CN114561330B - 一种防治生殖道感染的复合菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种防治生殖道感染的复合菌剂，所述防治生殖道感染的复合菌剂包括卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株和格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri LG08菌株。该复合菌剂能够预防和/或治疗生殖道感染相关疾病，可以应用于制备预防和/或治疗生殖道感染相关疾病的产品中。

Description

一种防治生殖道感染的复合菌剂
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种防治生殖道感染的复合菌剂。
背景技术
女性生殖道环境常会因为各种因素影响而造成菌群紊乱，导致病原菌入侵，从而引发细菌、霉菌、病毒等致病菌感染，常见的有大肠杆菌、加德纳菌和白色念珠菌等。生殖道感染疾病的临床症状表现为：阴道瘙痒灼热，分泌物异常，尿频尿痛，严重则会导致孕妇早产，宫颈癌等。
女性阴道是一个复杂的微生态系统，由鳞状上皮和阴道菌群共同组成。健康育龄女性阴道通常以乳杆菌为优势菌。在女性阴道中占据主导优势地位的通常有四种，分别为：卷曲乳杆菌（Lactobacillus crispatus）、格氏乳杆菌（Lactobacillu gasseri）、惰性乳杆菌（Lactobacillu iners）和詹氏乳杆菌（Lactobacillu jensensii）。根据主导优势菌的不同，阴道微生态环境分为五种类型，其中CST I、II、III和V中优势菌分别为以上四种乳酸杆菌，CST IV为非乳酸杆菌占优势的类型。在亚洲女性阴道中，以CST I和III最为常见。卷曲乳杆菌仅在健康女性中丰度较高，在患有生殖道感染性疾病的女性中泛滥度和丰度均显著降低，是潜在的阴道益生菌。
念珠菌阴道炎（candida vaginitis）是一种育龄期妇女常见的阴道粘膜的真菌感染性疾病。白色念珠菌是念珠菌阴道炎的主要致病菌，临床上治疗念珠菌阴道炎的方法主要是抗生素疗法，通过口服氟康唑等抗生素药物或阴道内给药抑制念珠菌阴道炎患者体内的白色念珠菌等念珠菌阴道炎致病菌。细菌性阴道炎（Bacterial vaginosis，简称BV），是种发生在阴道内的疾病，其原因是细菌大量滋生而造成的。常见的症状包括有阴道分泌物增加，而且分泌物有鱼腥味，且色泽多为白或灰色。有时排尿时也会伴随产生灼热感。在感染细菌性阴道炎的情况下，另外感染其他性传染病的几率大约提升了一倍之多，而这当中包含了艾滋病。此疾病也连带提高了产妇早产的几率。细菌性阴道炎和存在于阴道内的原生细菌失衡有关。原先在阴道内常见的细菌发生了改变，且现有细菌数量以数百甚至数千倍的增加。除了乳酸杆菌外，多了非常多其他的细菌。绝大多数细菌性或真菌性感染的患者接受的临床治疗手段是使用抗生素。抗生素在对抗病原菌的同时也会降低益生菌的丰度，不利于维持生殖道菌群稳态，从而增高复发风险。
因此，亟需开发一种能够预防和/或治疗女性生殖道感染的同时，又不会影响生殖道环境益生菌的丰度的益生菌剂。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种防治生殖道感染的复合菌剂。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种防治生殖道感染的复合菌剂，所述防治生殖道感染的复合菌剂包括卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株和格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri LG08菌株。
所述格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri LG08菌株的保藏编号为CGMCCNo.16131，保藏日期为2018年7月18日，其保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述防治生殖道感染的卷曲乳杆菌为卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatusLCr86菌株，保藏编号为CGMCC No.19758，保藏日期为2020年4月29日，其保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明从奶酪中分离获得并保藏了一株具有防治生殖道感染功效的卷曲乳杆菌，将其命名为卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株，该菌株能够预防和/或治疗生殖道感染相关疾病，具体体现在：（1）在体外能够显著抑制大肠杆菌、加德纳杆菌和白色念珠菌；（2）对人阴道上皮细胞有很好的粘附能力；（3）可显著降低念珠菌阴道炎小鼠阴道内的白色念珠菌浓度和阴道炎症；（4）可显著减少加德纳杆菌阴道炎小鼠阴道内的加德纳杆菌浓度和阴道炎症；（5）可显著降低金黄色葡萄球菌与加德纳杆菌联合感染引发的阴道炎小鼠阴道内的细菌浓度和阴道炎症。因此，此卷曲乳杆菌LCr86在制备预防和/或治疗生殖道感染相关疾病的产品（如药品、保健品、食品或卫生用品等）中，具有巨大的应用前景。
