菌治疗细菌性阴道炎的临床研究及其相关机制[J].中国抗生素杂志,2020,45(10):974-981.DOI:10.13461/j.cnki.cja.007024.)。
目前上市的阴道微生态制剂,如定君生等,远不能满足临床需求,阴道微生态制剂还有很大的发展空间。抗生素与阴道微生态制剂的组合对BV有一定益处但也同样不能避免抗生素的副作用。因此,开发益生能力更强的乳杆菌菌种和取代抗生素的治疗方法运用于预防和/或治疗阴道感染,有利于提高治愈率,同时具有巨大的临床应用价值。。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含有乳杆菌菌株和乳酸菌素的组合物,可以治疗和/或预防阴道、泌尿道感染,改善阴道健康。
为了实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
提供一种含有乳杆菌菌株和乳酸菌素的组合物,自健康育龄女性分泌物中分离出生长能力、产乳酸能力较强的阴道常见优势乳杆菌和/或其他乳杆菌,再通过高浓度乳酸菌素的胁迫生长试验选出耐受乳酸菌素的乳杆菌。
发明人发现,单独的乳杆菌,在微生态失衡的病态环境下,不能很快定植进而发挥抑菌作用,治疗阴道感染疾病;乳酸菌素可快速降低阴道pH值,直接抑制致病菌,为外源补充的乳杆菌提供有利的生长繁殖环境,将乳杆菌与乳酸菌素搭配使用,能使抑菌的协同作用最大化,有利于提高治疗阴道感染疾病的有效率。
进一步地,所述乳杆菌活菌数不低于1×106CFU;进一步地,所述乳杆菌活菌数不超过1×1010CFU。健康育龄女性平均阴道分泌物约1~3 mL,乳杆菌活菌数量在107~108CFU/mL,一般不超过1×1010CFU/mL。作为活菌制剂,施用后会定植并生长繁殖,维持到一定水平。
组合物中,乳杆菌活菌数可为1×106~1×108CFU、1×108~1×1010CFU,……等等,其中,所述乳杆菌活菌数可为范围值里的任意数值,包括两端的端点值,如,乳杆菌活菌数可为1×106CFU、1×107CFU、1×108CFU、1×109CFU、1×1010CFU等等。
进一步地,组合物至少包含20mg的乳酸菌素;
进一步地,组合物至少包含20~200 mg的乳酸菌素;
进一步地,组合物至少包含40~150 mg的乳酸菌素;
进一步地,组合物至少包含40~100 mg的乳酸菌素。
组合物中,乳酸菌素可为20~40mg、40~60mg、60~80mg、80~100mg、100~120mg、120~150mg、150~200mg、200~250mg等,其中,所述乳酸菌素的含量可为所述范围值里的任意数值,包括两端的端点值,如组合物中,乳酸菌素可为20 mg、30 mg 、40mg、50 mg、60mg、70mg、80 mg 、90 mg 、100mg、110 mg 、120mg、150mg、170 mg 、200mg、220 mg、250mg、300 mg等。
在本发明中,组合物包含1×106~1×1010CFU乳杆菌及40~100mg的乳酸菌素,所述乳杆菌有基本的益生功能和繁殖能力,并且能耐受有效剂量乳酸菌素,即含有40~100mg的乳酸菌素的乳杆菌和乳酸菌素组合物接种培养依然能维持乳杆菌的存活。
进一步地,所述植物乳杆菌菌株是具有活性的、灭活的、受抑制的、基因修饰的或被杀死的。
本发明所述乳杆菌包括但不限于以下至少其中之一经分离的菌株或其变种:植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)1-D1,保藏编号为:CCTCC NO:M 20221191、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)51S-H2,保藏编号为:CCTCC NO:M 20221194、格氏乳杆菌(Lactobacillus paragasseri)16-B12,保藏编号为:CCTCC NO:M 20221193、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii )53-D2,保藏编号为:CCTCC NO:M 20221192 。例如,本发明所述乳杆菌可以包括以下组合:
