CN117683691A - 一株罗伊氏粘液乳杆菌及其在制备用于防治阴道炎药物中的应用 - Google Patents
一株罗伊氏粘液乳杆菌及其在制备用于防治阴道炎药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
一株罗伊氏粘液乳杆菌及其在制备用于防治阴道炎药物中的应用，其罗伊氏粘液乳杆菌GF24(Limosilactobacillus reuteri GF24)于2023年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20231529。本发明还公开了罗伊氏粘液乳杆菌GF24及其发酵组合物在制备预防和/或治疗阴道炎的药物中的应用。该罗伊氏粘液乳杆菌GF24可高效抑制白色念珠菌、酿酒酵母、铜绿假单胞菌、大肠埃氏菌、金黄色葡萄球菌、加德纳杆菌、阴沟肠杆菌等阴道炎致病菌，且不抑制乳杆菌的生长；还能分泌溶菌酶和罗伊氏菌素，进一步广泛抑制肠道及阴道中革兰阴性杆菌、真菌等致病菌的生长，可用于制备预防或治疗阴道炎的药物、以及用于制备调节肠道菌群的生物制剂、功能性食品或药物；此外，还可以产生有机酸，用于发酵食品的制备。
Description
技术领域
本发明属于益生菌技术领域及医药技术领域，尤其是涉及一株罗伊氏粘液乳杆菌及其在制备用于防治阴道炎药物中的应用。
背景技术
女性生殖道感染是全球性的重大公共卫生问题。女性生殖道中存在多种微生物，有细菌(需氧菌及厌氧菌等)、真菌(假丝酵母菌)、支原体、滴虫、衣原体、病毒、螺旋体等。阴道微生物菌群种类繁多，相互共生和拮抗，形成复杂的微生态体系。根据病原体的不同，阴道感染性疾病可分为10余种。其中，细菌性阴道病、外阴阴道假丝酵母菌和需氧性阴道炎较为普遍。混合性阴道炎(mixed vaginitis)是由两种或两种以上的致病微生物导致的阴道炎症，混合性阴道炎近年来呈快速上升的趋势，混合性阴道炎既往多采用抗菌药物治疗，比如：口服硝基咪唑类+局部抗真菌药物，但该疗法易引起耐药菌株产生，同时二重感染机会增加。
近年来，微生态技术发展迅速，让人们了解到阴道微生态在阴道感染、孕产期安全等的发生及发展等过程中的重要作用。以乳杆菌为主的优势菌群构成了阴道微生态屏障，在调节阴道微生态平衡中发挥着关键作用，而几乎所有的生殖道感染都伴随着女性阴道微环境的改变(如优势菌乳杆菌的减少或消失)。因此，应用乳杆菌制剂为代表的阴道微生态疗法近年来越来越受到重视，比如，国内批准上市的阴道用乳杆菌活菌胶囊德式乳杆菌DM8909，用于防治细菌性阴道病的乳杆菌活菌制剂，CN114250186B公开了一株格式乳杆菌用于缓解细菌性阴道炎，该菌能够在体外显著抑制加德纳菌生物膜的形成，并且能够很好的定植于阴道内。CN107267415B公开了一种罗伊氏乳杆菌及其用于制备阴道抑菌药物的应用，对致病菌的抑菌能力很强，且强于常用的德氏乳杆菌，同时具有突出的阴道上皮细胞粘附能力。
溶菌酶，属于天然的杀菌物质，能够有效溶解细菌细胞壁，达到抗菌、消炎疗效，还能促进局部组织功能恢复，故，溶菌酶可用于阴道炎、妇科厌氧菌感染的治疗。罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)，为乳杆菌属，是人体正常菌群之一，广泛分布于人体肠道中，在女性阴道中也有分布。对于常规存在于阴道中的菌株而言，在现有技术的认知范畴中其并不具有特异性的抑菌作用。现有技术研究表明，罗伊氏乳杆菌能够较好地耐受动物消化道环境，并能够在人和动物消化道定植，起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、预防龋齿等作用。此外，罗伊氏乳杆菌的胞外代谢产物主要包括乳酸、乙酸和乙醇等，并能代谢甘油产生一种特殊的抑菌素——罗伊氏菌素，其主要成份是3-羟基丙醛(3-HPA)的单体、水合物和环化二聚体。
因此，开发具有分泌溶菌酶、广谱抗菌物质且能高效抑制阴道炎致病菌(尤其是混合性阴道炎致病菌)的罗伊氏粘液乳杆菌，对预防或治疗阴道混合感染具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供罗伊氏粘液乳杆菌GF24及其发酵组合物的新应用，具体为在用于制备预防或治疗阴道炎药物中的应用，尤其是罗伊氏粘液乳杆菌GF24与其代谢产物通过抑制白色念珠菌、酿酒酵母、铜绿假单胞菌、大肠埃氏菌、金黄色葡萄球菌、加德纳杆菌和阴沟肠杆菌等常见致病菌、以及分泌溶菌酶和罗伊氏菌素，进而提高对阴道炎的防治效果。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一株罗伊氏粘液乳杆菌，所述罗伊氏粘液乳杆菌GF24(Limosilactobacillusreuteri GF24)于2023年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20231529。
罗伊氏粘液乳杆菌GF24分离自成都农家酸面团，将分离纯化的菌株进行16S rRNA鉴定，将测得的16S rRNA序列进行NCBI BLAST比对，与Genebank中的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)相似度大于99％，可鉴定该菌株为罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillus reuteri)，基于16S rRNA基因序列比对结果以Pediococcusdamnosus DSMZ20331(AJ318414)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树，该菌株的16S rRNA鉴定序列如SEQ ID NO:1所示，命名为罗伊氏粘液乳杆菌GF24(Limosilactobacillus reuteri GF24)。