另外，卷曲乳杆菌是一种益生菌，已被纳入国家《可用于食品的菌种名单》，因此，本发明筛选得到的卷曲乳杆菌LCr86用于预防和/或治疗生殖道感染相关疾病的产品（如药品、保健品、食品或卫生用品等）中时，安全性高；且其不会产生抗药性，可长期用于预防和/或治疗生殖道感染相关疾病的产品（如药品、保健品、食品或卫生用品等）中。
本发明所涉及的卷曲乳杆菌是从奶酪中筛选到的菌株，筛选步骤如下：
收集奶酪样品，使用质量浓度为0.9%的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在MRS固体培养基上，在37℃培养48 h后，挑取典型菌落后在MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用MRS液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为30%的甘油进行保藏。
对分离到的单菌落根据其抑制白色念珠菌生长的能力进行筛选，步骤如下：
（1）取10μL不同卷曲乳杆菌菌液（1×108CFU/mL）和10μL白色念珠菌菌液（1×106CFU/mL）接种于装有1mL MRS液体培养基的试管中，将试管在37℃培养箱培养24h，得到培养液。
（2）抑菌实验：将各组培养液用灭菌的PBS缓冲液梯度稀释后用移液器吸取100μL涂布于YPD固体培养基，于37℃培养箱倒置培养48h后进行平板计数，获得各组培养液中白色念珠菌的菌落数。经过上述操作，选择对白色念珠菌抑制能力最好的一株菌株，对其进行鉴定。
本发明创造性地发现本发明所涉及的卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatusLCr86菌株能够与格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri LG08菌株进行复配使用用于防治生殖道感染，具有优异的效果，且与单一菌剂相比，复合菌剂具有更显著的防治生殖道感染效果，说明LCr86菌株与LG08菌株在防治生殖道感染方面具有协同增效作用。
优选地，所述卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株与所述格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri LG08菌株的活菌数之比为(2-4):1，例如2:1、5:2、3:1、7:2、4:1等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
在本发明所涉及的复合菌剂中，两种菌株在满足上述特定的活菌数比例关系时具有更优的协同增效效果。
优选地，所述防治生殖道感染的复合菌剂还包括填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂或保护剂中的任意一种或至少两种的组合。所述至少两种的组合例如填充剂和润湿剂的组合、润湿剂和崩解剂的组合、崩解剂和粘合剂的组合等，其他任何的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
第二方面，本发明提供一种防治生殖道感染的卷曲乳杆菌培养物，所述防治生殖道感染的卷曲乳杆菌培养物由包括如下步骤的制备方法制得：将卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株接种于MRS液体培养基中，于30-40℃厌氧条件下培养15-30 h即得；所述防治生殖道感染的卷曲乳杆菌培养物为卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株的发酵液或其提取物。
上述30-40℃中的具体数值可以选择30℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃等。
上述15-30 h中的具体数值可以选择15 h、17 h、18 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24h、25 h、27 h、30 h等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的防治生殖道感染的卷曲乳杆菌和/或第二方面所述的防治生殖道感染的卷曲乳杆菌培养物在制备防治生殖道感染的食品、保健品、药品或卫生用品中的应用。
本发明所涉及的卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株或其培养物可以被单独地应用于相关产品中，也可以与其他菌例如格氏乳杆菌（Lactobacillu gasseri）、惰性乳杆菌（Lactobacillu iners）或詹氏乳杆菌（Lactobacillu jensensii）联合应用于相关产品中。
