CN117286078B - 一种改善胃肠道健康的植物乳植杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物领域，具体公开了一种改善胃肠道健康的植物乳植杆菌及其应用。所述植物乳植物杆菌不具有毒力因子、不溶血，安全性良好，能耐人工胃液、肠液，抗氧化能力优于鼠李糖乳杆菌LGG，改善腹泻的效果显著。

Description

一种改善胃肠道健康的植物乳植杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种改善胃肠道健康的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）Lplan-1及其应用。
背景技术
肠道和人类的健康息息相关。它是人体重要的消化吸收场所，营养物质在这里被吸收运往全身，并排出身体代谢产生的毒素和垃圾。肠道也是人体最大的免疫器官，肠道的淋巴组织中分布着人体大部分的免疫细胞，抵抗着外来入侵的细菌和病毒。据世界卫生组织统计，肠胃疾病对人类的威胁触目惊心：全球每年死于肠胃疾病的人数在1000万以上，中国有1/5的人口患有肠胃疾病，居世界首位。
人类的胃肠内有数万亿个微生物，包括细菌、真菌和病毒。它们大多分布在大肠中，数量大致与全身的细胞数相当。在人体肠道细菌中，有10%到20%的细菌是与他人相同的。微生物群影响着人的健康和食欲、体重和心情。近年来，大量益生菌被发现对肠道健康具有好处，它们被用来预防或治疗炎性肠道疾病，如克罗恩病和溃疡性结肠炎，以及肠道易激综合症等。
多种肠道疾病都表现出炎性症状、粘膜层受损、腹泻或便秘，并以腹泻更为多见。放化疗引起的肠损伤是肠道损伤中较为严重的类型，其中化疗药物引起的腹泻（也称化疗相关性腹泻，CID）对患者影响较大，轻则影响患者生活质量，重则导致肿瘤治疗方案中断，更严重的还会导致患者脱水、感染、休克甚至死亡。化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)和伊立替康（Irinotecan , CPT-11）引起的腹泻发生率最高，可达80%。
益生菌维护胃肠道健康已经有较长的使用历史，其优点在于安全性较高。但是效果显著的菌株并不多，能达到化药或生物药等效的更是少之又少。Joanne M Bowen等人（Cancer biology & therapy, 2007, 6(9): 1445-1450）在伊立替康介导的大鼠腹泻模型中证实了含有8株菌的VSL#3可以有效预防伊立替康化疗后的严重腹泻；Bruna Savassi等人（Frontiers in pharmacology, 2021, 12: 755871）的研究发现干酪乳杆菌BL23、植物乳杆菌B7 和鼠李糖乳杆菌B1共生制剂可减轻化疗引起的粘膜炎，但未证明能改善相关腹泻；应用广泛的明星菌株LGG可降低与5-FU化疗相关的严重腹泻和腹部不适（British journal of cancer, 2007, 97(8): 1028-1034）。
针对植物乳植杆菌单菌株的相关报导则较少。Nina Dias Coelho-Rocha等人（Probiotics and Antimicrobial Proteins, 2023, 15(1): 160-174）研究了多株植物乳植杆菌，发现对改善5-FU诱导的小鼠肠道粘膜炎有较好作用，但未显示能改善腹泻症状。Wei Liang等人（Probiotics and Antimicrobial Proteins, 2023）报道了植物乳植杆菌通过抑制小鼠肠道炎症、调节肠道菌群从而缓解抗生素相关性腹泻（AAD）； MinAh Jung等人（Nutrients, 14(2):389，2022）报道了植物乳植杆菌的摄入能够改善患者功能性腹泻症状；Kyoungmi Jung等人（Nutrients, 14(10):2015，2022）研究显示经摄入4周植物乳植杆菌能够显著改善肠易激综合征腹泻患者肠道不适症状。但尚未有研究报道过植物乳植杆菌单菌株对损伤程度较高的化疗相关性腹泻是否具有治疗和/或预防效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够改善受试者肠道不适症状，特别是腹泻症状的益生菌解决方案。
本发明首先提供了一种植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株，所述菌株选自保藏号为CCTCC NO: M 2023354的植物乳植杆菌Lplan-1或毒性、免疫原性与生物活性相对于保藏号为CCTCC NO: M 2023354的植物乳植杆菌Lplan-1菌株没有实质变化的传代菌株。
在一些具体实施方式中，所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，并且所述植物乳植物杆菌含有编码序列如SEQ ID NO.2所示的产CAT相关酶的基因。
其次，本发明还提供了前述植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株的培养方法，所述方法包括将所述植物乳植杆菌菌株接种至培养基，进行增殖培养，得到增殖的植物乳植杆菌菌株。
在一些具体实施方式中，所述培养基每1 L蒸馏水含有BHI肉汤粉末15-20 g，MRS肉汤粉末10-15 g，改良 GAM肉汤粉末12-17 g。
再次，本发明还提供了一种组合物，其活性成分含前述的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株，或含有前述的培养方法得到的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株。
