CN111471623A - 三种乳杆菌的组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由三种乳杆菌组成的组合物，含鼠李糖乳杆菌菌株、格氏乳杆菌菌株和詹氏乳杆菌菌株，可以抵抗细菌性阴道病以及相关阴道感染。本发明组合物对细菌性阴道疾病及相关阴道疾病效果显著，且安全无毒、稳定性好、可长期保存。较目前其他市售制剂，本组合物中菌株均能有效定植，三种乳杆菌菌株可协同发挥作用，相对于单菌株制剂可更为明显地形成阴道微生态。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种由三种乳杆菌组成的组合物及其用途，特 别是用于制备治疗妇科疾病的药物。
背景技术
健康妇女阴道内存在多种微生物，它们与宿主、环境之间构成了相互制约、相互协调、动态平衡的阴道微生态系统。健康妇女的阴道菌群主要由乳杆菌构成，包括鼠李糖 乳杆菌、詹氏乳杆菌、格氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、阴道乳杆菌等。正常情况下乳杆菌对 阴道可以起到保护作用，当阴道微生态的乳杆菌紊乱可能导致致病菌入侵而出现由于阴 道菌群失调引起的多种疾病。
细菌性阴道病(BV)的发生是由于阴道菌群失调，寄主自身的乳杆菌减少而导致其他条件性病原微生物如加德纳菌、各种厌氧菌、弯曲弧菌等大量繁殖，通常BV是以加 德纳菌为主的一种混合感染。应用抗生素治疗可暂时缓解BV的症状，但也使本已减少 的乳杆菌进一步减少，加重阴道微生态失调，从而使BV反复复发。如何控制复发、彻 底根治细菌性阴道病是妇产科医生亟需解决的棘手问题。
细菌性阴道病是育龄期妇女最为常见疾病，在健康妇女中的患病率约为10％-30％。 健康妇女阴道内存在多种乳杆菌，具有个体差异性，且存在优势菌株协同作用。选择优 势菌组合，这对治疗阴道病将起到关键作用。
目前已上市活菌制剂的菌株并非我国妇女阴道优势菌群，定植能力较差，稳定性较 差，不能维持较高的活菌数量，因此不能完全满足临床需求。健康妇女阴道内存在多种乳杆菌，目前药品中仅有一个单一菌株药品，但单一菌种作为阴道菌群调节时很难起到 良好的作用效果，即使单一菌种存在良好的产酸能力、产H2O2能力，及与阴道上皮细胞 粘附的能力，但是单一菌种在重新定植进入阴道菌群时也存在困难，难以长期发挥作用。 当多个菌种在阴道内成功定植，协同发挥作用是乳杆菌持续作用的重要基础，也是乳杆 菌能够发挥疗效的关键因素，同时能有效形成阴道微生态系统。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种由三种乳杆菌组成的组合物，相对于已上市的 单一菌株，该组合物能有效协同发挥作用，该组合物菌株来源于健康人体，具有活跃稳定的生物学特性，为抑菌能力强、细胞黏附能力强的鼠李糖乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏 乳杆菌的组合。
本发明的技术方案如下：
一种由三种乳杆菌组成的组合物，包含鼠李糖乳杆菌菌株、格氏乳杆菌菌株以及詹 氏乳杆菌菌株，其特征在于，其中所述鼠李糖乳杆菌(RD-0060)保藏编号为CGMCCNo.14184，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心；所述格氏乳杆菌 (RD-0046)保藏编号为CGMCCNo.14109，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心； 所述詹氏乳杆菌(RD-0135)保藏编号为CGMCCNo.14112，保藏在中国普通微生物菌种 保藏管理中心。
本发明的乳杆菌组合物，其特征在于，其中所述鼠李糖乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌三者的质量份比例为(1-10)∶(1-10)∶(1-10)；
进一步，本发明的乳杆菌组合物，其中所述鼠李糖乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌三者的质量份比例为(1-5)∶(1-5)∶(1-5)；
更进一步，本发明的乳杆菌组合物，其中所述鼠李糖乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌三者的质量份可选自1∶1∶1、1∶1∶10、10∶1∶1、1∶10∶1、1∶1∶5、5∶1∶1、1∶5∶1等。
此外三个组合物每个菌的活菌数量至少要达到1.0×106CFU/g以上。
进一步，所述组合物还可以包含乳糖、微晶纤维素、淀粉、预胶化淀粉、二氧化硅、硬酯酸镁等药学上可接受的药用辅料，也可不含药用辅料。
所述的乳杆菌组合物用于制备预防和/或治疗妇科疾病药物。
一种所述的乳杆菌组合物用于制备预防和/或治疗阴道疾病药物的用途。
进一步，所述阴道疾病致病菌包括加德纳氏菌、加德纳氏菌、白色念珠菌、阿托波菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌中的一种或几种的组合。
一种所述的乳杆菌组合物用于制备具有阴道上皮细胞粘附功能药物的用途。
一种所述的乳杆菌组合物用于制备调节阴道菌群平衡，抑制致病菌生长的药物用途。
本发明一种由三种乳杆菌组成的组合物，其三种乳杆菌的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus，RD-0060)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri，RD-0046)、詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii，RD-0135)，菌株均从中国健康育龄妇女阴道分泌物中筛选而来，经大量实验证明，具有较强的产酸、产H2O2能力、及与阴道上皮细胞粘附 的能力，在食蟹猴阴道中能显著改变阴道pH，且改善阴道中清洁度，起到良好的微生态 改善作用。在上述预防和/或治疗妇科疾病药物，特别是预防和/或治疗阴道致病菌药物、 预防和/或治疗阴道疾病药物、调节阴道菌群平衡的药物、具有阴道上皮细胞粘附功能 的药物中均能发挥其因自身特性而具有良好的药用效果。