罗伊氏粘液乳杆菌GF24在MRS培养基上培养形成的菌落呈近圆形，菌落大小中等，乳白色，向上凸起，较湿润。革兰氏染色后呈阳性，杆状，其适宜的生长温度为30～40℃，生长pH为3.5-7.0。
本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种发酵组合物，通过使用上述的罗伊氏粘液乳杆菌GF24发酵生产制得。所述发酵组合物包括罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌、罗伊氏粘液乳杆菌GF24灭活菌体、代谢产物和罗伊氏粘液乳杆菌GF24后生元中的一种或多种；其中代谢产物为罗伊氏粘液乳杆菌GF24在MRS培养基中37℃发酵培养24h后，发酵液通过离心后得到的离心上清液经高温灭活(121℃、30min)、浓缩、喷雾干燥制备而成，含有溶菌酶等多种粗酶以及罗伊氏菌素等抗菌物质。
优选，所述罗伊氏粘液乳杆菌GF24后生元为罗伊氏粘液乳杆菌GF24在MRS培养基中发酵培养结束后，通过细胞裂解、灭活、浓缩、喷雾干燥含有罗伊氏粘液乳杆菌GF24及其代谢产物的固体粉末，包括死细胞、菌体裂解物和/或发酵液。
本发明进一步解决其技术问题所采用的另一技术方案是：
罗伊氏粘液乳杆菌GF24和/或上述发酵组合物在制备用于预防和/或治疗阴道炎的药物中的应用。
所述阴道炎包括细菌性阴道炎、念珠菌性阴道炎、假丝酵母阴道炎及混合性阴道炎，尤其，在制备用于预防和/或治疗混合性阴道炎的药物中，罗伊氏粘液乳杆菌GF24及其发酵组合物具有显著优势。
在此应用中，所述组合物中罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌的用量为1*109～2*1010CFU/day，罗伊氏粘液乳杆菌GF24灭活菌体的用量为1～5*1010个/day，罗伊氏粘液乳杆菌GF24代谢产物为100～1000mg/day，罗伊氏粘液乳杆菌GF24后生元为5.0*109～1*1011个/day。
本发明提供了一种用于预防和/或治疗阴道炎的药物，所述药物包含上述罗伊氏粘液乳杆菌GF24和/或上述发酵组合物。
所述药物通过如下至少一种功能实现对阴道炎的防治作用：
b)高效抑制白色念珠菌、酿酒酵母、铜绿假单胞菌、大肠埃氏菌、金黄色葡萄球菌、加德纳杆菌和阴沟肠杆菌；
b)对常见阴道乳杆菌无抑制作用；
c)分泌溶菌酶；
d)分泌罗伊氏菌素；
e)合成有机酸(包括但不限于乳酸，乙酸)，降低阴道pH。
所述药物包括上述组合物和药学上可接受的载体和/或药用辅料。
在一种实施方式中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂或润滑剂中的一种或多种。
优选，所述药物为口服药物或阴道胶囊栓剂。
在一种实施方式中，所述填充剂为海藻糖、壳聚糖、淀粉或糊精中的一种或多种；所述粘合剂为液状葡萄糖、淀粉糊或糖浆的一种或多种；所述润湿剂为甘油或乙醇中的一种或多种；所述崩解剂为交联聚维酮、羧甲基淀粉钠或交联羧甲基淀粉钠的一种或多种；所述润滑剂为二氧化硅硬脂酸镁或硬脂酸富马酸钠的一种或多种。
本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
罗伊氏粘液乳杆菌GF24和/或上述发酵组合物在制备用于调节肠道菌群的生物制剂或功能性食品或药物中的应用。其中，所述功能性食品为酵素、泡菜、固体饮料、丸剂、片剂或微胶囊晶球中的任意一种。
所述调节肠道菌群至少包括以下一种：
a)分泌罗伊氏菌素；
b)分泌溶菌酶；
c)调节肠道pH，促进肠道有益菌群的生长。
其中，现有研究表明：罗伊氏菌素是一种广谱有效的抗菌物质，能抑制埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌、弧菌、梭菌、葡萄球菌的生长，罗伊氏菌素浓度在15～30μg/ml，可抑制革兰氏阳性菌和阴性菌、酵母、真菌及原生动物的生长，且罗伊氏粘液乳杆菌GF24具有较强的胃肠液耐受性和胆盐耐受性，能通过人等哺乳动物的胃肠道后调节肠道菌群。
罗伊氏粘液乳杆菌GF24作为发酵剂在泡菜、酸菜等发酵食品中的应用。
本发明罗伊氏粘液乳杆菌的有益效果：
本发明的罗伊氏粘液乳杆菌GF24，一方面通过高效抑制白色念珠菌、酿酒酵母、铜绿假单胞菌、大肠埃氏菌、金黄色葡萄球菌、加德纳杆菌、阴沟肠杆菌等阴道炎致病菌，且不抑制乳杆菌的生长；另一方面，罗伊氏粘液乳杆菌GF24分泌溶菌酶和罗伊氏菌素，GF24发酵24h后分泌的溶菌酶的酶活力和罗伊氏菌素含量分别高达63.16U/ml和32mmol/L，进一步抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原虫等的生长，此外，罗伊氏粘液乳杆菌GF24可快速产酸且持久，能显著降低阴道pH，在体内抑制白色念珠等阴道致病菌，显著恢复乳杆菌；进而提高对阴道炎尤其是混合性阴道炎的防治效果。因此，罗伊氏粘液乳杆菌GF24在制备预防和/或治疗阴道炎的药物中，具有巨大的应用前景。
动物试验表明，本发明的罗伊氏粘液乳杆菌GF24及其后生元具有良好的安全性，且具有良好的胃肠液耐受性和胆盐耐受性，可口服并在体内使用。
罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌分泌溶菌酶和罗伊氏菌素，抑制常见体内致病菌的生长，可用于制备调节肠道菌群的生物制剂中的应用，为罗伊氏粘液乳杆菌GF24提供了新的应用方向。
生物材料保藏
罗伊氏粘液乳杆菌GF24(Limosilactobacillus reuteri GF24)于2023年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20231529，保藏地址为：湖北省武汉市武已区八一路299号。
附图说明
图1—为本发明罗伊氏粘液乳杆菌GF24的菌落图；
图2—为本发明罗伊氏粘液乳杆菌GF24显微镜下形态图；
图3—为本发明罗伊氏粘液乳杆菌GF24系统发育树；