可以是植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)1-D1、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)51S-H2、格氏乳杆菌(Lactobacillus paragasseri)16-B12、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii )53-D2中的任一种菌株;
或植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)1-D1、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)51S-H2、格氏乳杆菌(Lactobacillus paragasseri)16-B12、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii )53-D2中的任意两种菌株,如,可以是植物乳杆菌1-D1和格氏乳杆菌16-B12,可以是植物乳杆菌1-D1和詹氏乳杆菌53-D2,可以是植物乳杆菌1-D1和卷曲乳杆菌51S-H2,可以是格氏乳杆菌16-B12和詹氏乳杆菌53-D2,可以是格氏乳杆菌16-B12和卷曲乳杆菌51S-H2,可以是卷曲乳杆菌51S-H2和詹氏乳杆菌53-D2。
或植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)1-D1、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)51S-H2、格氏乳杆菌(Lactobacillus paragasseri)16-B12、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii )53-D2中的任意三种菌株,如,可以是植物乳杆菌1-D1、格氏乳杆菌16-B12和詹氏乳杆菌53-D2,可以是植物乳杆菌1-D1、格氏乳杆菌16-B12和卷曲乳杆菌51S-H2,可以是格氏乳杆菌16-B12、詹氏乳杆菌53-D2和卷曲乳杆菌51S-H2;
或植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)1-D1、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)51S-H2、格氏乳杆菌(Lactobacillus paragasseri)16-B12、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii )53-D2组成的乳杆菌组合。
提供一种前述的组合物在制备治疗和/或预防阴道、泌尿道中的感染的产品中的用途。
进一步地,所述阴道感染包括但不限于细菌性阴道病、酵母性阴道炎、滴虫阴道炎、需氧性阴道炎、病毒性阴道病,尤其是细菌性阴道病和需氧菌性阴道炎;
所述阴道中的感染还包括HIV 和衣原体感染的性传播疾病、危及孕妇中胎儿的感染、早产等。
进一步地,所述细菌性阴道病主要是由阴道加德纳菌引起的;所述需氧性阴道炎是由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌、痢疾志贺菌、加德纳菌或沙门氏菌等致病菌引起的。