采用上述技术方案产生的有益效果在于：(1)本发明的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus，RD-0060)、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri，RD-0046)、詹氏乳杆菌 (Lactobacillus.jensenii，RD-0135)可以独立并协同抵抗细菌性阴道病和各种阴道感染， 包括白色念珠菌性阴道炎，淋病，病毒性阴道炎，以及泌尿道感染等。(2)本发明的菌 株直接采集于健康人体，具有活跃稳定的生物学特性，无需驯化，直接进入制剂工艺即 可。(3)本发明的菌株具有抑制加德纳氏菌、白色念珠菌、阿托波菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌等作用，与目前市售制剂相比具有明显优势， 植入时菌株定植能力强，能有效发挥作用。(4)可有效形成阴道微生态，且与已上市的 单一菌株相比，有更明显的定植效果。
保藏信息
本发明所涉及的三种乳杆菌，均从中国健康育龄妇女阴道分泌物中筛选得来。其保 藏信息已在先公开，记载在申请人的在先的中国专利申请中：
(1)鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus，RD-0060)：CN108004188A，专利 公布日2018年5月8日。在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为 CGMCCNo.14184，保藏日期为2017年5月24日。
(2)格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri，RD-0046)：CN108004187A，公布日2018年5月8日。在在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCCNo.14109， 保藏日期为2017年5月10日。
(3)詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii，RD-0135)：CN110540945A，公布日2019年12月6日。在在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCCNo.14112， 保藏日期为2017年5月10日。
附图说明
图1：组合物抑菌的菌饼图-大肠埃希菌；
图2：定君生抑菌的菌饼图-大肠埃希菌；
图3：组合物抑菌的菌饼图-加德纳氏菌；
图4：定君生抑菌的菌饼图-加德纳氏菌；
图5：格氏乳杆菌RD-0046的基因组DNA提取结果图；
图6：格氏乳杆菌RD-0046的PCR产物扩增结果图；
图7：鼠李糖乳杆菌RD-0060的基因组DNA提取结果图；
图8：鼠李糖乳杆菌RD-0060的PCR产物扩增结果图；
图9：詹氏乳杆菌RD-0135的基因组DNA提取结果图；
图10：詹氏乳杆菌RD-0135的PCR产物扩增结果图；
图11：乳杆菌组合物的细胞黏附图；
图12：乳杆菌组合物黏附后细菌涂布计数图。
具体实施方式
以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的％为质量百分含量。
以下实施例中所用到的细菌培养基，可以按如下方法配制：
1、肉汤固体培养基(MRS)配制：
(1)将琼脂粉配成溶液，1.5g/100ml去离子水；
(2)加入MRS培养基17.91g/100ml琼脂溶液，混匀；
(3)放入灭菌锅，1.0MPa蒸汽灭菌20分钟；
(4)待培养基温度降至室温后倒入培养皿，根据培养皿大小约10ml/个或20ml/个；
(5)于超净台内操作。冷却后成琼脂状，标记培养基名称及配制日期，放于4℃冰箱待用。
2、肉汤液体培养基(MRS)配制：
(1)将MRS培养基加入去离子水，比例为17.91g/100ml；
(2)放入灭菌锅，10MPa蒸汽灭菌20分钟；
(3)待灭菌锅无压力后取出，分装至EP管中，每个1.0ml。标记培养基名称及配 制日期，放于4℃冰箱待用。
实施例1、鼠李糖乳杆菌RD-0060冻干菌粉的制备
将鼠李糖乳杆菌RD-060在pH 6.5的肉汤液体培养基(MRS)中生长，使用100升 规模的发酵罐发酵，厌氧培养。在平台期早期收集菌体，其活菌数达到约1.0×109CFU/ml 以上。通过离心分离收集菌体，用磷酸缓冲液洗涤后，与冻干保护剂(包括脱脂奶粉和 蔗糖等)混合。然后，将混合物置于冷冻干燥机中冷冻干燥。样品在-40℃下冷冻约2小 时，然后在-20℃下真空干燥20-30小时，再在30℃干燥3-5小时。冻干粉包装后，并冷 藏贮藏。将冻干粉进行活菌计数，活菌数应当在1.0×1010CFU/g以上。
实施例2、格氏乳杆菌RD-0046冻干菌粉的制备
将格氏乳杆菌RD-0046在pH 6.5的肉汤液体培养基(MRS)中生长，使用100升规 模的发酵罐发酵，厌氧培养。在平台期早期收集菌体，其活菌数达到约1.0×109CFU/ml 以上。通过离心分离收集菌体，用磷酸缓冲液洗涤后，与冻干保护剂(包括脱脂奶粉和 蔗糖等)混合。然后，将混合物置于冷冻干燥机中冷冻干燥。样品在-40℃下冷冻约2小 时，然后在-20℃下真空干燥20-30小时，再在30℃干燥3-5小时。冻干粉包装后，并冷 藏贮藏。将冻干粉进行活菌计数，活菌数应当在1.0×1010CFU/g以上。
实施例3、詹氏乳杆菌RD-0135冻干菌粉的制备
将詹氏乳杆菌RD-0135在pH 6.5的肉汤液体培养基(MRS)中生长，使用100升规 模的发酵罐发酵，厌氧培养。在平台期早期收集菌体，其活菌数达到约1.0×109CFU/ml 以上。通过离心分离收集菌体，用磷酸缓冲液洗涤后，与冻干保护剂(包括脱脂奶粉和 蔗糖等)混合。然后，将混合物置于冷冻干燥机中冷冻干燥。样品在-40℃下冷冻约2小 时，然后在-20℃下真空干燥20-30小时，再在30℃干燥3-5小时。冻干粉包装后，并冷 藏贮藏。将冻干粉进行活菌计数，活菌数应当在1.0×1010CFU/g以上。