图4—为本发明罗伊氏粘液乳杆菌GF24对活金黄色葡萄球菌和死金黄色葡萄球菌的溶解曲线图；
图5—为本发明罗伊氏粘液乳杆菌GF24分泌罗伊氏菌素的含量变化图；
图6—为本发明罗伊氏粘液乳杆菌GF24对常见致病菌的抑菌照片；
其中：A、白色念珠菌ATCC10231，B、酿酒酵母ATCC9763，C、铜绿假单胞菌ATCC15442，D、大肠埃氏菌8099，E、金黄色葡萄球菌CMCC26003，F、加德纳杆菌ATCC14018，G、阴沟肠杆菌ATCC23373，H、幽门螺旋杆菌26695；
图7—为本发明罗伊氏粘液乳杆菌GF24对常见阴道乳杆菌的抑菌照片；
其中：A、卷曲乳杆菌，B、鼠李糖乳酪杆菌，C、惰性乳杆菌，D、植物乳植杆菌，E、唾液联合乳杆菌，F、加氏乳杆菌。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
以下为本发明实施例中所涉及的培养基：
MRS培养基(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉粉5.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，吐温80 1.5，K2HPO4·7H2O 2.0，无水乙酸钠5，柠檬酸二氨2.0，MgSO4·7H2O 0.2，MnSO4·H2O 0.038，(加琼脂粉15g/L为固体培养基)。
实施例1
罗伊氏粘液乳杆菌GF24的筛选及鉴定
罗伊氏粘液乳杆菌GF24(Limosilactobacillus reuteri GF24)于2023年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20231529。
a)罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌株的筛选
样品采集于成都农家酸面团，将采集的样品称取1g，放入9mL无菌生理盐水中。充分震荡混匀后，10倍梯度稀释涂布于MRS固体培养基中，37℃培养48h。肉眼观察，挑取培养基中不同形态大小的单菌落，划线纯化4次以上。通过显微镜观察和溶钙法初步确定为乳酸菌，并将纯化的菌株45％甘油保存于-80℃冰箱备用。
b)菌株形态及显微镜观察
罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌株菌落形态参见图1，菌落呈近圆形，菌落大小中等，乳白色，向上凸起，较湿润。显微镜形态参见图2，罗伊氏粘液乳杆菌GF24呈杆状，革兰氏染色后呈阳性。
c)菌株分子生物学鉴定
将纯化的罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌株进行16S rRNA鉴定，将测得的16S rRNA序列进行NCBI BLAST比对，与Genebank中的罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillusreuteri)相似度大于99％，可鉴定该菌株为罗伊氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillusreuteri)，基于16S rRNA基因序列比对结果以Pediococcus damnosus DSMZ20331(AJ318414)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树，其系统发育树如图3所示，该菌株的16S rRNA鉴定序列如SEQ ID NO:1所示，命名为罗伊氏粘液乳杆菌GF24(Limosilactobacillus reuteri GF24)。
d)菌株产酸性能测定
将罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌株菌种按5％的接种量分别接种到MRS培养基中，37℃活化培养24小时，连续活化两次。将活化好的GF24菌液按5％的接种量接种到MRS培养基液体培养基中，混合均匀后按8ml/支分装到无菌试管中(18mm×180)。将分装好的罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌液放置在37℃恒温培养箱中静置培养，并取3支试管，每隔8小时，测定菌液总酸。
罗伊氏粘液乳杆菌GF24产酸结果见表1，培养时间8、16、24和32小时，产酸分别为0.84g/100ml，1.27g/100ml，1.63g/100ml，1.69g/100ml，因此，罗伊氏粘液乳杆菌GF24具备产酸快、产酸持久的特点，可作为发酵剂用于发酵食品的制作。
表1罗伊氏粘液乳杆菌GF24产酸
实施例2
罗伊氏粘液乳杆菌GF24对人体胃肠耐受性、胆盐耐受性试验
a)菌株的活化及培养
在无菌的超净工作台里，将保存好的罗伊氏粘液乳杆菌GF24接种到装有10mL MRS液体培养基的离心管中，置于37℃的恒温生化培养箱里培养24h。培养好的菌液浑浊，有白色沉淀。
b)罗伊氏粘液乳杆菌GF24对胃液和肠液的耐受性
配制模拟胃液：NaCl 2.0g/L，用HCl将pH值分别调至2.0、2.5、3.0和4.0，进行高压灭菌，胃蛋白酶3.2g/L，胃蛋白酶在实验时现加现用；
配制模拟肠液：磷酸二氢钾6.8g/L，用NaOH将pH值调至7.5，进行高压灭菌，胰蛋白酶10.0g/L，胰蛋白酶在实验时现加现用；
取甘油管保存的实施例1的罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌种以10％的接种量接种至MRS培养基中37℃活化24h；将等量的罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌液加入到体系50mL模拟胃液中，记录初始活菌，37℃恒温培养3h后测定活菌数。对检测的GF24进行统计，并计算存活率，菌株存活率＝试验组/对照组×100％。