术语“治疗(treatment)”(也称为“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指根据治疗性方案的治疗性试剂的任何施用,所述治疗性方案达到所需效果,即部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、延迟发作、降低严重程度和/或降低特定疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征(例如改善阴道菌群结构和功能、提高阴道菌群多样性、降低炎症相关菌群丰度、治疗阴道炎)的发生率;在一些实施方式中,根据治疗性方案的治疗性试剂的施用与所需效果的实现相关。这种治疗可以针对没有表现出相关疾病、障碍和/或病症的受试者和/或针对仅表现出疾病、障碍和/或病症的早期迹象的受试者。替代地或另外地,这种治疗可以针对表现出相关疾病、障碍和/或病症的一种或多种所确定迹象的受试者。在一些实施方式中,治疗可以针对已被诊断患有相关疾病、障碍和/或病症的受试者。在一些实施方式中,治疗可以针对已知具有一种或多种易感因素的受试者,所述易感因素在统计学上与相关疾病、障碍和/或病症发展的风险增加相关。
所述产品包括但不限于药物、食品、保健品、卫生用品、食物补充剂等。
进一步地,所述组合物还包含药物上可接受的载体;所述“药物上可接受的载体”包括但不限于生理上可接受的赋形剂、稀释剂。
进一步地,所述组合物是以片剂、吮吸片剂、甜味食品、口香糖、胶囊、有肠溶衣的片剂和胶囊、栓剂、微型灌肠剂、阴道用片剂、阴道用明胶胶囊、阴道用锭剂、乳膏、凝胶、软膏、洗剂、棉塞、尿布、垫子、熔化条、避孕套、阴道栓剂、喷雾剂和临床营养品的形式施用。
乳酸菌素作为天然的抗菌剂,且是已有国家标准的原料药,运用广泛,作用类似抗生素,但作用机制不同,具专一性,完全不产生抗药性及毒性,但目前主要是口服运用,未有阴道给药和/或阴道感染方向的运用。
进一步地,所述组合物包括但不限于经口、阴道、直肠施用,滴注到膀胱中,也可以是两种或两种施用方式组合治疗施用。
提供一种卫生产品,其包含前述组合物;所述卫生产品选自棉塞、卫生巾、月经垫、尿布、肥皂、洗发剂、凝胶、软膏、乳膏、喷雾剂和洗剂。
提供一种新食物,其包含前述组合物。
提供一种用于治疗和/或预防发炎反应的方法,所述方法包括向需要其的受试者施用药学上有效量的根据前述所定义的组合物的步骤。
提供一种用于治疗和/或预防阴道炎的方法,所述方法包括向需要其的受试者施用药学上有效量的根据前述所定义的组合物的步骤。
提供一种用于治疗和/或预防发炎反应的药盒,它至少包括含有如前所述的组合物的容器。
提供一种用于治疗和/或预防阴道炎的药盒,它至少包括含有如前所述的组合物的容器。
如本文使用的,术语“包括”和该术语的变化形式不意图排除其他添加剂、组分或步骤。
有益效果
(1)本发明提供的乳杆菌与乳酸菌素组合物,乳杆菌与乳酸菌素协同,其抑菌作用优于单独使用乳杆菌,可达到快速抑制致病菌的效果。
(2)单独的乳杆菌,在微生态失衡的病态环境下,不能很快定植进而发挥抑菌作用,治疗阴道感染疾病。乳酸菌素可快速降低阴道pH值,直接抑制致病菌,为外源补充的乳杆菌提供有利的生长繁殖环境,将乳杆菌与乳酸菌素的抑菌协同作用最大化,有利于提高治疗阴道感染疾病的有效率。
(3)乳酸菌素的应用,还有利于促进患者阴道本底常见优势乳杆菌的生长,促进其增殖恢复到健康微生态状态。
(4)外源补充的乳杆菌可为乳杆菌缺失的患者快速补充乳杆菌,维持阴道健康。
(5)本发明提供的组合物相辅相成,单独使用均不能达到抑制致病菌,恢复阴道微生态的治疗目的。
(6)本发明提供的组合物安全性好,无耐药性,有望取代抗生素疗法运用于预防和/或治疗阴道感染,有机会提高治愈率和复发率,有巨大的应用价值。
附图说明
图1 SD大鼠阴道乳杆菌定植评分。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好的理解本发明,下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。本领域技术人员应当理解的是,这不应被理解为对本发明权利要求范围的限定。除有定义外,以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。同时需要注意的是,本发明中的试剂或仪器无特别说明的均为常规生化试剂或仪器,可通过市售购买得到。