优选地，在所述防治生殖道感染的食品、保健品、药品或卫生用品中，卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86的活菌数不低于1×108 CFU/mL或1×108 CFU/g，例如1×108 CFU/mL、2×108 CFU/mL、4×108 CFU/mL、5×108 CFU/mL、8×108 CFU/mL、1×109 CFU/mL、1×1010 CFU/mL等，例如1×108 CFU/g、2×108 CFU/g、5×108 CFU/g、1×109 CFU/g、5×109 CFU/g、1×1010 CFU/g等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第四方面，本发明提供一种防治生殖道感染的菌剂，所述菌剂包括第一方面所述的防治生殖道感染的卷曲乳杆菌和/或第二方面所述的防治生殖道感染的卷曲乳杆菌培养物。
优选地，所述菌剂为粉剂，所述粉剂还包括保护剂，所述保护剂包括葡萄糖、菊粉、低聚半乳糖、乳糖、蛋白胨、维生素C钠或吐温-80中的任意一种或至少两种的组合。所述至少两种的组合例如乳糖和菊粉的组合、乳糖和蛋白胨的组合等，其他任何的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
在实际应用中，上述粉剂可以被进一步地制备成胶囊剂、片剂等剂型。
优选地，所述菌剂还包括填充剂、润湿剂、崩解剂或粘合剂中的任意一种或至少两种的组合。所述至少两种的组合例如填充剂和润湿剂的组合、润湿剂和崩解剂的组合、崩解剂和粘合剂的组合等，其他任何的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明从奶酪中分离获得并保藏了一株具有防治生殖道感染功效的卷曲乳杆菌，将其命名为卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株，该菌株能够预防和/或治疗生殖道感染相关疾病，具体体现在：（1）在体外能够显著抑制大肠杆菌、加德纳杆菌和白色念珠菌；（2）对人阴道上皮细胞有很好的粘附能力；（3）可显著降低念珠菌阴道炎小鼠阴道内的白色念珠菌浓度和阴道炎症；（4）可显著减少加德纳杆菌阴道炎小鼠阴道内的加德纳杆菌浓度和阴道炎症；（5）可显著降低金黄色葡萄球菌与加德纳杆菌联合感染引发的阴道炎小鼠阴道内的细菌浓度和阴道炎症。因此，此卷曲乳杆菌LCr86在制备预防和/或治疗生殖道感染相关疾病的产品（如药品、保健品、食品或卫生用品等）中，具有巨大的应用前景。
本发明创造性地发现本发明所涉及的卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatusLCr86菌株能够与格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri LG08菌株进行复配使用用于防治生殖道感染，同样具有优异的效果，且与单一LCr86菌剂或单一LG08菌剂相比，复合菌剂具有更显著的防治生殖道感染效果，说明LCr86菌株与LG08菌株在防治生殖道感染方面具有协同增效作用。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
下述涉及的卷曲乳杆菌为卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19758，保藏日期为2020年4月29日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述涉及的格氏乳杆菌为格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri LG08菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16131，保藏日期为2018年7月18日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
下述涉及的大肠杆菌购自ATCC，菌株编号为25922；加德纳杆菌购自ATCC，菌株编号为14018；白色念珠菌购自ATCC，菌株编号为10231；金黄色葡萄球菌购自ATCC，菌株编号为25923。
下述涉及的MRS固体培养基：称取蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、乙酸钠2g、酵母粉5 g、柠檬酸氢二铵2 g、K2PO4·3H2O 2.6 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、MnSO4 0.05 g、琼脂20 g和半胱氨酸盐酸盐0.5 g，使用去离子水溶解，再加入1 mL吐温80，定容至1 L，灭菌冷却后，倒入灭菌后的培养皿中备用。
下述涉及的MRS液体培养基：称取蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、乙酸钠2g、酵母粉5 g、柠檬酸氢二铵2 g、K2PO4·3H2O 2.6 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、MnSO4 0.05 g和半胱氨酸盐酸盐0.5 g，使用去离子水溶解，再加入1 mL吐温80，定容至1 L，灭菌冷却后备用。
下述涉及的YPD液体培养基：酵母粉10.0g、葡萄糖20.0g以及蛋白胨20.0g，使用去离子水溶解，定容至1 L，灭菌冷却后，倒入灭菌后的培养皿中备用。