当食物进入胃中时，胃酸即开始分泌。人体正常的胃分泌的胃酸浓度pH值约为2左右。胃在排空时pH值约在7.0 -7.2间，当食物进入胃中时，pH值迅速下降到2-3。饭后胃液稀释，pH上升至3.5左右。GF24胃酸耐受性数据如表2所示，pH2.0时，GF24存活率为37.23％；pH2.50时，GF24存活率为66.72％；在pH3.0时，GF24存活率为83.67％；在pH4.0时，GF24存活率为98.45％，在进食以后服用的GF24菌株能够耐受胃液，且在肠道中，罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌株能够耐受肠液。正常女性的阴道pH在3.8达到4.5之间，因此，罗伊氏粘液乳杆菌GF24能够在阴道中正常生长。
表2罗伊氏粘液乳杆菌GF24胃酸耐受性
c)罗伊氏粘液乳杆菌GF24对胆盐的耐受性
将罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌株按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃活化培养24小时，连续活化两次。将活化好的GF24菌液按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，于恒温培养箱中37℃静置培养15h。将培养好的菌液采用5000rpm离心10min收集菌体，并用无菌生理盐水将菌体震荡均匀。
按10％的添加量将震荡均匀的菌液加入到胆盐浓度分别为1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L和0.0g/L(初始菌液)的MRS培养基中，以胆盐浓度为0.0g/L为对照组。然后于37℃恒温培养箱中孵育3h。将孵育后的菌液取出，立即按照10倍稀释加入无菌生理盐水，拍打混匀后检测GF24；对检测的活菌进行统计，并计算存活率，计算公式如下：
菌株存活率(％)＝试验组/对照组×100％。
罗伊氏粘液乳杆菌GF24胆盐耐受性数据如表3所示：当胆盐浓度为1.0g/L和2.0g/L时，GF24菌株的存活率分别为98.35％和95.41％，但当胆盐浓度达到3.0g/L时，GF24菌株存活率仍达到93.58％。肠道内的胆盐浓度不超过3.0g/L，说明罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌株能够耐受肠道内的胆盐。
表3罗伊氏粘液乳杆菌GF24胆盐耐受性
综上所述，本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF24具有良好的胃酸和胆盐耐受性，可以通过胃肠道途径发挥其调节人体微生物菌群的作用。
实施例3
罗伊氏粘液乳杆菌GF24产溶菌酶测定
a)产溶菌酶初步测定
将罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌株按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃活化培养24小时。将活化好的GF24菌液按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，于恒温培养箱中37℃静置培养24h。离心取上清液(粗酶液)，粗酶液与蛋白酶K1:1体积混合，50℃反应10minn，然后测定10min前后的OD450变化，对照组只用蛋白酶K。
将GF24发酵上清液经蛋白酶K处理后，其OD450明显减小，结果参见表4。而对照组无变化。实验结果表明：罗伊氏粘液乳杆菌GF24主要抑菌成分为蛋白质成分的溶菌酶，而非抗生素或其他成分的溶菌酶。
表4溶菌酶酶活力的变化
b)罗伊氏粘液乳杆菌GF24粗酶液溶解金黄色葡萄球菌的曲线测定
罗伊氏粘液乳杆菌GF24在37℃、条件下发酵24h，离心取上清液(粗酶液)，分别将0.1mL粗酶液加入3.0mL pH 6.6的含活金黄色葡萄球菌与死金黄色葡萄球菌的磷酸缓冲液中，初始OD为0.785，60℃摇床振荡保温90分钟，每隔10分钟OD450变化。
罗伊氏粘液乳杆菌GF24粗酶液OD值下降情况，图4结果表明：在反应初期20min内，活金黄色葡萄球菌与死金黄色葡萄球菌(121℃灭菌20min)的OD450值快速下降，金黄色葡萄球菌不断被分解，20-40min后下降趋缓。40min后，活金黄色葡萄球菌OD450值仍然缓慢下降，而死金黄色葡萄球菌OD450值趋于稳定。因此，粗酶液不仅对活的金黄色葡萄球菌有明显抑制作用，对死的金黄色葡萄球菌也有明显抑制作用，这充分说明了罗伊氏粘液乳杆菌GF24发酵液中含有溶菌酶。
c)溶菌酶活力测定：
将罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌株按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃活化培养24小时，连续活化两次。将活化好的GF24菌液按5％的接种量接种到MRS液体培养基中，于恒温培养箱中37℃静置培养。每隔8h，取培养好的菌液采用离心取上清液得到粗酶液。将0.1mL罗伊氏粘液乳杆菌GF24粗酶液加入3.0mL pH 6.6的含金黄色葡萄球菌的磷酸缓冲液中，使上述混合体系的OD450在0.7～0.85之间，60℃摇床振荡保温10min，测定10min前后的OD450变化。每分钟使反应液浊度下降0.001个单位的酶量定义为一个酶活单位。
酶活(U/mL)＝(OD0min-OD10min)×1000/(10×0.1)(1)
测定32h之内发酵液酶活的变化，表5表明，罗伊氏粘液乳杆菌GF24培养8h酶活力达到23.57U/ml，随着发酵时间的延长产酶快速增加，24h达到63.16U/mL，后面随着时间的延长，酶活力呈现下降趋势。
表5罗伊氏粘液乳杆菌GF24酶活力测定
实施例4