在一些具体实施方式中，所述植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株作为唯一活性成分。
最后，本发明还提供了前述植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）或前述组合物在制备微生物制剂中的应用，所述微生物制剂用于改善受试者的肠道健康状况，或治疗和/或预防腹泻和/或抑制肠道病原菌的繁殖。
在一些具体实施方式中，所述腹泻是化疗相关性腹泻。
在一些具体实施方式中，所述化疗相关性腹泻是活性成分选自如下一种或多种的药物引起的腹泻：5-氟尿嘧啶、替加氟、5'-2'-脱氧尿苷、卡培他滨、替吉奥、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、卡莫司汀、伊立替康。
在一些具体实施方式中，所述肠道病原菌选自以下任意一种或其组合：铜绿假单胞菌、志贺氏菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和艰难梭菌。
本发明的植物乳植杆菌具有如下特点：
1、无毒力因子、不溶血，具有良好的安全性；
2、具有与鼠李糖乳杆菌LGG相当的抗氧化能力，耐受人工胃肠液，对多种致病菌具有抑制作用，能改善肠道屏障，抑制促炎因子的表达，增加水通道蛋白的表达以促进肠道水分重吸收；
3、治疗CID的效果与化药相当甚至更优。
本发明的菌株保藏信息如下：
菌株名称：植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）Lplan-1
保藏日期：2023年3月17日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心（China Center for Type CultureCollection，CCTCC），地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052
保藏编号：CCTCC NO: M 2023354。
附图说明
图 1 为实施例1植物乳植杆菌Lplan-1菌落形态正面照片。
图 2 为实施例5植物乳植杆菌Lplan-1抗氧化实验结果图。
图 3 为实施例6植物乳植杆菌Lplan-1耐人工胃肠液结果图，a是耐人工胃液实验的活菌数，b是耐人工肠液实验的活菌数。
图 4 为实施例7植物乳植杆菌Lplan-1抑菌实验结果图。
图 5 是实施例8植物乳植杆菌Lplan-1对屏障修复试验结果。
图 6 是实施例9植物乳植杆菌Lplan-1抑制细胞炎症IL-6表达的试验结果。
图 7是实施例10植物乳植杆菌Lplan-1对5-氟尿嘧啶致腹泻小鼠的治疗效果图；A. 各组D8腹泻评分图；B. 各组腹泻总分图；C.与对照菌株腹泻总分对比图。
图8 为实施例11各组5-氟尿嘧啶致腹泻小鼠的结肠炎性因子和水通道蛋白基因相对表达量结果图；A. TNF-α mRNA相对表达量；B. AQP8 mRNA相对表达量。
具体实施方式
定义与说明
针对本发明所请求保护的菌株（微生物保藏号为CCTCC NO: M 2023354的植物乳植杆菌菌株，Lplan-1株），Lplan-1株的没有突变的基因组完全相同的、或传代中积累微小突变的，但毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化的传代菌株应当视为经过微生物保藏的Lplan-1株。并且所述菌株包括活菌和灭活形式，完整的菌体或其裂解液或其发酵产物。
Lplan-1株经传代应用不可避免引入微小突变，毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化的传代菌株或突变菌株应当属于本发明的贡献范围。毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化，包括担不限于，在检测灵敏度、检测限等检测技术的局限性和可接受或不可避免误差的范围内视为毒性、免疫原性与生物活性是相同的。
经常需要用动物测定Lplan-1株后代的毒性、免疫原性与生物活性，由于动物品种、年龄、性别、健康状况等体现的差别以及可预期或不可避免的系统误差属于没有实质性变化，属于毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化的传代菌株。
Lplan-1株传代多次后不可避免引入微小的突变，当突变发生在非编码序列区或者编码区的同义突变或者不影响菌株毒性、免疫原性与生物活性的突变（比如，可能是两个结构域之间的连接氨基酸残基，或者位于蛋白质高级结构内部因不与免疫细胞接触而不影响毒性、免疫原性与生物活性的微小突变的残基），可以合理预期的是当这些微小变化没有明显影响后代毒株的毒性、免疫原性与生物活性的情况下，仍然在本发明的实质技术贡献范围内，这些微小的突变仍属于非实质性突变，应当视为毒性、免疫原性与生物活性没有变化的突变菌株。
本发明Lplan-1株的培养基培养传代菌株，可合理预期的是，与其他细菌一样，不可避免引入微小突变，当其毒性、免疫原性与生物活性没有实质性变化时，属于毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化的传代菌株或突变菌株。
Lplan-1株来自人粪便，必然在不同人体中或环境中有可能在本发明申请日以后分离到并鉴定的与Lplan-1株具有共同祖先且与其他已知植物乳植杆菌菌株存在明显生理遗传差别的同源菌株，它们基因组与Lplan-1株可能完全相同，也可能有微小的差别。