下述涉及的YPD固体培养基：酵母粉10.0g、葡萄糖20.0g、蛋白胨20.0g以及琼脂20.0g，使用去离子水溶解，定容至1 L，灭菌冷却后，倒入灭菌后的培养皿中备用。
下述涉及的脑心浸液肉汤（BHI）液体培养基：蛋白胨10.0g、脱水小牛脑浸粉12.5g、脱水牛心浸粉 5.0g、氯化钠 5.0g、葡萄糖 2.0g、磷酸氢二钠 2.5g，使用去离子水溶解，定容至1 L，灭菌冷却后，倒入灭菌后的培养皿中备用。
下述涉及的脑心浸液肉汤（BHI）固体培养基：蛋白胨10.0g、脱水小牛脑浸粉12.5g、脱水牛心浸粉 5.0g、氯化钠 5.0g、葡萄糖 2.0g、磷酸氢二钠 2.5g以及琼脂20.0g，使用去离子水溶解，定容至1 L，灭菌冷却后，倒入灭菌后的培养皿中备用。
下述涉及的菌液的制备方法如下：
卷曲乳杆菌LCr86菌液：将卷曲乳杆菌菌体以占MRS液体培养基总体积2％的接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃培养24h后用MRS液体培养基调节菌浓度为1×108CFU/mL，得到卷曲乳杆菌菌液。
格氏乳杆菌LG08菌液：将格氏乳杆菌菌体以占MRS液体培养基总体积2％的接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃培养24h后用MRS液体培养基调节菌浓度为1×108CFU/mL，得到格氏乳杆菌菌液。
大肠杆菌菌液：将大肠杆菌以占BHI液体培养基总体积1％的接种量接种至BHI液体培养基，于37℃培养24h后用BHI液体培养基调节菌浓度为1×106CFU/mL，得到大肠杆菌菌液。
加德纳杆菌菌液：将加德纳杆菌以占BHI液体培养基总体积1％的接种量接种至BHI液体培养基，于37℃培养24h后用BHI液体培养基调节菌浓度为1×106CFU/mL，得到加德纳杆菌菌液。
金黄色葡萄球菌菌液：将金黄色葡萄球菌以占BHI液体培养基总体积1％的接种量接种至BHI液体培养基，于37℃培养24h后用BHI液体培养基调节菌浓度为1×106CFU/mL，得到金黄色葡萄球菌菌液。
白色念珠菌菌液：将白色念珠菌菌体以占YPD液体培养基总体积2％的接种量接种至YPD液体培养基，于37℃培养24h后用YPD液体培养基调节菌浓度为1×106CFU/mL，得到白色念珠菌菌液。
实施例1
本实施例从奶酪中筛选抗致病菌感染的菌株，步骤如下：
收集奶酪样品，使用质量浓度为0.9%的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在MRS固体培养基上，在37℃培养48 h后，挑取典型菌落后在MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用MRS液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为30%的甘油进行保藏。
对分离到的单菌落根据其抑制白色念珠菌生长的能力进行筛选，步骤如下：
（1）取10μL不同卷曲乳杆菌菌液和10μL白色念珠菌菌液接种于装有1mL MRS液体培养基的试管中，将试管在37℃培养箱培养24h，得到培养液。
（2）抑菌实验：将各组培养液用灭菌的PBS缓冲液梯度稀释后用移液器吸取100μL涂布于YPD固体培养基，于37℃培养箱倒置培养48h后进行平板计数，获得各组培养液中白色念珠菌的菌落数。经过上述操作，选择对白色念珠菌抑制能力最好的一株菌株。
实施例2
本实施例对实施例1筛选得到的菌株进行形态鉴定以及16S rRNA分子生物学鉴定，步骤如下：
（1）形态鉴定：
将菌株接种在MRS固体培养基中，于37℃培养48 h后，在显微镜下进行观察。观察可知，菌落较小，呈白色，圆形，菌落中间饱满，周围弥散。
（2）16S rRNA分子生物学鉴定：
将-80℃保藏的菌株取出，接种于MRS液体培养基中，在37℃下培养18 h。吸取1 mL菌液于离心管中，6000 rpm下离心10 min，去上清液，收集菌体。
提取菌株的基因组，加入细菌通用引物进行PCR扩增，并将扩增产物送交上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。
该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID No: 1所示。
SEQ ID No: 1：
AGGCCACCGGCTTTGGGCATTGCAGACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCGTGCAGTCGAGTTGCAGACTGCAGTCCGAACTGAGAACAGCTTTCAGAGATTCGCTTGCCTTCGCAGGCTCGCTTCTCGTTGTACTGCCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAATAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTCTTAGCGTCCCCGAAGGGAACTTTGTATCTCTACAAATGGCACTAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTACAGCACTGAGAGGCGGAAACCTCCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGAAAAACAGTTTCCGATGCAGTTCCTCGGTTAAGCCGAGGGCTTTCACATCAGACTTATTCTTCCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTTGATTACCGTCAAATAAAGGCCAGTTACTACCTCTATCCTTCTTCACCAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGAAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCTTTACCTTACCAACTAGCT。
将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为卷曲乳杆菌。
基于实施例2的16S rRNA分子生物学鉴定及形态鉴定的结果，确认菌株属于卷曲乳杆菌，命名为卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86。
实施例3
本实施例对实施例1筛选得到的菌株进行生理生化特征表征，步骤如下：
LCr86在MRS培养基中培养18小时，在1000倍的显微镜下观察，菌体呈现细长杆状，革兰氏染色为阳性，没有芽孢和鞭毛。LCr86的氧化酶和接触酶反应为阴性，兼性厌氧，碳源利用情况使用API 50CH试剂盒进行检测。结果如表1（+，表示阳性反应；-，表示阴性反应）。
表1
Figure 268238DEST_PATH_IMAGE001
实施例4
本实施例对卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86的最佳培养条件进行探讨，步骤如下：
将卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86接入MRS液体培养基中，分别于10~50℃下培养48 h，培养过程中，间隔一段时间通过酶标仪测量培养液的OD600数值。结果如表2所示：
表2
Figure 37873DEST_PATH_IMAGE002
结果显示，卷曲乳杆菌在30-40℃下生长最佳，培养18-24 h即可达到生长稳定期。
实施例5
本实施例验证卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86的产乳酸能力：
（1）样品预处理：将卷曲乳杆菌菌体以占MRS液体培养基总体积2％的接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃培养24h后用MRS液体培养基调节菌浓度为1×108CFU/mL。
（2）取1mL菌液进行6000r/min离心10min，取上清，待检测L-乳酸和D-乳酸含量。
（3）测定方法：采用乳酸（LD）测试盒（比色法）（购自南京建成生物工程研究所）按照标准操作手册测得乳酸含量。
测试结果如表3所示。
表3
Figure 92417DEST_PATH_IMAGE003
结果表明：在厌氧条件下，LCr86菌株具有很好的乳酸产生能力，尤其是产D-乳酸的能力，良好的产酸能力为其抗致病菌创造了条件。
实施例6
本实施例验证卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86的产H2O2能力：
（1）样品预处理：将卷曲乳杆菌菌体以占MRS液体培养基总体积2％的接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃培养24h后用MRS液体培养基调节菌浓度为1×108CFU/mL。
（2）取1mL菌液进行6000r/min离心10min，取上清，待检测H2O2含量。
（3）测定方法：用过氧化氢测定试剂盒（比色法）（购自南京建成生物工程研究所）按照标准操作手册测H2O2含量。
测试结果如表4所示。
表4
Figure 787840DEST_PATH_IMAGE004
结果表明：LCr86具有很好的H2O2产生能力，良好的产H2O2能力为其抗致病菌创造了条件。
实施例7
本实施例验证卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86对VK2/E6E7细胞的粘附能力：
本实施例用到的VK2/E6E7细胞购自上海冠导生物工程有限公司。
（1）细胞培养：将复苏好的VK2/E6E7细胞悬液接种到培养瓶中，将培养瓶放入5%CO2-95%空气培养箱中37℃孵育。
（2）将培养好的VK2/E6E7细胞进行消化，用不含双抗的1640细胞完全培养液稀释，使细胞浓度达到约2×105cell/mL，滴加1mL于细胞培养皿（24孔板）中，于5%CO2-95%空气培养箱中37℃孵育至完全分化。
（3）卷曲乳杆菌菌液：将卷曲乳杆菌LCr86以占MRS液体培养基总体积2%的接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃培养24h得到卷曲乳杆菌菌液。