罗伊氏粘液乳杆菌GF24产罗伊氏菌素测定
试验方法：在MRS培养基中另加入10-30g/L甘油，37℃恒温静置发酵培养，每隔2h取样测定罗伊氏菌素含量，28h后结束发酵培养。采用比色法定量罗伊氏菌素，取100μL样液加入75μL色氨酸溶液(用0.05mol/L HC1溶解色氨酸，配置终浓度为0.01mol/L色氨酸溶液)，再加入300μL浓HC1，37℃保温30min，于560nm波长处测定OD值。以0-0.7mmol/mL的丙烯醛溶液代替滤液得到标准曲线(Y＝2.0183x+0.0296，R2＝0.9977)，用于定量罗伊氏菌素。
实验结果如图5所示，罗伊氏粘液乳杆菌GF24发酵5h后就快速产生罗伊氏菌素，在发酵24h最高可达32mmol/L。
实施例5
罗伊氏粘液乳杆菌GF24对阴道炎常见致病菌及乳杆菌的抑菌能力试验
a)罗伊氏粘液乳杆菌GF24抑菌特性分析
采用双层琼脂扩散法抑菌实验：在无菌平板中倾倒10mL的水琼脂培养基，待冷却凝固后放上牛津杯，将指示菌菌悬液白色念珠菌ATCC10231、酿酒酵母ATCC9763、铜绿假单胞菌ATCC15442、大肠埃氏菌8099、金黄色葡萄球菌CMCC 26003、加德纳杆菌ATCC14018、阴沟肠杆菌ATCC23373和幽门螺旋杆菌26695分别加入到冷却至50℃的指示菌所对应生长的琼脂培养基中，使指示菌浓度为106CFU/mL，混匀，将其倒在底层水琼脂上面，待其凝固后，用镊子取出牛津杯，即形成孔洞，向每个孔中加入200μL的待测样品MRS培养基发酵液，扩散30min，37℃培养48h。观察培养孔周围是否出现抑菌圈并用游标卡尺测量其直径，记录抑菌圈直径，最终根据抑菌圈的有无及大小评价抑菌活性。
表6罗伊氏粘液乳杆菌GF24抑菌特性
阴道炎常见的致病菌有白色念珠菌、铜绿假单胞菌、大肠埃氏菌、金黄色葡萄球菌、加德纳杆菌和阴沟肠杆菌，结果如表6所示，罗伊氏粘液乳杆菌GF24对白色念珠菌、铜绿假单胞菌、大肠埃氏菌、金黄色葡萄球菌、加德纳杆菌和阴沟肠杆菌都有很好的抑制作用，另外，罗伊氏粘液乳杆菌GF24对酿酒酵母有抑制作用，说明：罗伊氏粘液乳杆菌GF24对病原微生物有较强的抑菌能力，可高效抑制阴道炎常见有害菌，对混合性阴道炎的防治有良好的防治效果。同时罗伊氏粘液乳杆菌GF24对幽门螺杆菌也有抑制作用，说明罗伊氏粘液乳杆菌GF24具有广谱的抑菌性。
b)罗伊氏粘液乳杆菌GF24最小抑菌浓度测定
采用共培养法，测定GF24对白色念珠菌ATCC10231、酿酒酵母ATCC9763、铜绿假单胞菌ATCC15442、大肠埃氏菌8099、金黄色葡萄球菌CMCC26003、加德纳杆菌ATCC14018、阴沟肠杆菌ATCC23373和幽门螺旋杆菌26695的最小抑菌浓度。
制备的病原菌菌悬液加入到500mL对应生长液体培养基中，吸取20mL的菌液于250mL无菌锥形瓶中，添加不同梯度的罗伊氏粘液乳杆菌GF24样液，再用无菌蒸馏水补充至40mL，置于28-37℃，200r/min恒温震荡培养箱培养48h，测定OD600值，以此判定抑菌表达能力。
生长率(％)＝[(OD实验组-OD实验组初始)/(OD对照组-OD对照组初始)]*100％(2)
以空白组OD600值的正1％偏差为生长完全抑制的判断理论依据，即生长率≤1％为生长完全抑制，取对应GF24添加量为最小抑菌浓度。
表7表明，罗伊氏粘液乳杆菌GF24对白色念珠菌最小抑菌浓度为2.75％、酿酒酵母最小抑菌浓度为3.0％、铜绿假单胞菌最小抑菌浓度为0.5％、大肠埃氏菌最小抑菌浓度为0.6％、金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度为1％、加德纳杆菌最小抑菌浓度为0.8％、阴沟肠杆菌的最小抑菌浓度1.0％、幽门螺杆菌的最小抑菌浓度为1.0％。因此，小剂量的罗伊氏粘液乳杆菌对致病菌抑菌具有较好的抑菌效果。
表7罗伊氏粘液乳杆菌GF24最小抑菌浓度测定
c)罗伊氏粘液乳杆菌GF24对乳杆菌的抑制作用
采用双层琼脂扩散法抑菌实验：在无菌平板中倾倒10mL的水琼脂培养基，待冷却凝固后放上牛津杯，将指示菌菌悬液惰性乳杆菌、加氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、唾液联合乳杆菌、植物乳植杆菌和鼠李糖乳酪杆菌分别加入到冷却至50℃的指示菌所对应生长的琼脂培养基中，使指示菌浓度为106CFU/mL，混匀，将其倒在底层水琼脂上面，待其凝固后，用镊子取出牛津杯，即形成孔洞，向每个孔中加入200μL的待测样品MRS培养基发酵液，扩散30min，37℃厌氧培养48h。观察培养孔周围是否出现抑菌圈并用游标卡尺测量其直径，记录抑菌圈直径，最终根据抑菌圈的有无及大小评价抑菌活性。
双层琼脂扩散法试验结果(图7)表明：惰性乳杆菌、加氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、唾液联合乳杆菌、植物乳植杆菌和鼠李糖乳酪杆菌平板都没有抑菌圈，因此，罗伊氏粘液乳杆菌GF24对阴道中常见乳杆菌没有抑制作用。
综上所述，本发明的罗伊氏粘液乳杆菌GF24具有产酸快，可分泌溶菌酶和罗伊氏菌素；且对白色念珠菌、酿酒酵母、铜绿假单胞菌、大肠埃氏菌、金黄色葡萄球菌、加德纳杆菌、阴沟肠杆菌等阴道炎致病菌均有显著的抑制作用，而对阴道中常见的乳杆菌无抑制作用，进而实现对阴道炎尤其是混合性阴道炎的有效防治。
实施例6
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌粉，为罗伊氏粘液乳杆菌GF24在MRS培养基上，37℃恒温培养箱中静置培养24h后得到的发酵液离心分离，再冷冻干燥得到的菌体冻干粉，即为罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌粉，其中罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌数为2*1010CFU/g。