当这些同源菌株与Lplan-1株的差别程度相当于毒性、免疫原性与生物活性没有实质变化的传代菌株或突变菌株与Lplan-1株的差别程度时，这些同源菌株与Lplan-1株相同或视为毒性、免疫原性与生物活性没有差别，这些同源菌株属于与Lplan-1株实质相同的菌株。
本发明所述的植物乳植杆菌Lplan-1具有如下生化鉴别特征，这些特征可以辅助用于鉴别本发明的菌株：
1、在无氧三混液体培养基（BHI+MRS+改良GAM）上的菌落形态为白色不透明状圆形、中间凸起、表面光滑湿润；
2、基因组无毒力基因；
3、体外不溶血（即γ溶血）；
4、对青霉素、氨苄西林、亚胺培南、红霉素中的至少两种抗生素敏感；
5、耐受人工胃肠液。
本发明所述的植物乳植杆菌Lplan-1还具有如下功能鉴别特征可以辅助用于鉴别本发明的菌株：
1、具有抗氧化能力；
2、具有体外屏障修复功能；
3、具有体外抗炎作用；
4、能预防、改善、减轻或缓解化疗相关性腹泻；
5、能抑制促炎因子TNF-α的表达；
6、能增加水通道蛋白AQP8的表达；
7、对铜绿假单胞菌、志贺氏菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和艰难梭菌中具有抑菌活性。
本发明所述的组合物含有活性成分植物乳植杆菌Lplan-1，以及其他成分，比如不具有生理功效的辅料成分，或者其他功效性成分。功效性成分包括但不限于其他功效菌株，或具有营养、膳食补充作用的营养成分、膳食纤维、益生元成分、后生元成分等。
植物乳植杆菌Lplan-1具有抑制病原菌、抗氧化和抗炎功效，还能增加肠组织水通道蛋白AQP8的表达，因而本发明的植物乳植杆菌Lplan-1或含该菌株的组合物可以用于制备食品或保健品，用以改善受试者的肠道健康状况。植物乳植杆菌Lplan-1还能改善受试者腹泻症状，特别是对化疗药物引起的严重损伤和腹泻发挥作用，因而本发明的植物乳植杆菌Lplan-1或含该菌株的组合物可以用于制备药品，用以预防/治疗普通腹泻或化疗相关性腹泻。
本发明所述的组合物可以制备成任一种便于使用的形式，例如临床或食品中常见的粉剂、片剂、颗粒剂、凝胶剂、胶囊或液体剂。
本发明所述的组合物以能发挥功效的含量（治疗有效量）和频率给予使用对象，推荐单次使用剂量中含有102~1015 CFU、104~1013 CFU或105~1012 CFU的植物乳植杆菌Lplan-1。
本发明所述腹泻是指排便次数明显超过平时习惯（>3次/d），粪质稀薄，含水量增加（>85%），大便可伴有黏液、脓血或未消化的食物的一种临床症状。
本发明中的特定温度参数，如无特殊说明，应理解为恒温处理，并允许在一定温度区间内存在变动。如在±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
辅料成分包括药物载体和赋型剂。药物载体是指不对受试者引起显著刺激且不消除所施用的益生菌的生物活性及特性的药学载体。药学上可接受的载体可增强或稳定组合物，或可用于促进组合物的制备。药学上可接受的载体可包括溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂、等渗剂、吸收延迟剂、盐、药物稳定剂、结合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等及其组合，正如本领域技术人员已知的（参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版MackPrinting Company,1990,第1289-1329页）。除非常规载体与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗性或药物组合物中。载体可经选择以使受试者的不利副作用降至最低和/或使活性成分的失活降至最低。
赋型剂是指添加至药物组合物中以使药物具有一定形状或一定浓度的物质。例如无菌水、生理盐水、聚亚烷基二醇（诸如聚乙二醇）、植物油或氢化萘、碳酸氢钙、磷酸钙、多种糖、各种类型淀粉、纤维素衍生物、明胶等。
下面将结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，均应属于本发明保护的范围。
以下实施例中所用到的材料的配制方法或商业渠道如下。
YCFA液体培养基的配制：称取酪蛋白10.0 g，酵母提取物2.5 g，MgSO4·7H2O 0.45mL（10%的母液），10 mg/mL的CaCl2 溶液0.45 mL，TE141 10 mL，K2HPO4 0.45 g，KH2PO4 0.45g，NaCl 0.90 g，溶解于适量的蒸馏水中，加热煮沸后停止加热。培养基冷却过程中，先分批次向3.2 mL的VFA-mix中添加NaOH调节pH至中性，待培养基冷却至室温后添加到培养基中，随后添加一水合半胱氨酸盐酸盐0.5 g，0.1% 刃天青1 mL搅拌均匀，NaOH调节pH至中性二次加热煮沸后，维持微沸状态20 min左右停止加热，N2置换降温并分装，121 ℃高温湿热灭菌30 min，阴凉、干燥处存放，备用。
TE141的配制：称取次氮基三乙酸1.50 g加入到200 mL纯水中，加入适量NaOH至溶液变澄清，之后加水800 mL，用50% HCl调节pH值至5.5，之后依次称取MgSO4·7H2O 3.00 g，MnSO4·H2O 0.50 g，NaCl 1.00 g，FeSO4·7H2O 0.10 g，CoSO4·7H2O 0.18 g，CaCl2·2H2O0.10 g，ZnSO4·7H2O 0.18 g，CuSO4·5H2O 0.006 g，KAl(SO4)2·12H2O 0.02 g，H3BO3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01 g，NiCl2·6H2O 0.03 g，10 mg/mL的Na2SeO3·5H2O溶液 0.03 mL，10mg/mL的Na2WO4·2H2O溶液 0.03 mL加入上述试液中，加入过程中不断搅拌，保持溶液澄清，备用。