菌株保藏信息:
植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)1-D1于2022年7月27日保藏于中国典型培养物保藏中心,该菌株保藏号为:CCTCC NO:M 20221191,地址:中国武汉;
卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)51S-H2,于2022年7月27日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为:CCTCC NO:M 20221194,地址:中国武汉;
格氏乳杆菌(Lactobacillus paragasseri)16-B12,于2022年7月27日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为:CCTCC NO:M 20221193,地址:中国武汉;
詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii )53-D2,于2022年7月27日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为:CCTCC NO:M 20221192,地址:中国武汉;
乳酸菌素(兴城泰格制药有限公司,批号:210226)。
本发明所述组合物包含1×106~1×1010CFU乳杆菌及40~100mg的乳酸菌素,即组合物中,具有益生功能和繁殖能力,并且能耐受有效剂量40~100mg乳酸菌素的乳杆菌活菌数不低于1×1010CFU/g。
本发明以从市售产品定君生(内蒙古双奇药业股份有限公司,国药准字S20030005,批号:202110110)中分离出的德氏乳杆菌(以下统称为DJS-H3)作为各阶段的阳性对照,通过低pH培养基筛选、扩增生长能力及钙溶圈筛选,快速分离出耐受低pH,繁殖能力强及产乳酸能力强的乳杆菌。再通过粘附Hela细胞的能力和抑菌试验筛选出定植能力强及抑制致病菌生长能力强的优势乳杆菌,最后再评价优势乳杆菌与乳酸菌素组合物的功效。其中有代表性的具体实施例如下:
DMEM 培养基: Gibco;cat:11995065
MRS 液体培养基: 环凯生物,cat:1110151
2%碳酸钙-0.8%MRS: 生工,H122BA0030
琼脂: 生工生物,A505255-0250
HeLa 细胞: 北纳生物,货号:BNCC342189
VK2/E6E7细胞:青旗(上海)生物
实施例1乳杆菌的分离
对健康育龄女性志愿者阴道分泌物进行革兰氏染色镜检及Nugent评分,选取29名健康育龄女性志愿者。将健康志愿者的阴道棉拭子置于MRS酸性(pH5.0)液体培养基,37 ℃过夜扩培增菌;取增菌液10倍梯度稀释后,取适宜梯度涂布于2%碳酸钙-0.8%MRS(生工,H122BA0030)琼脂培养基上(琼脂来源于生工生物,A505255-0250),37 ℃,培养36-48 h;于培养好的碳酸钙-MRS培养基上挑取具有明显透明圈的单菌落于MRS液体培养基中,37℃过夜培养后,对培养后的1816株菌株进行PCR扩增后送16S rRNA测序,剔除其余产酸的非乳杆菌后,选择不同样品中的乳杆菌共72株进行后续筛选试验。
其中,分离得到的菌株中,植物乳杆菌1-D1、16-B12、53-D2、51S-H2四株菌株的核苷酸序列(16S rRNA序列)分别如SEQ ID No.1~4所示。
实施例2 乳杆菌生长性能测定
乳杆菌分离阶段生长曲线数据表明,大多数乳杆菌在12 h时进入对数末期。因此,在接种12 h时采用琼脂倾注法对各菌株进行活菌数测定。在相同接种时间下,活菌数高的菌株其生长性能具有相对明显优势。挑选其中最佳生长优势的菌株和现有分离的生长能力相对优秀的阴道中常见的优势菌进行后续研究。