实施例4、乳杆菌组合物的制备
分别取100g鼠李糖乳杆菌RD-060冻干菌粉、100g格氏乳杆菌RD-0046的菌粉、100g詹氏乳杆菌RD-0135的菌粉以及2.2kg微晶纤维素和10g硬脂酸镁混合，填充于2号硬 胶囊，每个胶囊填充220mg～250mg，做成乳杆菌组合物胶囊，并冷藏贮藏。计数确认单 一菌的活菌数均应当在1.0×108CFU/g以上。
实施例5、乳杆菌组合物的制备
分别取10g鼠李糖乳杆菌RD-060冻干菌粉、10g格氏乳杆菌RD-0046的菌粉、100g詹氏乳杆菌RD-0135的菌粉以及2.37kg微晶纤维素和10g二氧化硅混合，填充于2号硬 胶囊，每个胶囊填充220mg～250mg，做成乳杆菌组合物胶囊，并冷藏贮藏。计数确认鼠 李糖乳杆菌RD-060的活菌数在1.0×107CFU/g以上，格氏乳杆菌RD-0046的活菌数应 当在1.0×107CFU/g以上、詹氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在1.0×108CFU/g以上。
实施例6、乳杆菌组合物的制备
分别取100g鼠李糖乳杆菌RD-060冻干菌粉、10g格氏乳杆菌RD-0046的菌粉、10g詹氏乳杆菌RD-0135的菌粉以及2.37kg微晶纤维素和10g二氧化硅混合，填充于2号硬 胶囊，每个胶囊填充220mg～250mg，做成乳杆菌组合物胶囊，并冷藏贮藏。计数确认鼠 李糖乳杆菌RD-060的活菌数在1.0×108CFU/g以上，格氏乳杆菌RD-0046的活菌数应 当在1.0×107CFU/g以上、詹氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在1.0×107CFU/g以上。
实施例7、乳杆菌组合物的制备
分别取10g鼠李糖乳杆菌RD-060冻干菌粉、100g格氏乳杆菌RD-0046的菌粉、10g詹氏乳杆菌RD-0135的菌粉以及2.37kg微晶纤维素和10g二氧化硅混合，填充于2号硬 胶囊，每个胶囊填充220mg～250mg，做成乳杆菌组合物胶囊，并冷藏贮藏。计数确认鼠 李糖乳杆菌RD-060的活菌数在1.0×107CFU/g以上，格氏乳杆菌RD-0046的活菌数应 当在1.0×108CFU/g以上、詹氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在1.0×107CFU/g以上。
实施例8、乳杆菌组合物的制备
分别取100g鼠李糖乳杆菌RD-060冻干菌粉、100g格氏乳杆菌RD-0046的菌粉、100g詹氏乳杆菌RD-0135的菌粉以及2.2kg乳糖和10g硬脂酸镁混合，填充于2号硬胶囊， 每个胶囊填充220mg～250mg，做成乳杆菌组合物胶囊，并冷藏贮藏。计数确认单一菌的 活菌数应当在1.0×108CFU/g以上。
实施例9、乳杆菌组合物的制备
分别取10g鼠李糖乳杆菌RD-060冻干菌粉、100g格氏乳杆菌RD-0046的菌粉、10g詹氏乳杆菌RD-0135的菌粉以及2.37kg乳糖和10g硬脂酸镁混合，填充于2号硬胶囊， 每个胶囊填充220mg～250mg，做成乳杆菌组合物胶囊，并冷藏贮藏。计数确认鼠李糖乳 杆菌RD-060的活菌数在1.0×107CFU/g以上，格氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在 1.0×108CFU/g以上、詹氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在1.0×107CFU/g以上。
实施例10、乳杆菌组合物的制备
分别取10g鼠李糖乳杆菌RD-060冻干菌粉、10g格氏乳杆菌RD-0046的菌粉、100g詹氏乳杆菌RD-0135的菌粉以及2.37kg乳糖和10g硬脂酸镁混合，填充于2号硬胶囊， 每个胶囊填充220mg～250mg，做成乳杆菌组合物胶囊，并冷藏贮藏。计数确认鼠李糖乳 杆菌RD-060的活菌数在1.0×107CFU/g以上，格氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在 1.0×107CFU/g以上、詹氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在1.0×108CFU/g以上。
实施例11、乳杆菌组合物的制备
分别取10g鼠李糖乳杆菌RD-060冻干菌粉、50g格氏乳杆菌RD-0046的菌粉、10g 詹氏乳杆菌RD-0135的菌粉以及2.41kg乳糖和10g硬脂酸镁混合，填充于2号硬胶囊， 每个胶囊填充220mg～250mg，做成乳杆菌组合物胶囊，并冷藏贮藏。计数确认鼠李糖乳 杆菌RD-060的活菌数在1.0×107CFU/g以上，格氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在 5.0×107CFU/g以上、詹氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在1.0×107CFU/g以上。
实施例12、乳杆菌组合物的制备
分别取50g鼠李糖乳杆菌RD-060冻干菌粉、10g格氏乳杆菌RD-0046的菌粉、10g 詹氏乳杆菌RD-0135的菌粉以及2.41kg乳糖和10g硬脂酸镁混合，填充于2号硬胶囊， 每个胶囊填充220mg～250mg，做成乳杆菌组合物胶囊，并冷藏贮藏。计数确认鼠李糖乳 杆菌RD-060的活菌数在5.0×107CFU/g以上，格氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在 1.0×107CFU/g以上、詹氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在1.0×107CFU/g以上。
实施例13、乳杆菌组合物的制备