VFA-mix的配制：量取乙酸90 mL，丙酸30 mL，正戊酸10 mL，异丁酸10 mL，丁酸10mL混匀备用，使用前用5 M 浓度 NaOH溶液调至pH为中性。
三混液体培养基（BHI+MRS+改良GAM）的配制：称取BHI肉汤粉末（青岛海博生物技术有限公司，HB8297-5）19.25 g，MRS肉汤粉末（广东环凯生物科技有限公司，027312）13.5g，改良 GAM肉汤粉末（青岛海博生物技术有限公司，HB8518-3）15 g，溶解于1 L的蒸馏水中，N2置换除氧并分装，121℃高温湿热灭菌30 min，阴凉、干燥处存放。
三混固体培养基（BHI+MRS+改良GAM）的配制：在三混液体培养基的基础上，加入琼脂粉12 g，其他步骤相同。
人工胃液的配制：取10%（v/v）稀盐酸16.4 mL，定容至1 L。称取胃蛋白酶（上海源叶生物科技有限公司，S10028）10 g，溶解混匀后调节pH至3.0。手套箱内0.22 μm滤器除菌，备用。4℃保存不超过30天。
人工肠液的配制：称取牛胆盐（上海源叶生物科技公司，G8310）0.08 g，溶解于100mL人工肠液（上海源叶生物科技有限公司，R24022，含胰酶10 g/L）中，配制成胆盐浓度为0.08%的人工肠液。持续通N2 1 h。手套箱内0.22 μm滤器除菌，备用。4℃保存不超过30 d。
无氧无刃天青PBS的配制：称取磷酸二氢钾0.27 g，磷酸氢二钠1.42 g，氯化钠8g，氯化钾0.2 g，溶解于1 L的蒸馏水中，加热煮沸，冷却至室温加入0.55 g半胱氨酸盐酸盐，搅拌溶解后调节pH至6.5，装上定量分液器并通N2，加热至沸腾，在微沸状态下保持30min，冷却后分装为400 mL/瓶，121℃高温湿热灭菌30 min，荫凉、干燥处存放，备用。
MRS固体培养基、GAM固体培养基、TSB（胰蛋白胨大豆肉汤，青岛海博生物技术有限公司，HB4114）、TSA（胰蛋白胨大豆琼脂，青岛海博生物技术有限公司，HB4138）、布氏肉汤（青岛海博生物技术有限公司，HB0241）培养基的配制均按照说明书进行称量溶解，121℃高温湿热灭菌30 min，阴凉、干燥处存放。
二混培养基（BHI+MRS）的配制：称取BHI肉汤粉末19.25 g，MRS肉汤粉末27.0 g，一水合半胱氨酸盐酸盐（峨眉山市龙腾生物科技有限公司）0.5 g，溶解于1 L的蒸馏水中，进行除氧分装，121℃高温湿热灭菌15 min，阴凉、干燥处存放。
菌粉制备培养基配制：称取无水葡萄糖20 g，大豆蛋白胨 40 g，磷酸二氢钾5 g，磷酸氢二钠5 g，硫酸镁0.3 g，硫酸锰0.2 g，聚山梨酯80 1g，一水合半胱氨酸盐酸盐0.5g，溶解于1 L的蒸馏水中，N2置换除氧，分装，121 ℃灭菌20 min。阴凉、干燥处存放。
实施例1 菌株的分离与鉴定
（1）采集健康志愿者的新鲜粪便样本，加入适量无氧PBS重悬，震荡，以样本完全充分重悬为宜。在N2保护下，经纱布过滤两次后，将滤液分装至50 mL离心管中，10000 rpm离心20 min弃去上清液。加入适量无氧PBS重悬菌体，再加入等体积的50%的无氧甘油充分混匀，分装至2 mL螺帽管中，每支0.5 mL。分装后套袋抽真空，于-80℃冰箱保存备用。
（2）分离时取1支冻存的样本管，传入厌氧手套箱，取0.5 mL菌悬液于4.5 mL厌氧PBS中振荡混匀，梯度稀释至10-6，取适当梯度菌液与YCFA培养基混匀后分装到384孔板中，37℃厌氧培养一周。挑取已生长孔位菌液进行转接，培养48 h后，一份利用MALDI-TOF-MS检测，初步对分离菌株进行分类，另一份根据质谱结果，再次转接到96孔板中，一式两份，培养48 h后一个板进行16S rDNA基因扩增并送至北京擎科生物科技有限公司成都分公司测序，另一板按1：1加入50%的甘油混合均匀临时保藏，待PCR结果确认后使用。
（3）对16S rDNA基因测序结果进行分析，将序列与NCBI Nucleotide数据库做比对。结果显示与一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）的序列相似度最高（> 99%），由此初步鉴定所分离菌株为植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum），命名为植物乳植杆菌Lplan-1。采用无氧三混培养基（BHI+MRS+改良GAM）培养后，其菌落形态呈白色不透明状圆形菌落，中间凸起、表面光滑湿润，正面照片见图1。
为了说明植物乳植杆菌Lplan-1的独有特性，本发明还提供了采用相同方法分离到的另2株植物乳植杆菌Lplan-2和Lplan-3在部分试验中做对照说明。
实施例2 全基因组分析与保藏
按2%接种量将植物乳植杆菌 Lplan-1接种至5 mL无氧三混液体培养基中，培养至对数生长后期，提取菌株全基因组DNA，利用Illumina高通量测序平台NovaSeq 6000进行全基因组测序。常规方法组装及注释后，将蛋白序列与VFDB（Virulence Factor Databases）及CARD（The Comprehensive Antibiotic Resistance Database）数据库进行比对开展毒力因子及耐药基因分析。结果显示，该菌不具有毒力因子及耐药基因。