乳杆菌分离阶段生长曲线数据表明,大多数乳杆菌在12 h时进入对数末期。因此,在接种12 h时采用琼脂倾注法对各菌株进行活菌数测定。在相同接种时间下,活菌数高的菌株其生长性能具有相对明显优势。本实施例选择排名前25株具有生长优势的菌株进入12h活菌数试验,数据显示:在25株植物乳杆菌中,植物乳杆菌1-D1具有优秀的生长性能,繁殖能力强,12h活菌数可达到6.37×109CFU/mL,有利于商业化转化过程中的高密度发酵。
从中挑选4株最佳生长优势的菌株和阴道中常见的优势菌进行后续研究,该4株菌株的信息及12h活菌数如下表1。
实施例3 植物乳杆菌1-D1粘附能力
用乳杆菌粘附Hela、VK2/E6E7细胞的能力来评估乳杆菌的定植能力。
首先,将乳杆菌活化:取各乳杆菌50μL接入5mL MRS液体培养基中,37℃培养18-24h后取出,备转接用。乳杆菌转接:取各乳杆菌活化液50μL接入5mL MRS液体培养基中,37℃培养18-24h,12000rpm,离心2min后取出,DMEM培养基(Gibco;cat:11995065)重悬,调至0.5麦氏浊度。进行细胞布板:取复苏好的细胞500 μl 浓度为105个/mL 细胞接种于24 孔培养板中,置于二氧化碳培养箱,37℃、5% CO2 条件下过夜培养。弃去DMEM原液,PBS 清洗3次后加入500μL DMEM 培养基。最后细菌与细胞互作:取500μL浓度为108CFU/mL 活化过夜培养的、经DMEM培养基重悬的乳杆菌加入上述含有细胞的24 孔培养板中,置于二氧化碳培养箱,37℃、5% CO2 条件下分别孵育2h、4h后,PBS 清洗4次以除去未粘附的乳杆菌。加入200μL 0.25%的胰酶消化2 min,加入600μL完全培养基终止消化,吹打混匀。无菌PBS对细胞-菌悬液进行 10倍梯度稀释,选择适当梯度稀释液100μl加入一次性无菌平皿中,0.8%MRS琼脂培养基倾注混匀,凝固后将平板倒置。倒置的平板在37℃下培养48h后取出计数,每组3个平行,取平均值作为最终黏附数。乳杆菌数量越多,证明其粘附细胞的能力越强。
植物乳杆菌1-D1的粘附细胞的能力如下表2~3。通过Fisher LSD均值比较分析后发现,植物乳杆菌1-D1的粘附能力远远大于从定君生中分离的德氏乳杆菌,组间黏附数差异均为极显著,植物乳杆菌1-D1菌株对Hela细胞4h黏附数是定君生(DJS-H3)的100倍以上,对VK2/E6E7细胞4h黏附数是定君生的10倍以上。
实施例4 乳酸菌素对乳杆菌生长能力的影响
探索自阴道分离的不同种乳杆菌在(5mL体系中)250mg高剂量乳酸菌素胁迫下的存活率。
将实施例1中分离得到的各乳杆菌按1%接种量接种至含250mg乳酸菌素的MRS肉汤(250mg乳酸菌素+4.75mLMRS肉汤)中,37℃摇床培养12h后取出。对该共培液体进行10倍梯度稀释,取合适梯度稀释液100 μl加入一次性无菌平皿中,琼脂倾注计数,每组3个平行。待凝固后37 ℃倒置培养36-48h。取出,计数。探究乳杆菌在高乳酸菌素浓度下的存活率。同时将菌接入不含乳酸菌素的MRS肉汤中,所有操作同上。作为对照。各乳杆菌的存活率详见表4。
实验结果表明,高浓度乳酸菌素胁迫下各乳杆菌依然生长存活,且阴道常见优势菌群(格氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌)出现了较无乳酸菌素对照中更高的生长量,说明乳酸菌素不影响不同乳杆菌的生长,且能促进阴道常见优势菌群生长。
实施例5 不同乳杆菌及不同浓度乳酸菌素的抑菌能力
不同乳杆菌抑菌能力:用抑菌试验来评估植物乳杆菌抑制不同致病菌的能力。将0.1ml乳杆菌与0.8%MRS琼脂培养基混匀,随后制成10mm的乳杆菌菌饼。将不同的致病菌(阴道加德纳菌、金黄色葡萄球菌等)分别采用适宜其生长的培养基和生长条件活化转接后,与对应的半固体培养基混匀,分别制成致病菌平皿。将乳杆菌菌饼饼轻放在致病菌平皿表面,37℃正置培养18-24 h后取出,游标卡尺测量抑菌圈大小,来从而评估各乳杆菌的抑制致病菌的能力。具体步骤如下:
分别将植物乳杆菌和德氏乳杆菌DJS-H3活化后,取0.1mL菌液与MRS固体培养基混匀,倾注入6cm平皿内,完全凝固后,在37℃下培养48h,取出平皿,用内径10mm的打孔器在琼脂培养基上打孔,获得乳杆菌菌饼,备用。