分别取10g鼠李糖乳杆菌RD-060冻干菌粉、10g格氏乳杆菌RD-0046的菌粉、10g 詹氏乳杆菌RD-0135的菌粉以及2.46kg乳糖和10g硬脂酸镁混合，填充于2号硬胶囊， 每个胶囊填充220mg～250mg，做成乳杆菌组合物胶囊，并冷藏贮藏。计数确认鼠李糖乳 杆菌RD-060的活菌数在1.0×107CFU/g以上，格氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在 1.0×107CFU/g以上、詹氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在1.0×107CFU/g以上。
实施例14、乳杆菌组合物的制备
分别取100g鼠李糖乳杆菌RD-060冻干菌粉、10g格氏乳杆菌RD-0046的菌粉、50g詹氏乳杆菌RD-0135的菌粉以及2.33kg乳糖和10g硬脂酸镁混合，填充于2号硬胶囊， 每个胶囊填充220mg～250mg，做成乳杆菌组合物胶囊，并冷藏贮藏。计数确认鼠李糖乳 杆菌RD-060的活菌数在1.0×108CFU/g以上，格氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在 1.0×107CFU/g以上、詹氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在5.0×107CFU/g以上。
实施例15、乳杆菌组合物的制备
分别取1g鼠李糖乳杆菌RD-060冻干菌粉、1g格氏乳杆菌RD-0046的菌粉、1g詹 氏乳杆菌RD-0135的菌粉以及2.49kg乳糖和10g硬脂酸镁混合，填充于2号硬胶囊，每 个胶囊填充220mg～250mg，做成乳杆菌组合物胶囊，并冷藏贮藏。计数确认鼠李糖乳杆 菌RD-060的活菌数在1.0×106CFU/g以上，格氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在 1.0×106CFU/g以上、詹氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在1.0×106CFU/g以上。
实施例16、乳杆菌组合物的制备
分别取100g鼠李糖乳杆菌RD-060冻干菌粉、10g格氏乳杆菌RD-0046的菌粉、50g詹氏乳杆菌RD-0135的菌粉以及2.33kg微晶纤维素和10g硬脂酸镁混合，填充于2号硬 胶囊，每个胶囊填充220mg～250mg，做成乳杆菌组合物胶囊，并冷藏贮藏。计数确认鼠 李糖乳杆菌RD-060的活菌数在1.0×108CFU/g以上，格氏乳杆菌RD-0046的活菌数应 当在1.0×107CFU/g以上、詹氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在5.0×107CFU/g以上。
实施例17、乳杆菌组合物的制备
分别取1g鼠李糖乳杆菌RD-060冻干菌粉、1g格氏乳杆菌RD-0046的菌粉、1g詹 氏乳杆菌RD-0135的菌粉以及2.49kg微晶纤维素和10g硬脂酸镁混合，填充于2号硬胶 囊，每个胶囊填充220mg～250mg，做成乳杆菌组合物胶囊，并冷藏贮藏。计数确认鼠李 糖乳杆菌RD-060的活菌数在1.0×106CFU/g以上，格氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当 在1.0×106CFU/g以上、詹氏乳杆菌RD-0046的活菌数应当在1.0×106CFU/g以上。
实施例18、乳杆菌组合物的毒性考察
5只SPF级昆明种小鼠，每只小鼠阴道给药0.3ml乳杆菌组合物(实施例4～实施例17)悬浮菌液(每种菌至少大于1×106CFU/只鼠)。按2015版中国药典要求，每天测 量每只小鼠体重，并观察、记录每只小鼠注射前后的行为和生理等变化。结果显示7天 内所有动物体重均有增加，未见明显中毒症状，活动行为无异常，无动物死亡，认为该 乳杆菌组合物无毒性。
实施例19、组合物对致病菌的抑菌能力实验
阴道炎症往往与致病菌相关，比加德纳氏菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、阿托波菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌等相关，因此将组合物、单 一菌及上市品(定君生)分别与大肠埃希氏菌、加德纳氏菌进行体外抑菌试验考察。
①对大肠埃希氏菌的抑菌能力考察
将鼠李糖乳杆菌RD-060(活菌数大于1.0×1010CFU/g)、格氏乳杆菌RD-0046(活 菌数大于1.0×1010CFU/g)、詹氏乳杆菌RD-0135(活菌数大于1.0×1010CFU/g)、组 合物(鼠李糖乳杆菌RD-060、格氏乳杆菌RD-0046、詹氏乳杆菌RD-0135的实施例17 组合物，即选择活菌数最少的组合物)、上市品(定君生，活菌数大于1.0×108CFU/g)) 分别在肉汤固体培养基(MRS)中培养48h，用圆形取样器形成8mm固体菌饼培养物。
将大肠埃希氏菌液涂布在麦康凯琼脂平皿中，然后将上述菌饼放置在含有大肠埃希 氏菌的固体培养基中，并于37℃培养24h，24h观察抑菌圈大小，结果如下：
| —— | 本发明组合物 | 鼠李糖乳杆菌 | 格氏乳杆菌 | 詹氏乳杆菌 | 上市品(定君生) |
| 菌圈大小 | 19.4mm | 14.3mm | 13.2mm | 12.5mm | 10.7mm |
其中组合物抑菌图见说明书附图图1，上市定君生的抑菌图见图2。
对于好氧致病菌大肠埃希氏菌的抑菌能力分别为组合物(鼠李糖乳杆菌RD-060、格 氏乳杆菌RD-0046、詹氏乳杆菌RD-0135)＞鼠李糖乳杆菌RD-060＞格氏乳杆菌RD-0046＞ 詹氏乳杆菌RD-0135＞上市品(定君生)。
当三个菌组合物中各个菌落数量达到1.0×106CFU/g时，即可达到很好抑菌效果。
①对加德纳氏菌的抑菌能力考察
将鼠李糖乳杆菌RD-060、格氏乳杆菌RD-0046、詹氏乳杆菌RD-0135、实施例17 的组合物(鼠李糖乳杆菌RD-060、格氏乳杆菌RD-0046、詹氏乳杆菌RD-0135)、上市 品(定君生)分别在肉汤固体培养基(MRS)中培养48h，用圆形取样器形成8mm固体 菌饼培养物。