利用平均核苷酸相似度（Average Nucleotide Identity，ANI）进行菌株的新颖性分析。通过在Genbank中进行搜索，找到了854个已公开的Lactiplantibacillus plantarum全基因组，通过fastANI（v1.33）比较发现，有且仅有1个菌株与植物乳植杆菌Lplan-1全基因组最相近并不低于99.9%，为GCA_001331925.2（ANI=99.95%）。通过Snippy（v4.6.0）分析发现两个菌株间SNP有295个，INS有9个，DEL有14个，COMPLEX有3个，说明基因组差异大，故可认为植物乳植杆菌Lplan-1为新菌株，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
通过emapper-2.1.9对全基因组序列进行注释，进一步发现植物乳植杆菌Lplan-1含有可编码1个序列如SEQ ID NO.2所示的产CAT（过氧化氢酶）相关酶的基因。
将植物乳植杆菌Lplan-1保藏于中国典型培养物保藏中心（China Center forType Culture Collection，CCTCC），保藏号为：CCTCC NO：M 2023354。
实施例3 溶血试验
按2%接种量将保藏的植物乳植杆菌 Lplan-1接种至5 mL无氧三混液体培养基（BHI+MRS+改良GAM）中，以粪肠球菌（β溶血，CICC23658，购自至中国工业微生物菌种保藏管理中心）作为阳性对照，以空白培养基作为阴性对照。所有菌株均在无氧三混液体培养基中37℃厌氧培养12 h，得到活化菌株。各取2.5 μL活化菌株接种至哥伦比亚血平板（上海科玛嘉微生物技术有限公司）上，每组设置3个平行。于37℃厌氧培养48 h后进行观察，阳性对照菌株菌落周围形成界限明显、完全透明的溶血环，为β溶血；植物乳植杆菌Lplan-1菌落周围的培养基没有变化，为γ溶血，即不溶血。
实施例4 抗生素敏感试验
根据《中国药典》（2020版）第三部“微生态活菌制剂总论”中抗生素敏感性试验的要求，在MRS平板培养基上，采用琼脂扩散纸片法测定菌株对抗生素的敏感性，根据抑菌圈的大小判断菌株对抗生素敏感性级别。
结果显示植物乳杆菌Lplan-1对青霉素、氨苄西林、亚胺培南、红霉素这4种抗生素敏感；对万古霉素、克林霉素耐药；对头孢曲松、四环素中介。
实施例5 抗氧化能力
以LGG（鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus GG，CICC6141，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心）作为阳性对照，所有菌株均在厌氧BF839培养基中37℃厌氧培养24h。
样本处理：取0.5 mL培养菌液12000 rpm离心20 min弃上清，用0.5 mL总抗氧化能力检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，BC1315）中的提取液（预冷）重悬；转移至灭菌的装有beads（Sigma-Aldrich Company,G4649-1KG）的螺帽管中，用快速样品制备仪振荡破壁一次（参数设置：4.5 m/s，30 s）后，12000 rpm 4℃离心10 min，取上清置冰上待测。
采用BCA 蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，PC0020），按照试剂盒的说明书操作绘制标准曲线并检测BCA样品。
采用菌株总抗氧化能力检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，BC1315），按照试剂盒的说明书操作结合标准曲线测定样本的抗氧化能力。总抗氧化能力单位μmol/mgprot，阳性对照LGG与植物乳植杆菌Lplan-1的总抗氧化能力结果参见图2。
如图2所示，植物乳植杆菌Lplan-1总抗氧化能力达0.43 μmol/mg prot，显著高于阳性对照菌株LGG（*， P<0.05），表明植物乳植杆菌Lplan-1具有较强的抗氧化能力。
实施例6 耐人工胃肠液实验
菌株活化与培养：将植物乳植杆菌Lplan-1按2%接种量接种至5 mL无氧三混培养基中，培养至对数生长后期。
菌株耐胃肠液处理：取1 mL培养好的菌液，5000 rpm×5 min离心，弃去上清后用1mL无氧无刃天青PBS将菌体重悬。取0.1 ml菌悬液补充0.9 ml无氧无刃天青PBS作为对照组，取0.1 ml菌悬液补充0.9 ml人工胃液/人工肠液作为实验组。混匀后于37℃厌氧静置。人工胃液组孵育6 h，人工肠液组孵育4 h后，吸取0.1 ml菌液稀释至适宜梯度后，取25 μl于三混固体培养基，37 ℃厌氧培养至单菌落长出后计数。
数据处理：菌株存活率=实验组活菌数/对照组活菌数×100%。
结果如表1、2和图3所示，植物乳植杆菌Lplan-1对人工胃液和人工肠液具有较好的耐受性。
表1 植物乳植杆菌Lplan-1经胃液处理后存活率。
组别 活菌数（CFU/mL） 存活率（%）
对照组 （4.15±0.14）×108 -
pH 3.0胃液组 （2.01±0.06）×108 48.31%
表2 植物乳植杆菌Lplan-1经肠液处理后存活率
组别 活菌数（CFU/mL） 存活率（%）
对照组 （3.83±0.06）×108 -
肠液组 （2.73±0.15）×108 71.43%
实施例7 对致病菌的抑菌活性