（4）用灭菌的PBS缓冲液漂洗VK2/E6E7细胞2次，然后每孔加入l mL 1640细胞培养液和1 mL过夜培养并调整至105 CFU/mL的卷曲乳杆菌LCr86菌悬液，轻轻摇晃混匀，于37℃、5%CO2的孵箱继续孵育。
（5）孵育1.5h后，取出24孔培养板，弃细菌悬液，单细胞层用灭菌的PBS缓冲液洗涤细胞5次，然后加入无水甲醇固定20min。取上述经无水甲醇固定的细胞玻片，进行革兰氏染色。干燥后镜下观察计数，计算20个随机视野内100个细胞上粘附的细菌数，计算每个VK2E6/E7细胞上平均粘附细菌数。
作为对照，将另外一株同样采用实施例1的方法分离鉴定得到的卷曲乳杆菌LRc29分离株进行对比。结果如表5所示。
表5
Figure 826203DEST_PATH_IMAGE005
结果表明：LCr86对人阴道上皮细胞的粘附作用更强。每个VK2E6/E7细胞平均粘附82.5±18.3个LCr86和47.7±16.5个LCr29。粘附能力越强，证明菌株的定植能力更强，更容易在阴道环境内繁殖，为抑制致病菌创造了条件。
实施例8
本实施例验证卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86对致病菌的抑制效果：
（1）卷曲乳杆菌LCr86平板的制备：吸取10μL卷曲乳杆菌LCr86培养液，涂布于MRS固体培养基上，37℃培养24h，获得卷曲乳杆菌LCr86平板。
（2）LCr86抑制大肠杆菌ATCC 25922的能力：吸取1mL大肠杆菌菌液（1×106CFU/mL）涂布于步骤（1）中的卷曲乳杆菌平板上，37℃培养24h，测量抑菌圈大小。
（3）LCr86抑制加德纳杆菌ATCC 14018的能力：吸取1mL加德纳杆菌菌液（1×106CFU/mL）涂布于步骤（1）中的卷曲乳杆菌平板上，37℃培养24h，测量抑菌圈大小。
（4）LCr86抑制白色念珠菌ATCC 10231的能力：吸取1mL白色念珠菌菌液（1×106CFU/mL）涂布于步骤（1）中的卷曲乳杆菌平板上，37℃培养24h，测量抑菌圈大小。
（5）LCr86抑制金黄色葡萄球菌25923的能力：吸取1mL金黄色葡萄球菌菌液（1×106CFU/mL）涂布于步骤（1）中的卷曲乳杆菌平板上，37℃培养24h，测量抑菌圈大小。
抑菌效果如表6所示：
表6
Figure 366906DEST_PATH_IMAGE006
结果表明：卷曲乳杆菌LCr86对大肠杆菌、阴道加德纳菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果均很明显。
实施例9
本实施例验证卷曲乳杆菌LCr86和/或格氏乳杆菌LG08对白色念珠菌ATCC 10231感染的阴道炎小鼠阴道内白色念珠菌的抑制作用，步骤如下：
（1）小鼠的分组：取50只雌性、8周龄、体重20-25g的C57CL/6J小鼠，分成5组，每组10只，分别为健康对照组（CTL）、模型组（Model）、卷曲乳杆菌LCr86治疗组（LCr86）、格氏乳杆菌LG08治疗组（LG08）、卷曲乳杆菌LCr86和格氏乳杆菌LG08联合治疗组（LCr86+ LG08）。
（2）白色念珠菌感染小鼠造模：模型组以及治疗组小鼠均皮下注射100μL戊酸雌二醇，诱导小鼠发情，每周一次，共2次。小鼠发情后模型组以及治疗组小鼠均在阴道内接种20μL菌浓度为1×107 CFU/mL的白色念珠菌，每天一次，连续接种3天。
（3）白色念珠菌感染小鼠的治疗：空白对照组小鼠不作处理；模型组小鼠阴道内注射20μL生理盐水；卷曲乳杆菌LCr86组小鼠阴道内接种20μL菌浓度为1×107CFU/mL的卷曲乳杆菌LCR86，每天接种1次，连续接种10天；格氏乳杆菌LG08组小鼠阴道内接种20μL菌浓度为1×107CFU/mL的格氏乳杆菌LG08，每天接种1次，连续接种10天；联合组小鼠阴道内接种15μL菌浓度为1×107CFU/mL的卷曲乳杆菌LCR86和5μL菌浓度为1×107CFU/mL的格氏乳杆菌LG08。
（4）治疗效果的评价：在治疗的第10天用40μL无菌PBS缓冲液灌洗各组小鼠阴道3次，收集灌洗液并充分混匀，用PBS缓冲液进行梯度稀释后涂布于YPD琼脂培养基上，于37℃培养48h后进行平板计数，获得各组小鼠阴道内的白色念珠菌浓度。结果如表7所示：
表7
Figure 541536DEST_PATH_IMAGE007
由表7可知，造模结束后，空白对照组小鼠阴道内不含白色念珠菌；模型组小鼠阴道内的白色念珠菌浓度则维持在105CFU/mL以上；治疗结束后，卷曲乳杆菌LCr86组小鼠阴道内的白色念珠菌浓度降为1.1×103 CFU/mL左右，格氏乳杆菌LG08组小鼠阴道内的白色念珠菌浓度降为2.1×103 CFU/mL左右，联合组小鼠阴道内的白色念珠菌浓度降为5.1×102 CFU/mL左右。可见，阴道内接种卷曲乳杆菌LCr86可显著降低念珠菌阴道炎小鼠阴道内的白色念珠菌丰度。
实施例10
本实施例验证卷曲乳杆菌LCr86和/或格氏乳杆菌LG08对加德纳杆菌ATCC 14018感染的阴道炎小鼠阴道内加德纳杆菌的抑制作用，步骤如下：
（1）小鼠的分组：取50只雌性、8周龄、体重20-25g的C57CL/6J小鼠，分成5组，每组10只，分别为健康对照组（CTL）、模型组（Model）、卷曲乳杆菌LCr86治疗组（LCr86）、格氏乳杆菌LG08治疗组（LG08）、卷曲乳杆菌LCr86和格氏乳杆菌LG08联合治疗组（LCr86+ LG08）。