将阴道加德纳菌接种至5%马血清-厌氧BHI液体培养基中,经活化转接后,用无氧无菌的0.9%厌氧生理盐水进行10倍稀释梯度,取1mL稀释液,与10mL含5%马血清的无氧BHI琼脂混合,倾注入9cm平皿内,待其完全凝固,备用。
将金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌和痢疾志贺菌分别接种至营养肉汤中,经活化转接后,用0.9%生理盐水将致病菌菌液稀释至100倍,取1mL稀释液与10mL营养琼脂半固体培养基混匀,倾注入9cm平皿内,待其完全凝固,备用。
将乳杆菌菌饼轻放在各致病菌平皿表面,每皿对称放4个菌饼,每株菌3个平行。将阴道加德纳菌平皿正置放入放有厌氧产气袋的厌氧密封盒中,在37℃下培养48h,将其他致病菌平皿正置放入培养箱,在37℃培养24h,游标卡尺测量各平皿的抑菌圈大小。不同乳杆菌的抑菌能力如下表5。
不同乳酸菌素抑菌能力:称取0.8g乳酸菌素加入1mL生理盐水涡旋混匀,使其浓度为0.8g/mL。连续二倍稀释。
取阴道加德纳菌100 μl接入5%马血清-BHI液体中,除阴道加德纳菌外的其余致病菌100 μl接入营养肉汤中,阴道加德纳菌37℃培养48h取出,其余菌株37℃培养18-24h,取出。
将16-B12、53-D2和51S-H2三个菌株的活化液按1:1:1比例混合制成混菌。将各好氧致病菌进行100倍稀释,取1mL稀释液加入一次性平皿内,20 mL营养琼脂倾注,待完全凝固后,打孔。将阴道加德纳菌进行10倍稀释,取1mL稀释液加入一次性平皿内,20 mL 5%马血清-BHI琼脂倾注,待完全凝固后,打孔。
每孔分别加入100 μl不同浓度乳酸菌素溶液。每组设置3个平行。37 ℃培养18-24h以后,取出。游标卡尺测量抑菌圈大小。
表5结果显示,乳杆菌能抑制对甲硝唑无效的需氧菌。在抑制需氧菌以及阴道加德纳菌方面,不同乳杆菌及混菌的抑菌能力与纯乳酸菌素相当。但纯乳酸菌素抑菌效果短暂,无法像乳杆菌一样可以通过增殖、定植的方式实现长效抑菌。
实施例6 不同乳杆菌与乳酸菌素组合物的抑菌能力
具体操作如下:1-D1与定君生分离的德氏乳杆菌以1%接种量接种至MRS液体培养基中,37 ℃过夜培养后取出,备用。除阴道加德纳菌接入5%马血清-BHI肉汤中外,其余致病菌均接入营养肉汤中。
将16-B12、53-D2和51S-H2三个菌株的活化液按1:1:1比例混合制成混菌。取各乳杆菌离心上清液,配制乳酸菌素。使乳酸菌素浓度为0.8g/mL,连续二倍稀释至0.4 g/mL、0.2 g/mL。
将各好氧致病菌进行100倍稀释,取1mL稀释液加入一次性平皿内,20 mL营养琼脂倾注,待完全凝固后,打孔。每孔分别加入100 μl菌+乳酸菌素溶液。每组设置3个平行。37℃培养18-24 h以后,取出。测量抑菌圈大小。
将阴道加德纳菌菌液进行10倍稀释,取1mL稀释液加入90mm一次性平皿内,5%马血清-BHI琼脂倾注,待完全凝固后,打孔。每孔分别加入100 μl菌+乳酸菌素溶液。每组设置3个平行。37 ℃培养48 h以后,取出。游标卡尺测量抑菌圈大小。
结果显示,在抑制需氧菌以及阴道加德纳菌方面,不同乳杆菌与乳酸菌素组合物的抑菌能力优于实施例5中单独使用乳杆菌,且组合物的抑菌能力对乳酸菌素有剂量依赖性。
表6结果显示,植物乳杆菌1-D1与乳酸菌素的组合物的综合抑菌能力显著优于单菌和/或乳酸菌素,植物乳杆菌1-D1与乳酸菌素的组合物的综合抑菌能力优于其他植物乳杆菌的混菌。
实施例7 一种含有乳杆菌和乳酸菌素的组合物在大鼠阴道内的定植试验
对SD大鼠通过阴道给药,每天1次给予植物乳杆菌1-D1和/或乳酸菌素,连续给药5天,再观察10天。在每次给药前采集阴道分泌物并进行革兰氏染色镜检(D1的分泌物为初始给药前采集),判定植物乳杆菌1-D1的定植情况及乳酸菌素对植物乳杆菌1-D1定植的影响。试验方案见下表7。