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌粉在用于制备防治混合性阴道炎药物的应用。
具体为：
一种含罗伊氏粘液乳杆菌GF24的固体饮料，采用本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌粉与药物载体按重量比1:3混合，得到含罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌数为5*109CFU/g，2g/条的固体饮料。
一种用于预防和/或治疗阴道炎的药物，采用本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌粉与药物载体按重量比1:9混合，得到含罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌数为2*109CFU/g，0.25g/颗的胶囊。罗伊氏粘液乳杆菌GF24人群对照实验
a)人群对照实验方法
选取10位具有混合性阴道感染症状的志愿者(18-50岁，知情同意)，将志愿者分为对照组和干预组两组，每组5例。对照组(5例)：早晚服用麦芽糊精固体饮料各1条(2g)，同时每晚1次阴道使用安慰剂淀粉胶囊(0.25g)。干预组(5例)：使用本实施例的含罗伊氏粘液乳杆菌GF24的固体饮料，每天早晚服用罗伊氏粘液乳杆菌GF24固体饮料各1条(含罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌1*1010CFU/条，2g)，同时每晚1次阴道使用本实施例中含罗伊氏粘液乳杆菌的药物(胶囊：0.25g，含罗伊氏粘液乳杆菌GF24 2*109CFU/g)，共14d。
所有患者干预前和干预后均进行过以下检查：
(1)用长棉签从阴道侧壁上1/3处取得阴道分泌物；
(2)使用精密pH试纸测定分泌物pH；
(3)分泌物涂片后使用革兰染色法染色，于显微镜下进行阴道菌群、真菌的检测；
(4)症状体征评分。
症状体征评分标准为：
临床症状(外阴瘙痒、分泌物增多、局部烧灼感、阴道壁散在出血点改善)消失，胺试验结果转阴，经涂片检测显示无线索细胞，且阴道pH值<4.5评为治愈；
临床症状显著缓解，胺试验结果转阴，经涂片检测显示线索细胞有所减少，且阴道pH值<4.5评为显效；
临床症状有所缓解，胺试验结果未转阴，经涂片检测显示线索细胞有所减少，且阴道pH值<4.5评为有效；
临床症状无缓解或加重，胺试验结果未转阴，经涂片检测显示线索细胞未减少甚至增多，阴道pH值≥4.5为无效。
总有效率＝(治愈+显效+有效)例数/总例数×100％。
真菌及细菌学检测：真菌及细菌镜检阴性为痊愈，真菌及细菌镜检阳性为未愈。阴道菌群变化：优势菌为革兰氏阳性大杆菌，形态类似乳杆菌者为痊愈；优势菌为非革兰氏阳性大杆菌者为未愈。总体疗效评价：全部病原体指标恢复正常为痊愈，任何一项病原体指标未恢复正常为未愈。
b)疗效分析
实验结果见表8，干预组与对照组比较p<0.05，有统计学意义，干预组总有效率是对照组4倍，其中干预组有2例完全治愈。
表8两组患者疗效比较[n(％)]
两组患者阴道pH值及乳杆菌的变化见表9,两组患者治疗前后阴道pH值差异无统计学意义(均P＞0.05)。治疗后干预组pH显著下降(P<0.05)。治疗前，两组患者阴道菌群均为非革兰氏阳性大杆菌、白色念珠菌。治疗干预后，对照有20.0％的患者阴道优势菌恢复为形态类似乳杆菌的革兰氏阳性大杆菌，干预组有80.0％的患者恢复为形态类似乳杆菌的革兰氏阳性大杆菌，差异有统计学意义(P<0.05)。
表9两组患者pH值及乳杆菌变化情况
综上所述，通过人群实验表明，使用罗伊氏粘液乳杆菌GF24可以显著性提高混合性阴道炎的疗效，同时临床症状外阴瘙痒、分泌物增多、局部烧灼感、阴道壁散在出血点改善消失或显著减少，罗伊氏粘液乳杆菌GF24显著降低了阴道pH，在体内抑制了非革兰氏阳性大杆菌和白色念珠菌，乳杆菌也显著恢复。
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌粉在制备用于预防或治疗混合性阴道炎的药物中的应用，其用量为4*109～5*1010CFU/day。
实施例7
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF24组合物，为罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌粉，为罗伊氏粘液乳杆菌GF24在MRS培养基上，37℃恒温培养箱中静置培养24h，离心分离得到的发酵液，其中罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌数为5*1010CFU/g，将发酵液冷冻干燥或喷雾干燥成罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌粉。
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌粉在用于制备防治性阴道炎药物的应用，其中，用于治疗混合性阴道炎时，罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌粉的推荐用量为1*1010CFU/day；用于治疗细菌性阴道炎时，罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌粉的推荐用量为3*109CFU/day；用于治疗假丝酵母阴道炎或念珠菌性阴道炎时，罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌粉的推荐用量为6*109CFU/day。
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF24组合物作为发酵剂在泡菜、酸菜等发酵食品中的应用，其用量为2*107CFU/kg发酵食品。