（2）加德纳杆菌感染小鼠造模：模型组以及治疗组小鼠均皮下注射100μL戊酸雌二醇，诱导小鼠发情，每周一次，共2次。小鼠发情后模型组以及治疗组小鼠均在阴道内接种20μL菌浓度为1×107 CFU/mL的加德纳杆菌，每天一次，连续接种3天。
（3）加德纳杆菌感染小鼠的治疗：空白对照组小鼠不作处理；模型组小鼠阴道内注射20μL生理盐水；卷曲乳杆菌LCr86组小鼠阴道内接种20μL菌浓度为1×107CFU/mL的卷曲乳杆菌LCR86，每天接种1次，连续接种10天；格氏乳杆菌LG08组小鼠阴道内接种20μL菌浓度为1×107CFU/mL的格氏乳杆菌LG08，每天接种1次，连续接种10天；联合组小鼠阴道内接种15μL菌浓度为1×107CFU/mL的卷曲乳杆菌LCR86和5μL菌浓度为1×107CFU/mL的格氏乳杆菌LG08。
（4）治疗效果的评价：在治疗的第10天用40μL无菌PBS缓冲液灌洗各组小鼠阴道3次，收集灌洗液并充分混匀，用PBS缓冲液进行梯度稀释后涂布于BHI琼脂培养基上，于37℃培养48h后进行平板计数，获得各组小鼠阴道内的加德纳杆菌浓度。结果如表8所示：
表8
Figure 407860DEST_PATH_IMAGE008
由表8可知，造模结束后，空白对照组小鼠阴道内不含加德纳杆菌；模型组小鼠阴道内的加德纳杆菌浓度则维持在106CFU/mL以上；治疗结束后，卷曲乳杆菌LCr86组小鼠阴道内的加德纳杆菌浓度降为500 CFU/mL左右，格氏乳杆菌LG08组小鼠阴道内的加德纳杆菌浓度降为1100 CFU/mL左右，联合组小鼠阴道内的加德纳杆菌浓度降为200 CFU/mL左右。可见，阴道内接种卷曲乳杆菌LCr86可显著降低小鼠阴道内的加德纳杆菌丰度。
实施例11
本实施例验证卷曲乳杆菌LCr86对加德纳杆菌ATCC14018和金黄色葡萄球菌ATCC25923联合感染的阴道炎小鼠阴道内细菌的抑制作用，步骤如下：
（1）小鼠的分组：取30只雌性、8周龄、体重20-25g的C57CL/6J小鼠，分成3组，每组10只，分别为健康对照组（CTL）、模型组（Model）、卷曲乳杆菌LCr86治疗组（LCr86）。
（2）细菌感染小鼠造模：模型组以及治疗组小鼠均皮下注射100μL戊酸雌二醇，诱导小鼠发情，每周一次，共2次。小鼠发情后模型组以及治疗组小鼠均在阴道内接种10μL菌浓度为1×107 CFU/mL的加德纳杆菌和10μL菌浓度为1×107 CFU/mL的金黄色葡萄球菌，每天一次，连续接种3天。
（3）感染小鼠的治疗：空白对照组小鼠不作处理；模型组小鼠阴道内注射20μL生理盐水；卷曲乳杆菌LCr86组小鼠阴道内接种20μL菌浓度为1×107CFU/mL的卷曲乳杆菌LCR86，每天接种1次，连续接种10天。
（4）治疗效果的评价：在治疗的第10天用40μL无菌PBS缓冲液灌洗各组小鼠阴道3次，收集灌洗液并充分混匀，用PBS缓冲液进行梯度稀释后用涂布于BHI琼脂培养基上，于37℃培养48h后进行平板计数，获得各组小鼠阴道内的细菌浓度。结果如表9所示：
表9
Figure 667940DEST_PATH_IMAGE009
由表9可知，造模结束后，空白对照组小鼠阴道内不含加德纳杆菌和金黄色葡萄球菌；模型组小鼠阴道内的加德纳杆菌浓度则维持在106 CFU/mL以上，金黄色葡萄球菌浓度则维持在106 CFU/mL以上；治疗结束后，卷曲乳杆菌LCr86组小鼠阴道内的加德纳杆菌浓度降为1000 CFU/mL以下，金黄色葡萄球菌浓度降为1000 CFU/mL左右。
实施例12
本实施例验证卷曲乳杆菌LCr86对加德纳杆菌ATCC 14018感染的阴道炎小鼠阴道组织炎症的缓解效果，步骤如下：
（1）卷曲乳杆菌LCr86粉剂的制备：挑取卷曲乳杆菌LCR86菌体以占MRS液体培养基总体积2％的接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃培养24 h，得到培养液；将培养液在6000r/min的条件下离心10min，收集菌体；将菌体用PBS缓冲液冲洗两次后，在菌体中加入乳糖；将混合物冷冻干燥36h，得到含有卷曲乳杆菌LCr86粉剂（108CFU/g）。
（2）卷曲乳杆菌LCr86粉剂的使用：将其用于按照实施例10的方法造模的加德纳杆菌阴道炎小鼠阴道内。使用方法为：用无菌的1%玻尿酸水溶液稀释卷曲乳杆菌LCr86粉剂，用医用移液器将20μL稀释液接种于小鼠阴道内。使用10天后，将加德纳杆菌感染的阴道炎小鼠的阴道组织研磨。
（3）加德纳杆菌ATCC 14018感染的阴道炎小鼠的造模方法同实施例10。
（4）阴道组织炎性细胞因子检测：将阴道组织匀浆上清液转移至96孔ELISA平板，采用酶联免疫吸附试剂盒（南京检测）测定组织中TNF-α和IL-6含量。结果如表10所示：
表10
Figure 12334DEST_PATH_IMAGE010
结果可知，此粉剂可显著缓解德纳杆菌阴道炎小鼠阴道炎症，表现在LCr86显著降低了阴道组织中TNF-α和IL-6含量。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种防治生殖道感染的卷曲乳杆菌及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 微康益生菌(苏州)股份有限公司