将加德纳氏菌液涂布在哥伦比亚琼脂培养基平皿中，然后将上述菌饼放置在上述含 有加德纳氏菌的哥伦比亚琼脂培养基平皿中，并于37℃下厌氧培养24h，24h观察抑菌圈大小，结果如下：
| —— | 本发明组合物 | 鼠李糖乳杆菌 | 格氏乳杆菌 | 詹氏乳杆菌 | 上市品(定君生) |
| 菌圈大小 | 45.3mm | 29.8mm | 30.2mm | 31.4mm | 26.4mm |
其中组合物菌抑菌图见说明书附图图3，上市定君生的抑菌图见图4。
抑菌能力。对于加德纳氏菌的抑菌能力分别为：组合物(鼠李糖乳杆菌RD-060、格氏乳杆菌RD-0046、詹氏乳杆菌RD-0135)＞詹氏乳杆菌RD-0135＞鼠李糖乳杆菌RD-060＞格氏乳杆菌RD-0046＞上市品(定君生)。
实施例20、组合物的食蟹猴阴道定植实验
选择4只健康食蟹猴随机分组，分成2组，对照组动物2只(动物编号为QS1912、QS1913)，实验组2只(动物编号为WS1315、WS1316)。其中实验动物为由苏州西山 中科实验动物有限公司提供的雌性食蟹猴。试验方法如下：
在可观察到正常月经周期的猴子月经后，先用甲硝唑栓剂(200mg/只)连续阴道给药5天，然后将实验组2只给予组合物(实施例17制备的胶囊)再连续给药5天(选 择活菌数量最少的实施例17制备的胶囊考察定植)，将对照组2只给予上市品定君生胶 囊再连续给药5天。每周对动物的阴道进行一次观察，检查阴道分泌物的颜色，性状及 分泌量及测定阴道分泌物pH，取2只无菌聚酯棉签取样，其中一只棉签用于阴道分泌物 清洁度镜检，另一支棉签用于菌群分析。
阴道菌的分离和纯化培养：将采集的阴道分泌物，在2mL D-Hanks缓冲液中振荡，以磷酸盐缓冲液做梯度稀释，分别涂布于MRS琼脂板上并且在37℃，厌氧条件下培养 24～48h。记录单菌落形态等信息，重新划线MRS琼脂板以得到纯化的菌落并进行生化 和分子鉴定。
分子生物学方法鉴定(16SrDNA基因序列分析)：对所分离纯化出的菌株进行16SrDNA的序列扩增、测序及分析，将鉴定为16SrDNA片段的PCR扩增产物使用切 胶回收法对目的片段纯化后进行测序。将测得的16SrDNA基因序列使用NCBI中的 BLAST工具与GenBank数据库中的已知序列进行比对分析，当比对同源性大于或等于 99％，则鉴定为同一物种。
实验结果及分析：阴道粘膜及分泌物一般观察：植入后每周观察一次，结果发现所有试验动物阴道粘膜分泌物未发现明显异常。
(1)阴道分泌物pH值测定：在胶囊给药后，大部分实验组动物阴道分泌物pH值明显低于上市品对照组(定君生)，且相对于植入前明显下降，pH值测定结果如下表所示：
(2)阴道分泌物清洁度：植入前后相比，对照组阴道清洁度略有降低；而实验组(本发明组合物)在给药植入后，阴道分泌物清洁度明显优于对照组，可见到数量不等的革兰氏阳性阴道杆菌，清洁度明显高于对照组。阴道分泌物清洁度判定结果如下表所示：
I～III为清洁程度，III表示洁净度最低。
将实验组分泌物进行扩增分离纯化，经过阴道菌群分析，从实验组全部2只动物阴道分泌物中均发现鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)RD-0060、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)RD-0046、詹氏乳杆菌(Lactobacillus.jensenii)RD-0135分离出 的乳杆菌的信息如图所示为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)RD-0060、格氏乳 杆菌(Lactobacillus gasseri)RD-0046、詹氏乳杆菌(Lactobacillus.jensenii)RD-0135。 因此可以看出，本发明乳杆菌组合物可以有效定植于食蟹猴阴道内。
对比发现，本发明的乳杆菌组合物的定植后清洁度和pH均明显优于上市品定君生， 优于已上市的单一菌株，结果表明表明本发明特定的乳杆菌组合物能有效定植。
三株菌定植分离的16SrDNA片段PCR扩增产物的电泳图：
格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)RD-0046的基因组DNA提取结果见说明书附图 5：
格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)RD-0046的PCR产物扩增结果见说明书附图6。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)RD-0060基因组DNA提取结果见说明书附 图7；
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)RD-0060的PCR产物扩增结果见说明书附 图8。
詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)RD-0135基因组DNA提取结果见说明书附图9；
詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)RD-0135的PCR产物扩增结果见说明书附图10。
实施例21、组合物的细胞粘附
组合物可用于细菌性阴道病的治疗。在阴道内用药时，将与阴道上皮细胞粘附产生 作用。
将单一菌株RD-0046\RD-0060\RD-0135于MRS培养基培养后，乳杆菌组合物(实 施例17)制剂于MRS培养基培养后分别与体外培养的VK2/E6E7人阴道上皮细胞孵育 2h、4h，培养结束后清洗未粘附的细菌，然后用tritonx-100裂解细胞，制成混悬菌液， 梯度稀释后接种于MRS琼脂培养板上，厌氧培养48小时后统计每平板的菌落数，计算 粘附率，以粘附细菌除以初始细菌得到粘附率。
其中乳杆菌组合物的细胞黏附图参见附图11、黏附后细菌涂布计数图参见附图12。