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF24组合物在制备用于调节肠道菌群的生物制剂中的应用，其用量为2*109～3*1010CFU/day。
实施例8
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF24组合物，为罗伊氏粘液乳杆菌GF24代谢产物固体粉末，为罗伊氏粘液乳杆菌GF24在MRS培养基上，37℃恒温培养箱中静置培养24h，离心分离得到的发酵液上清液，然后冷冻干燥或喷雾干燥成罗伊氏粘液乳杆菌GF24代谢产物固体粉末。
一种含本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF24组合物的固体饮料，包括分别称取罗伊氏粘液乳杆菌GF24代谢产物固体粉末30重量份、麦芽糊精12重量份、山梨糖醇11重量份、低聚半乳糖8重量份、玉米肽10重量份、鹅肌肽1重量份、大豆肽5重量份、低聚木糖4重量份、西兰花种子水提物4重量份、富硒酵母3重量份、三氯蔗糖2重量份、苹果酸2重量份、谷胱甘肽2重量份、维生素E 2重量份、维生素C 2重量份、叶酸2重量份。
该组合物的原料先过40目筛网后，按配比混合均匀，使用螺杆背封包装机装袋，制备成2g/袋具有调节肠道菌群的固体饮料。
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF24组合物在制备预防或治疗阴道炎的药物中的应用，用量为100～1000mg/day。
实施例9
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF24组合物，为罗伊氏粘液乳杆菌GF24后生元，所述罗伊氏粘液乳杆菌GF24后生元为罗伊氏粘液乳杆菌GF24在MRS培养基上，37℃恒温培养箱中静置培养24h后，通过细胞裂解、灭活、浓缩、喷雾干燥含有罗伊氏粘液乳杆菌GF24及其代谢产物的固体粉末，其中罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌体数为5*1010个/g。
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌GF24组合物在制备预防或治疗混合性阴道炎的药物中的应用，用量为5.0*109～1*1011个/day。
实施例10
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌组合物，为重量比为1:1的罗伊氏粘液乳杆菌GF24后生元和罗伊氏粘液乳杆菌GF24灭活菌体的组合物，所述罗伊氏粘液乳杆菌GF24灭活菌体为罗伊氏粘液乳杆菌GF24在MRS培养基发酵培养结束后得到的发酵液，发酵液离心得到的沉淀经过重悬、细胞裂解、高温灭活(121℃，30min)、离心、浓缩、喷雾干燥得到，其中罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌体数为6*1010个/g；所述罗伊氏粘液乳杆菌GF24后生元为罗伊氏粘液乳杆菌GF24在MRS培养基上，37℃恒温培养箱中静置培养24h后，通过细胞裂解、灭活、浓缩、喷雾干燥含有罗伊氏粘液乳杆菌GF24
及其代谢产物的固体粉末，其中罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌体数为4*1010个/g。
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌组合物在制备用于预防或治疗阴道炎的药物中的应用，其用量为3*1010个/day。
实施例11
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌组合物，为按重量比为2:1的罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌粉和罗伊氏粘液乳杆菌GF24后生元的组合物，其中罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌粉同实施例6所述方法制备，活菌含量为4*109CFU/g，罗伊氏粘液乳杆菌GF24后生元如实施例9所述方法制备，其中，细胞数为5*1010个/g。
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌组合物在制备用于调节肠道菌群的药物中的应用，其用量0.5～1g/day。
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌在制备用于预防或治疗阴道炎的药物中的应用，其用量0.4～3g/day。
实施例12
本实施例的一种用于预防和/或治疗阴道炎的药物，为按重量比为2:1的罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌粉和罗伊氏粘液乳杆菌GF24代谢产物，其中罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌粉同实施例6所述方法制备，活菌含量为5*109CFU/g，所述罗伊氏粘液乳杆菌GF24代谢产物为罗伊氏粘液乳杆菌GF24在MRS培养基中37℃发酵培养24h后，发酵液通过离心得到的离心上清液经高温灭活(121℃、30min)、浓缩、喷雾干燥制备而成。
本实施例的用于预防和/或治疗阴道炎的药物，用于预防或治疗混合性阴道炎，推荐用量为0.3～3g/day。
实施例13