<120> 一种防治生殖道感染的复合菌剂
<130> 2022
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1200
<212> DNA
<213> 卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株
<400> 1
aggccaccgg ctttgggcat tgcagactcc catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc 60
cgggaacgta ttcaccgcgg cgtgctgatc cgcgattact agcgattcca gcttcgtgca 120
gtcgagttgc agactgcagt ccgaactgag aacagctttc agagattcgc ttgccttcgc 180
aggctcgctt ctcgttgtac tgcccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc 240
atgatgactt gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc tcattagagt 300
gcccaactta atgctggcaa ctaataacaa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa 360
catctcacga cacgagctga cgacagccat gcaccacctg tcttagcgtc cccgaaggga 420
actttgtatc tctacaaatg gcactagatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgttgct 480
tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca 540
accttgcggt cgtactcccc aggcggagtg cttaatgcgt tagctacagc actgagaggc 600
ggaaacctcc caacacttag cactcatcgt ttacggcatg gactaccagg gtatctaatc 660
ctgttcgcta cccatgcttt cgagcctcag cgtcagttgc agaccagaga gccgccttcg 720
ccactggtgt tcttccatat atctacgcat tccaccgcta cacatggagt tccactctcc 780
tcttctgcac tcaagaaaaa cagtttccga tgcagttcct cggttaagcc gagggctttc 840
acatcagact tattcttccg cctgcgctcg ctttacgccc aataaatccg gacaacgctt 900
gccacctacg tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cgtgactttc tggttgatta 960
ccgtcaaata aaggccagtt actacctcta tccttcttca ccaacaacag agctttacga 1020
tccgaaaacc ttcttcactc acgcggcgtt gctccatcag acttgcgtcc attgtggaag 1080
attccctact gctgcctccc gtagaagttt gggccgtgtc tcagtcccaa tgtggccgat 1140
cagtctctca actcggctat gcatcatcgc cttggtaagc ctttacctta ccaactagct 1200

Claims (2)

1.一种防治生殖道感染的复合菌剂，其特征在于，所述防治生殖道感染的复合菌剂由卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株、格氏乳杆菌Lactobacillus gasseriLG08菌株和可选的辅料组成；
所述格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri LG08菌株的保藏编号为CGMCC No.16131，保藏日期为2018年7月18日；
所述卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株的保藏编号为CGMCCNo.19758，保藏日期为2020年4月29日；
所述卷曲乳杆菌Lactobacillus crispatus LCr86菌株与所述格氏乳杆菌Lactobacillus gasseri LG08菌株的活菌数之比为(2-4):1。
2.如权利要求1所述的防治生殖道感染的复合菌剂，其特征在于，所述辅料包括填充剂、润湿剂、崩解剂、粘合剂或保护剂中的任意一种或至少两种的组合。
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