选取8种常见的可导致腹泻的致病菌进行抑菌能力检测，致病菌株来源信息如表3所示。
表3 致病菌珠来源信息
菌株名称 菌株保藏号 菌株保藏单位
铜绿假单胞菌 CMCC(B)10104 中国食品药品检定研究院
志贺氏菌 CMCC(B)51252 中国食品药品检定研究院
大肠杆菌 CMCC(B)44102 中国食品药品检定研究院
乙型副伤寒沙门氏菌 CMCC(B)50094 中国食品药品检定研究院
金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 中国食品药品检定研究院
小肠结肠炎耶尔森菌 CMCC(B)52204 中国食品药品检定研究院
副溶血性弧菌 ATCC 17802 美国微生物菌株保藏中心
艰难梭菌 CICC 22951 中国工业微生物菌种保藏管理中心
植物乳植杆菌 Lplan-1发酵液制备：植物乳植杆菌 Lplan-1经活化后，按2%的接种量接种于无氧液体三混培养基中，于37℃厌氧培养48 h，获得发酵液。
致病菌制备与涂布：铜绿假单胞菌、志贺氏菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌为好氧菌，经TSB肉汤培养基活化后，于TSB肉汤培养基中稀释50倍达到合适浓度，取0.2 mL稀释好的菌液于TSA固体培养基上涂布。艰难梭菌为厌氧菌，用三混液体培养基活化后，用三混液体培养基稀释50倍达到合适浓度，取200 μL涂布于无氧GAM固体培养基（添加5%马血清，北京索莱宝科技有限公司，S9050），每个平板中放置3个牛津杯，牛津杯中加入200 μL待测发酵液，除艰难梭菌在厌氧条件下培养，其余致病菌均在有氧条件下培养。37℃培养24 h后，测量抑菌圈直径，并计算平均值。
实验结果：如图4所示，植物乳植杆菌 Lplan-1对铜绿假单胞菌、志贺氏菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和艰难梭菌均有抑制能力。
实施例8 体外屏障修复能力
Caco2细胞接种：将贴壁细胞Caco-2使用37℃预热的胰酶消化液消化后，用含10%FBS和1% PS的DMEM培养基（DMEM培养基，Gibco，C11995500BT； FBS，Gibco，16000-044；PS，Gibco，15140-122）以1.1×105个细胞/孔数量接种于24孔Transwell中，置于37℃，5%CO2培养箱中，静置培养21d，期间需要隔天换液保证细胞生长所需营养。
菌株培养：将待测菌株Lplan-1、对照菌株Lplan-2和鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）GG（LGG，CICC 6141，中国工业微生物菌种保藏管理中心）以5%接种量接种至5 mL二混培养基中（相关试剂提前除氧），37℃电热恒温培养箱厌氧培养24h。以相同接种量再次转接，厌氧培养8 h。取1 mL菌液，12000 rpm/min离心3 min。用含10%FBS的DMEM培养基将菌株稀释至107 CFU/mL，待用。探究植物乳植杆菌 Lplan-1对Caco-2细胞模型中肠上皮屏障功能的影响：本试验共分5组，分别为正常对照组、模型组、阳性对照组、对照菌株Lplan-2、植物乳植杆菌 Lplan-1组。
肠上皮屏障功能检测：使用炎症因子IFN-γ（Pepro Tech， AF-300-02）和TNF-α（Pepro Tech，300-01A）构建屏障损伤模型。Caco-2细胞培养21d后，待其分化形成致密单层细胞，吸去下室旧培养基，正常对照组下室加入800 μL DMEM培养基，模型组、阳性对照组、对照菌株Lplan-2组以及植物乳植杆菌 Lplan-1组下室分别加入800 μL IFN-γ溶液。置于5%二氧化碳培养箱中，37℃静置培养22 h后，吸去上室及下室溶液，正常对照组上室加入200 μL DMEM培养基，下室加入800 μL DMEM培养基；模型组上室加入200 μL DMEM培养基；阳性对照组，上室加入200 μL LGG菌液；对照菌株Lplan-2组，上室加入200 μL Lplan-2菌液；植物乳植杆菌 Lplan-1组上室加入200 μL植物乳植杆菌 Lplan-1菌液；模型组、阳性对照组、对照菌株Lplan-2组和植物乳植杆菌 Lplan-1组下室加入800 μL TNF-α溶液。置于5%二氧化碳培养箱中，37℃静置培养5 h后，检测各组别细胞单层跨膜电阻（TEER）值。
结果如图5所示：与模型组相比，阳性对照组（LGG）、对照菌株Lplan-2和植物乳植杆菌 Lplan-1均可显著增加TEER值，表明对细胞屏障损伤具有明显的修复作用（**：P<0.01，***：P<0.001）。且对照菌株Lplan-2和植物乳植杆菌 Lplan-1的效果优于阳性对照组（LGG）。结果表明植物乳植杆菌 Lplan-1可有效缓解炎症因子（如IFN-γ、TNF-α）造成的屏障功能障碍。
实施例9 体外细胞炎症抑制试验
THP-1细胞极化：使用含10 v/v %FBS和终浓度为100ng/mL PMA (佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯，phorbol 12-myristate1 3-acetate，Sigma-Aldrich Company，P1585) 的RPMI-1640（Thermo Fisher，C11875500BT）培养基，以1×105 个细胞/孔的接种密度将THP-1细胞接种于96孔板中，置于5% CO2培养箱，37℃培养24 h使其极化成为成熟巨噬细胞。