数据显示，相对于单一菌株，本发明的乳杆菌组合物可有相互促进与细胞的黏附，黏附总细菌很大，这样细菌可以有效定植在细胞上，这对发生协同作用产生积极效果。
实施例22、组合物的细胞粘附
将单一菌株RD-0046\RD-0060\RD-0135于MRS培养基培养后，乳杆菌组合物(实 施例5)制剂于MRS培养基培养后分别与体外培养的VK2/E6E7人阴道上皮细胞孵育2h、 4h，培养结束后清洗未粘附的细菌，然后用tritonx-100裂解细胞，制成混悬菌液，梯度 稀释后接种于MRS琼脂培养板上，厌氧培养48小时后统计每平板的菌落数，计算粘附 率，以粘附细菌除以初始细菌得到粘附率。
数据显示，相对于单一菌株，本发明的乳杆菌组合物可有相互促进与细胞的黏附，黏附总细菌很大，这样细菌可以有效定植在细胞上，这对发生协同作用产生积极效果。
实施例23、组合物的细胞粘附
将单一菌株RD-0046\RD-0060\RD-0135于MRS培养基培养后，乳杆菌组合物(实 施例11)制剂于MRS培养基培养后分别与体外培养的VK2/E6E7人阴道上皮细胞孵育 2h、4h，培养结束后清洗未粘附的细菌，然后用tritonx-100裂解细胞，制成混悬菌液， 梯度稀释后接种于MRS琼脂培养板上，厌氧培养48小时后统计每平板的菌落数，计算 粘附率，以粘附细菌除以初始细菌得到粘附率。
数据显示，相对于单一菌株，本发明的乳杆菌组合物可有相互促进与细胞的黏附，黏附总细菌很大，这样细菌可以有效定植在细胞上，这对发生协同作用产生积极效果。
实施例24、组合物的细胞粘附
将单一菌株RD-0046\RD-0060\RD-0135于MRS培养基培养后，乳杆菌组合物(实 施例12)制剂于MRS培养基培养后分别与体外培养的VK2/E6E7人阴道上皮细胞孵育 2h、4h，培养结束后清洗未粘附的细菌，然后用tritonx-100裂解细胞，制成混悬菌液， 梯度稀释后接种于MRS琼脂培养板上，厌氧培养48小时后统计每平板的菌落数，计算 粘附率，以粘附细菌除以初始细菌得到粘附率。
数据显示，相对于单一菌株，本发明的乳杆菌组合物可有相互促进与细胞的黏附，黏附总细菌很大，这样细菌可以有效定植在细胞上，这对发生协同作用产生积极效果。
序列表
<110> 广东龙创基药业有限公司
广东强基药业有限公司
赵湘江
<120> 三种乳杆菌的组合物及其用途
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1506
<212> DNA
<213> 鼠李糖乳杆菌RD-0060(Lactobacillus rhamnosus RD-0060)
<400> 1
aatttttgtc caccttagac ggctcgctcc ctaaaagggt tacgccaccg gcttcgggtg 60
ttacaaactc tcatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg 120
gcgtgctgat ccgcgattac tagcgattcc gacttcgtgt aggcgagttg cagcctacag 180
tccgaactga gaatggcttt aagagattag cttgacctcg cggtctcgca actcgttgta 240
ccatccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc 300
cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt cttactagag tgcccaacta aatgctggca 360
actagtcata agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg 420
acgacaacca tgcaccacct gtcattttgc ccccgaaggg gaaacctgat ctctcaggtg 480
atcaaaagat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct 540
ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc aaccttgcgg tcgtactccc 600
caggcggaat gcttaatgcg ttagctgcgg cactgaaggg cggaaaccct ccaacaccta 660
gcattcatcg tttacggcat ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct acccatgctt 720
tcgagcctca gcgtcagtta cagaccagac agccgccttc gccactggtg ttcttccata 780
tatctacgca tttcaccgct acacatggag ttccactgtc ctcttctgca ctcaagtttc 840
ccagtttccg atgcacttcc tcggttaagc cgagggcttt cacatcagac ttaaaaaacc 900
gcctgcgctc gctttacgcc caataaatcc ggataacgct tgccacctac gtattaccgc 960
ggctgctggc acgtagttag ccgtggcttt ctggttggat accgtcacgc cgacaacagt 1020
tactctgccg accattcttc tccaacaaca gagttttacg acccgaaagc cttcttcact 1080
cacgcggcgt tgctccatca gacttgcgtc cattgtggaa gattccctac tgctgcctcc 1140
cgtaggagtt tgggccgtgt ctcagtccca atgtggccga tcaacctctc agttcggcta 1200
cgtatcattg ccttggtgag ccgttacctc accaactagc taatacgccg cgggtccatc 1260