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌，包括罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌粉，所述罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌粉为罗伊氏粘液乳杆菌GF24在MRS培养基中37℃发酵培养20h获得的发酵液经离心后干燥所得的菌体冻干粉或喷干粉，含5*1010CFU/g活菌。
本实施例的罗伊氏粘液乳杆菌在制备用于调节肠道菌群的生物制剂中的应用，其中生物制剂为粉剂，所述粉剂的制备方法如下：按重量份计，包括罗伊氏粘液乳杆菌GF24(5.0*1010CFU/g)20重量份、麦芽糊精20重量份、山梨糖醇11重量份、低聚半乳糖13重量份、玉米肽10重量份、鹅肌肽1重量份、大豆肽5重量份、低聚木糖4重量份、西兰花种子水提物4重量份、富硒酵母3重量份、三氯蔗糖2重量份、苹果酸2重量份、谷胱甘肽2重量份、维生素E1重量份、维生素C1重量份、叶酸1重量份。
该组合物的原料先过40目筛网后，按配比混合均匀，使用螺杆背封包装机装袋，制备成2g/袋具有调节肠道菌群功效的固体粉剂。
实施例14
本实施例的一种用于预防或治疗阴道炎的药物，为按重量比为2:1的罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌粉和罗伊氏粘液乳杆菌GF24代谢产物，其中罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌粉同实施例6所述方法制备，活菌含量为3*1010CFU/g，所述罗伊氏粘液乳杆菌GF24代谢产物为罗伊氏粘液乳杆菌GF24在MRS培养基中37℃发酵培养24h后，发酵液通过离心得到的离心上清液经高温灭活(121℃、30min)、浓缩、喷雾干燥制备而成。
本实施例的用于预防或治疗阴道炎的药物，用于预防或治疗细菌性阴道炎，念珠菌阴道炎及混合性阴道炎，尤其是用于治疗混合性阴道炎，其推荐用量为0.2～3g/day，具有良好的疗效。
实施例15
本实施例的用于预防或治疗混合性阴道炎的药物，包括罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌粉，所述罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌粉为罗伊氏粘液乳杆菌GF24在MRS培养基中37℃发酵培养20h获得的发酵液经离心后干燥所得的菌体冻干粉或喷干粉，含4*1010CFU/g活菌。
所述药物为胶囊剂型，所述胶囊剂的制备方法如下：按重量份计，包括罗伊氏粘液乳杆菌GF24(4.0*1010CFU/g)40重量份、淀粉40重量份、葡萄糖5重量份，羟丙基甲基纤维素5重量份，乳糖醇5重量份，硬脂酸镁5重量份。
该组合物的原料先过40目筛网后，按配比混合均匀后装入胶囊或包装成粉剂，包装即得。
本发明的罗伊氏粘液乳杆菌在制备阴道炎的药物中的应用，可以根据阴道炎的种类(如细菌性阴道炎、念珠菌性阴道炎、混合性阴道炎)以及初始症状的严重程度调整相应组合物的成分及用量，如实施例7中罗伊氏粘液乳杆菌GF24菌粉在制备用于念珠菌阴道炎或细菌性阴道炎的药物中的应用，其用量还可以为2.0*1010CFU/day，实施例8中罗伊氏粘液乳杆菌GF24代谢产物作为组合物在制备预防或治疗细菌性阴道炎或假丝酵母阴道炎中的应用，其用量还可以为8～12g/day，实施例9中罗伊氏粘液乳杆菌GF24后生元作为组合物在制备预防或治疗细菌性阴道炎中的应用，其用量还可以为4*1010个/day，以上技术特征的改变，本领域的技术人员通过文字描述可以理解并实施，故不再另作附图加以说明。
Claims (10)
1.一株罗伊氏粘液乳杆菌，其特征在于，所述罗伊氏粘液乳杆菌GF24(Limosilactobacillus reuteri GF24)于2023年8月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20231529。
2.如权利要求1所述罗伊氏粘液乳杆菌，其特征在于，所述罗伊氏粘液乳杆菌GF24的16SrRNA鉴定序列如SEQ ID NO:1所示，所述罗伊氏粘液乳杆菌GF24通过分泌溶菌酶和罗伊氏菌素，并抑制致病菌，通过调节阴道微生物菌群而预防和/或治疗阴道炎。
3.一种含罗伊氏粘液乳杆菌的发酵组合物，其特征在于，所述发酵组合物通过使用权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌GF24发酵生产制得。
4.如权利要求3所述的一种含罗伊氏粘液乳杆菌的发酵组合物，其特征在于，所述发酵组合物包括如权利要求1所述罗伊氏粘液乳杆菌GF24活菌、罗伊氏粘液乳杆菌GF24灭活菌体、代谢产物和罗伊氏粘液乳杆菌GF24后生元中的一种或多种。
5.如权利要求1所述罗伊氏粘液乳杆菌在制备用于制备调节肠道菌群的生物制剂或功能性食品或药物中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述调节肠道菌群至少包括以下一种：
a)分泌罗伊氏菌素；
b)分泌溶菌酶；
c)调节肠道pH，促进肠道有益菌群的生长。
7.如权利要求1所述罗伊氏粘液乳杆菌GF24作为发酵剂在发酵食品中的应用。
8.如权利要求1所述罗伊氏粘液乳杆菌和/或如权利要求3或4所述含罗伊氏粘液乳杆菌的发酵组合物在制备用于预防和/或治疗阴道炎的药物中的应用。
9.一种用于预防和/或治疗阴道炎的药物，其特征在于，所述药物包含如权利要求1所述的罗伊氏粘液乳杆菌GF24和/或如权利要求3或4所述发酵组合物。
10.如权利要求9所述的用于预防和/或治疗阴道炎的药物，其特征在于，所述药物包括如下至少一种作用：
a)高效抑制白色念珠菌、酿酒酵母、铜绿假单胞菌、大肠埃氏菌、金黄色葡萄球菌、加德纳杆菌和阴沟肠杆菌；
b)对常见阴道乳杆菌无抑制作用；
c)分泌溶菌酶；
d)分泌罗伊氏菌素；
e)合成有机酸，降低阴道pH。
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