革兰氏染色镜检显示,初始给药前绝大部分大鼠阴道分泌物中无任何微生物,极少数大鼠阴道分泌物中偶见革兰氏阴性杆菌、革兰氏阳性球菌。持续给药后,相比于空白对照组,给予植物乳杆菌1-D1的大鼠,其阴道分泌物中革兰氏阳性杆菌较给药前及空白对照组明显增多,表明植物乳杆菌1-D1可成功在SD大鼠阴道内定植。相较植物乳杆菌1-D1组,组合物中低剂量组及高剂量组大鼠阴道分泌物中的乳杆菌数量没有明显差异,说明乳酸菌素对植物乳杆菌1-D1的定植没有影响,不影响其存活。停止给药5天后(D10),视野中仍可见革兰氏阳性杆菌,停止给药10天后(D15),大鼠阴道微环境恢复到给药前状态(实验结果如图1所示)。
本领域的技术人员应理解,上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明,在没有背离所述原理下,本发明的实施方式可以有任何变形或修改。
Claims (11)
1.一种含有乳杆菌和乳酸菌素的组合物,所述乳杆菌活菌数不低于1×106CFU;
组合物包含不低于20mg的乳酸菌素。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述乳杆菌活菌数为1×106~1×1010CFU;
组合物包含20~150mg的乳酸菌素,优选为40~100mg的乳酸菌素。
3.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述乳杆菌是具有活性的、灭活的、受抑制的、或基因修饰的。
4.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述乳杆菌包括以下乳杆菌中的一种或几种,植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)1-D1,保藏编号为:CCTCC NO:M20221191、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)51S-H2,保藏编号为:CCTCC NO:M20221194、格氏乳杆菌(Lactobacillus paragasseri)16-B12,保藏编号为:CCTCC NO:M20221193、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii )53-D2,保藏编号为:CCTCC NO:M20221192 。
5.权利要求1~4任一项所述的组合物在制备治疗和/或预防阴道、泌尿道中的感染的产品中的用途。
6.根据权利要求5所述的用途,其特征在于,所述阴道感染包括细菌性阴道病、酵母性阴道炎、滴虫阴道炎、需氧性阴道炎、病毒性阴道病,尤其是细菌性阴道病和需氧菌性阴道炎;
进一步地,所述细菌性阴道病主要是由阴道加德纳菌引起的;所述需氧性阴道炎是由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌、痢疾志贺菌、加德纳菌或沙门氏菌等致病菌引起的。
7.根据权利要求5所述的用途,其特征在于, 所述组合物还包含药物上可接受的载体;
进一步地,所述组合物以片剂、吮吸片剂、甜味食品、口香糖、胶囊、有肠溶衣的片剂和胶囊、栓剂、微型灌肠剂、阴道用片剂、阴道用明胶胶囊、阴道用锭剂、乳膏、凝胶、软膏、洗剂、棉塞、尿布、垫子、熔化条、避孕套、阴道栓剂、喷雾剂和临床营养品的形式施用。
8.卫生产品,其包含根据权利要求1~4任一项所述的组合物;
进一步地,所述卫生产品选自棉塞、卫生巾、月经垫、尿布、肥皂、洗发剂、凝胶、软膏、乳膏、喷雾剂和洗剂。
9.新食物,其包含根据权利要求1~4任一项所述的组合物。
10.一种用于治疗和/或预防发炎反应的方法,所述方法包括向需要其的受试者施用药学上有效量的根据权利要求1~4任一项所述的组合物的步骤。
11.用于治疗和/或预防发炎反应的药盒,其特征在于,它至少包括含有如权利要求1~4任一项所述的组合物的容器。
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