caaaagcgat agcttacgcc atctttcagc caagaaccat gcggttcttg gatttatgcg 1320
gtattagcat ctgtttccaa atgttatccc ccacttaagg gcaggttacc cacgtgttac 1380
tcacccgtcc gccactcgtt caaaattaaa tcaagatgca agcacctttc aataatcaga 1440
actcgttcga cttgcatgta ttaggcacgc cgccagcgtt catcctgacc agaaaaaaaa 1500
actcat 1506
<210> 2
<211> 1480
<212> DNA
<213> 格氏乳杆菌RD-0046(Lactobacillus gasseri RD-0046)
<400> 2
attcctggtc taccttagac ggctgactcc tataaagggt tatcccaccg gctttgggtg 60
ttacagactc tcatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg 120
gcgtgctgat ccgcgattac tagcgattcc agcttcgtgt aggcgagttg cagcctacag 180
ttcgaactga gaacggcttt cagagatccg cttaccttcg caggttcgct tctcgttgta 240
ccgtccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgact tgacgtcatc 300
cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt ctcattagag tgcccaactt aatgatggca 360
actaatgaca agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg 420
acgacagcca tgcaccacct gtctcagcgt ccccgaaggg aacacctaat ctcttaggtt 480
tgcactggat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct 540
ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc aaccttgcgg tcgtactccc 600
caggcggagt gcttaatgcg ttagctgcag cactgagagg cggaaacctc ccaacactta 660
gcactcatcg tttacggcat ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct acccatgctt 720
tcgagcctca gcgtcagttg cagaccagag agccgccttc gccactggtg ttcttccata 780
tatctacgca ttccaccgct acacatggag ttccactctc ctcttctgca ctcaagttca 840
acagtttctg atgcaattct ccggttgagc cgaaggcttt cacatcagac ttattgaacc 900
gcctgcactc gctttacgcc caataaatcc ggacaacgct tgccacctac gtattaccgc 960
ggctgctggc acgtagttag ccgtgacttt ctaagtaatt accgtcaaat aaaggccagt 1020
tactacctct atctttcttc actaccaaca gagctttacg agccgaaacc cttcttcact 1080
cacgcggcgt tgctccatca gacttgcgtc cattgtggaa gattccctac tgctgcctcc 1140
cgtaggagtt tgggccgtgt ctcagtccca atgtggccga tcagtctctc aactcggcta 1200
tgcatcattg ccttggtaag ccgttacctt accaactagc taatgcaccg caggtccatc 1260
caagagtgat agcagaacca tcttttaaac tctagacatg cgtctagtgt tgttatccgg 1320
tattagcatc tgtttccagg tgttatccca gtctcttggg caggttaccc acgtgttact 1380
cacccgtccg ccgctcgctt gtatctagtt tcatttggtg caagcaccaa attcatctag 1440
gcaagctcgc tcgactgcat gtatagcatg ccgccactgg 1480
<210> 3
<211> 1470
<212> DNA
<213> 詹氏乳杆菌RD-0135(Lactobacillusjensenii RD-0135)
<400> 3
ccagtggcgg gcgtgctata catgcagtcg agcgagcttg cctattgaaa ttcttcggaa 60
tggacataga tacaagctag cggcggatgg gtgagtaacg cgtgggtaac ctgcccttaa 120
gtctgggata ccatttggaa acagatgcta ataccggata aaagctactt tcgcatgaaa 180
gaagtttaaa aggcggcgta agctgtcgct aaaggatgga cctgcgatgc attagctagt 240
tggtaaggta acggcttacc aaggcgatga tgcatagccg agttgagaga ctgatcggcc 300
acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac 360
aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa gaaggttttc ggatcgtaaa 420
gctctgttgt tggtgaagaa ggatagaggt agtaactggc ctttatttga cggtaatcaa 480
ccagaaagtc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt 540
gtccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggattg ataagtctga tgtgaaagcc 600
ttcggctcaa ccgaagaact gcatcagaaa ctgtcaatct tgagtgcaga agaggagagt 660
ggaactccat gtgtagcggt ggaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc 720
ggctctctgg tctgtaactg acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga 780
taccctggta gtccatgccg taaacgatga gtgctaagtg ttgggaggtt tccgcctctc 840
agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact 900
caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg 960
cgaagaacct taccaggtct tgacatcctt tgaccaccta agagattagg ttttcccttc 1020
ggggacaaag agacaggtgg tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt 1080
aagtcccgca acgagcgcaa cccttgttaa tagttgccag cattaagttg ggcactctat 1140
tgagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaagtcat catgcccctt 1200
atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg gcagtacaac gagaagcgaa cctgtgaagg 1260
caagcggatc tcttaaagct gttctcagtt cggactgtag gctgcaactc gcctacacga 1320
agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc acgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1380
tacacaccgc ccgtcacacc atgagagttt gtaacaccca aagtcggtga ggtaaccttt 1440
ggagccagcc gcctaaggtg gaccagagtt 1470
Claims (10)
1.一种由三种乳杆菌组成的组合物，包含鼠李糖乳杆菌菌株、格氏乳杆菌菌株和詹氏乳杆菌菌株，其特征在于所述鼠李糖乳杆菌(RD-0060)保藏编号为CGMCCNo.14184，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心；所述格氏乳杆菌(RD-0046)保藏编号为CGMCCNo.14109，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心；所述詹氏乳杆菌(RD-0135)保藏编号为CGMCCNo.14112，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，其中所述鼠李糖乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌三者的质量份为(1-10):(1-10):(1-10)。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，其中所述鼠李糖乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌三者的质量份为(1-5):(1-5):(1-5)。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于其中所述鼠李糖乳杆菌、格氏乳杆菌、詹氏乳杆菌的每个菌的活菌数量至少要达到1.0×106CFU/g以上
5.一种药物组合物，由权利要求1-4所述组合物以及药学上可用的辅料组成，也可不含药用辅料。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，所述药学上可用的辅料包括乳糖、微晶纤维素、淀粉、预胶化淀粉、二氧化硅、硬酯酸镁等。
7.一种根据权利要求1-4任一项所述的组合物制备预防和/或治疗妇科疾病药物的用途。
8.根据权利要求7所述的组合物的用途，所述妇科疾病药物包括阴道疾病药物。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述阴道疾病，其致病菌包括加德纳菌、白色念珠菌、阿托波菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌等。
10.一种根据权利要求1-4任一项所述的组合物用于制备具有调节阴道菌群平衡药物的用途。
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