菌株培养：从菌保管中接种对照菌株Lplan-2、植物乳植杆菌Lplan-1菌液200 μL至5 mL二混培养基（BHI+MRS）中，37℃电热恒温培养箱厌氧培养24 h。转接一次后，厌氧培养8 h。取1 mL菌液，5000 rpm/min离心15 min。用含10% FBS的RPMI-1640培养基稀释至2×106 CFU/mL备用。
植物乳植杆菌 Lplan-1对THP-1细胞表达IL-6的影响：THP-1成熟细胞培养好后，正常对照组更换含10% FBS的RPMI-1640培养基；模型组、阳性对照组及对照菌株Lplan-2、Lplan-1试验组分别更换含10% FBS、终浓度为100 ng/mL LPS（Sigma-Aldrich Company,L3024）和20 ng/mL IFN-γ（PeproTech，AF-300-02）的RPMI-1640培养基，进行炎症型巨噬细胞的造模。各组均置于5% CO2培养箱中，37℃培养24 h。吸去培养基，正常对照组和模型组分别添加100 μL含10% FBS的RPMI-1640培养基；阳性对照组添加100 μL含10% FBS和终浓度为25 μg/mL的地塞米松（Sigma-Aldrich Company，D4902-25）的RPMI-1640培养基；对照菌株Lplan-2组添加100 μL前期制备好的Lplan-2菌液；Lplan-1试验组添加100 μL前期制备好的植物乳植杆菌 Lplan-1菌液。置于5% CO2培养箱，37℃培养24 h后，各组分别吸取80 μL细胞培养液，4℃，5000 rpm/min，离心15 min，收集上清液，使用Human IL-6(Interleukin 6) ELISA试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，E-EL-H6156) 检测IL-6含量。
试验结果：如图6所示，模型对照组细胞上清液中IL-6的表达显著高于正常对照组（***：P<0.001）；阳性对照组（地塞米松）能够显著抑制THP-1细胞中促炎因子IL-6的表达（***：P<0.001）；对照菌株Lplan-2和植物乳植杆菌 Lplan-1组与模型组相比均能够显著降低促炎因子IL-6的表达（***：P<0.001），表明Lplan-2与Lplan-1均在体外具有一定的抗炎作用。
实施例10 对5-氟尿嘧啶致腹泻小鼠的治疗效果
冻干保护剂配制：
A液：蔗糖8 g，海藻糖8 g，纯化水44 g；115℃灭菌20 min。
B液：谷氨酸钠2 g，盐酸精氨酸2g，纯化水16 g； 115℃灭菌20 min。
C液：维生素C钠4 g，纯化水16 g。过滤除菌备用。
使用时按体积比A:B:C=6:2:2混合。
菌粉制备：将植物乳植杆菌Lplan-1接种至菌粉制备培养基，37℃厌氧培养4~8 h，得到一级种子液（OD600值≥ 1.8）。随后，转接一次，37℃厌氧培养5~10 h，得到二级种子液（OD600值≥1.8）。将二级种子液用蠕动泵泵入发酵罐中，设置发酵参数（37℃、pH 5.1、100rpm、0.04 MPa），发酵培养。发酵菌液OD600值≥2.1时停止发酵，设置发酵温度为20℃，离心收集菌体得到菌泥。向菌泥中按重量比1:1~1:2添加冻干保护剂，冻干，制备菌粉。动物给药前使用0.2 mL生理盐水将1×109 CFU菌粉配置成菌悬液。
试验动物：25只SPF级雄性Balb/c小鼠，体重18~22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF级动物房。
试验设计：采用5-FU（天津金耀药业有限公司，规格10 mL/支，0.25 g/10 mL）溶液诱导小鼠化疗相关性腹泻模型。根据小鼠初始体重随机分为5组，每组5只，5组分别为正常对照组、模型对照组、洛哌丁胺组和植物乳植杆菌Lplan-1组、植物乳植杆菌Lplan-3组。
总体试验周期为9 d，记为D1-D9。D3进行5-FU单次造模处理，除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其他组均进行5-FU单次腹腔注射造模处理，造模剂量按体重给药（350 mg/kg）。
所有组给药方式为灌胃，正常对照组、模型对照组灌胃冻干保护剂，连续灌胃5天（D1-D5）；洛哌丁胺组按体重连续灌胃洛哌丁胺（西安杨森制药有限公司，LFJ8684）9天（D1-D9，20 mg/kg）；Lplan-1和Lplan-3组分别连续灌胃5天（D1-D5）1×109 CFU植物乳植杆菌Lplan-1和Lplan-3。在D5给药结束后，连续观察4天。具体试验分组和给药方案见表4。
表4试验分组和给药方案
组别 数量 造模剂 造模剂量 受试物 给药体积 给药剂量 给药天数
正常对照组 5 生理盐水 / 冻干保护剂 0.2 mL/只 / 5 d
模型对照组 5 5-FU 350mg/kg 冻干保护剂 0.2 mL/只 / 5 d
洛哌丁胺组 5 5-FU 350mg/kg 洛哌丁胺 10 mL/kg 20 mg/kg 9 d
Lplan-1 5 5-FU 350mg/kg Lplan-1 0.2 mL/只 1×109 CFU/只 5 d
Lplan-3 5 5-FU 350mg/kg Lplan-3 0.2 mL/只 1×109 CFU/只 5 d
注：5-FU:5-氟尿嘧啶；CFU: colony forming unit 菌落形成单位；d: 天
腹泻观察与评分：将小鼠置于垫有洁净滤纸的小鼠笼内，每笼1只。粪便硬，正常便视为0分；轻度、轻微湿便或软便视为1分；中度，湿便、粪便不成形且肛周不洁视为2分；重度，稀便且严重肛周不洁视为3分。试验周期内，每天对小鼠粪便进行观察、评分，腹泻总分为每天腹泻评分的总和。
试验结果如图7所示，与模型对照组相比，试验D8时Lplan-1对5-FU导致的腹泻具有明显改善作用（**：P<0.01）（图7A），腹泻总分显著降低（**：P<0.01）（图7B）, Lplan-3对腹泻无明显改善作用（图7B）。
采用完全相同的试验方法，在另一批次的研究中对Lplan-2进行药效探索，结果如图7C所示，Lplan-2对腹泻无显著改善作用，腹泻总分与模型对照组相比未见显著差异。
结果表明本发明的植物乳植杆菌Lplan-1能够显著改善化疗药物5-FU导致的腹泻症状。相同试验条件下，Lplan-1对腹泻的治疗效果优于Lplan-2和Lplan-3。
实施例11 对5-氟嘧啶致腹泻小鼠结肠TNF-α和AQP8的mRNA相对转录水平的改善
实施例10中的动物试验结束后，采集小鼠中段结肠，保存于-80 ℃冰箱。按照试剂（ThermoFisher Scientific, 15596026）说明书提取各组小鼠结肠组织总RNA，并反转录成cDNA，保存于-20 ℃备用。用qRT-PCR检测各组小鼠结肠炎症因子TNF-α和水通道蛋白8（AQP8）的mRNA基因相对转录水平（引物序列见表5）。反应程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 20 s，共39个循环。采用2-ΔΔCT法进行分析，通过SPSS 24.0统计软件对数据进行显著性分析。
表5 qRT-PCR引物信息
基因 引物
Tumor necrosis factor (TNF-α) Forward: 5’-CTGTAGCCCACGTCGTAGC-3’
Tumor necrosis factor (TNF-α) Reverse: 5’-TTGAGATCCATGCCGTTG-3’
Aquaporins8 (AQP8) Forward: 5’-GGAACATCAGCGGTGGACACTTC-3’
Aquaporins8 (AQP8) Reverse: 5’-GGGAATTAGCATGGTCTTGAGG-3’
试验结果：由图8A可知，与正常对照组相比，模型对照组TNF-α的mRNA相对转录水平显著升高（**：P<0.01）；Lplan-1给药后可显著降低TNF-α的mRNA相对转录水平（**：P<0.01）。
由图8B可知，与正常对照组相比，模型对照组AQP8的mRNA相对转录水平显著降低（**：P<0.01）；Lplan-1给药后可显著增加AQP8的mRNA相对转录水平（**：P<0.01）。
由此可见，本发明的植物乳植杆菌Lplan-1能够通过降低TNF-α和增加水通道蛋白AQP8的表达来改善腹泻症状，对化疗相关性腹泻具有明显的治疗效果。
以上所述，仅为本发明的较佳具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员，在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1. 一种植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株，所述菌株选自保藏号为 CCTCC NO: M 2023354 的植物乳植杆菌 Lplan-1。
2. 如权利要求 1 所述的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株的培养方法，其特征在于，将所述植物乳植杆菌菌株接种至培养基，进行增殖培养，得到增殖的植物乳植杆菌菌株。
3. 根据权利要求 2 所述的培养方法，其特征在于，所述培养基每 1 L 蒸馏水含有BHI 肉汤粉末 15-20 g，MRS 肉汤粉末 10-15 g，改良 GAM 肉汤粉末 12-17 g。
4. 一种食品、保健品或药物组合物，其活性成分含有权利要求 1 所述的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株，或含有通过权利要求 2 所述的培养方法得到的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株。
5. 根据权利要求 4 所述的食品、保健品或药物组合物，其特征在于，所述植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株作为唯一活性成分。
6. 权利要求 1 所述的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）在制备微生态制剂中的应用，所述微生态制剂用于治疗或预防腹泻和/或抑制肠道病原菌的繁殖，其中，所述肠道病原菌选自以下任意一种或其组合：铜绿假单胞菌、志贺氏菌、大肠杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和艰难梭菌。
7. 根据权利要求 6 所述的应用，其特征在于，所述腹泻为化疗相关性腹泻。
8. 根据权利要求 7 所述的应用，其特征在于，所述化疗相关性腹泻是活性成分选自如下一种或多种的药物引起的腹泻：5-氟尿嘧啶、替加氟、5'-2'-脱氧尿苷、卡培他滨、替吉奥、紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、顺铂、卡铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、卡莫司汀、伊立替康。
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