CN118667724A

CN118667724A - 鼠李糖乳酪杆菌gs066及细菌素、冻干粉、后生元及其抑制幽门螺杆菌的应用

Info

Publication number: CN118667724A
Application number: CN202411154693.XA
Authority: CN
Inventors: 刘金昉; 袁文焕; 刘瑞峰; 韩清波; 王震; 李华文; 李云旭; 刘飒; 马乐辉
Original assignee: Tianjin Xiaowei Biotechnology Co ltd; Tianjin Xinyuan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Tianjin Xiaowei Biotechnology Co ltd; Tianjin Xinyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-08-22
Filing date: 2024-08-22
Publication date: 2024-09-20

Abstract

本发明提供了鼠李糖乳酪杆菌GS066及细菌素、冻干粉、后生元及其抑制幽门螺杆菌的应用，属于微生物技术领域。本发明所述鼠李糖乳酪杆菌GS066，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.29393。本发明所述鼠李糖乳酪杆菌GS066产生的细菌素含量高，利用鼠李糖乳酪杆菌GS066以及从该菌株发酵液中提取获得细菌素可有效的抑制革兰氏阴性菌。

Description

鼠李糖乳酪杆菌GS066及细菌素、冻干粉、后生元及其抑制幽门螺杆菌的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及鼠李糖乳酪杆菌GS066及细菌素、冻干粉、后生元及其抑制幽门螺杆菌的应用。

背景技术

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,HP），常寄生在胃黏膜组织中，感染后引起慢性胃炎和消化性溃疡等疾病，与胃癌、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等疾病密切相关，被世界卫生组织（WHO）列为第一类生物致癌因子。幽门螺杆菌感染主要包括与感染者的长期密切接触、使用感染者用过的不洁饮食器具等。幽门螺杆菌所致的胃炎细菌自发清除比较少见。通过规范的药物治疗，幽门螺杆菌感染可以治愈，但如不注意卫生和生活习惯，仍可再次感染。因此对日常用具进行合理的除菌清洁，并采取疗效确切的药物治疗幽门螺杆菌感染，对于幽门螺杆菌预防和治疗具有积极意义。

益生菌对治疗幽门螺杆菌有一定的的辅助治疗作用。益生菌可改善肠道菌群、提高身体免疫力、调节胃肠道功能等。幽门螺杆菌感染通过服用益生菌后，能够一定程度上抑制身体内的炎症反应，促进胃肠道粘膜的恢复。细菌素是细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽，是存在于细菌生活的天然环境中的一类抗菌物质。因此，筛选具有抑制幽门螺杆菌功能的益生菌，并提取其细菌素用于抑制幽门螺杆菌，有助于实现幽门螺杆菌预防和治疗。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供鼠李糖乳酪杆菌GS066，能够有效的抑制幽门螺杆菌。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）GS066，所述鼠李糖乳酪杆菌GS066，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏编号为CGMCC NO. 29393，保藏日期：2023年12月25日。

本发明的另一目的在于提供一种提取细菌素的方法，包括如下步骤：所述鼠李糖乳酪杆菌GS066接种于液体培养基中，发酵22-30h后，发酵液离心，收集上清液，于上清液中加入硫酸铵进行沉淀，离心收集沉淀，得细菌素。

优选的，所述鼠李糖乳酪杆菌GS066发酵12-18h时，于发酵体系中添加0.3-1.0g/L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸继续发酵。

本发明的另一目的在于提供一种制剂，所述制剂含有所述鼠李糖乳酪杆菌GS066和/或所述方法提取的细菌素。

本发明的另一目的在于一种冻干粉的制备方法，包括如下步骤：所述鼠李糖乳酪杆菌GS066接种于液体培养基中，发酵至发酵液中葡萄糖含量≤0.1g/L，发酵液离心，收集菌体与冻干保护剂混合形成乳化液，将乳化液进行冷冻干燥。

优选的，按质量百分比计，所述冻干粉的保护剂包括：脱脂乳粉8-12%，海藻糖7-9%，甘露糖醇1-3%，吐温-80 0.08-0.12%，谷氨酸钠0.8-1.2%，维生素C 0.04-0.06%，余量为水。

本发明的另一目的在于提供所述冻干粉的制备方法制备的冻干粉。

本发明的另一目的在于提供一种后生元的制备方法，包括如下步骤：所述鼠李糖乳酪杆菌GS066接种于液体培养基中，发酵12-18h时，于发酵体系中添加0.3-1.0g/L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸继续发酵，发酵结束后发酵液浓缩，干燥后即得后生元。

本发明的另一目的在于提供所述后生元制备方法制备的后生元。

本发明的另一目的在于提供所述鼠李糖乳酪杆菌GS066、所述方法提取的细菌素、所述制剂、所述冻干粉或所述后生元在制备抑制革兰氏阴性菌产品中的应用，所述革兰氏阴性菌包括幽门螺杆菌和大肠杆菌。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了鼠李糖乳酪杆菌GS066，相较于市售的同属菌株鼠李糖乳酪杆菌LGG、鼠李糖乳酪杆菌HN001，该菌株代谢产生的细菌素对幽门螺杆菌抑制性好，利用鼠李糖乳酪杆菌GS066以及从该菌株发酵液中提取获得细菌素可有效的抑制革兰氏阴性菌。

生物保藏说明

本发明所述的鼠李糖乳酪杆菌GS066，分类命名为鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：CGMCCNO. 29393，保藏日期：2023年12月25日。

具体实施方式

本发明提供了鼠李糖乳酪杆菌GS066，所述鼠李糖乳酪杆菌命名为鼠李糖乳酪杆菌GS066，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.29393。

本发明中，所述鼠李糖乳酪杆菌GS066从婴儿粪便中分离获得，经鉴定证明其属于Lacticaseibacillus rhamnosus。

本发明提供了一种提取细菌素的方法，包括如下步骤：所述鼠李糖乳酪杆菌GS066接种于液体培养基进行发酵，发酵22-30h后，获得发酵液离心后收集上清液，于上清液中加入硫酸铵进行沉淀，离心收集沉淀，得细菌素；优选的，所述鼠李糖乳酪杆菌GS066发酵12-18h时，于发酵体系中添加0.3-1.0g/L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）继续发酵。本发明提取获得的细菌素能够有效的抑制革兰氏阴性菌，在发酵过程中添加NADP可提高发酵液中细菌素含量，进一步提高细菌素对革兰氏阴性菌的抑制效果。

本发明提取细菌素的方法中，所述液体培养基为改良MRS培养基；所述鼠李糖乳酪杆菌GS066接种量为发酵体系质量的1%-5%，优选为3%；所述发酵温度为35-40℃，优选为37℃；优选于发酵进行14-16h时添加NADP，更优选于发酵进行15h时添加NADP；所述NADP的添加浓度优选为0.4-0.6g/L，更优选为0.5g/L；所述NADP的添加浓度为NADP的工作浓度；所述鼠李糖乳酪杆菌GS066发酵时间优选为24-28h，更优选为发酵25h；所述发酵液离心条件为：4℃，离心转速为6000-10000rmp，优选为8000rmp，离心时间为10-30min，优选为20min；所述上清液中加入硫酸铵至溶液中硫酸铵饱和度为60-80%，优选的硫酸铵饱和度为70%；加入硫酸铵后，于25-30℃搅拌，搅拌时间为0.5h-2h，所述搅拌结束后离心条件为：4℃，离心转速为6000-8000rmp，优选为8000rmp，离心时间为10-20min，优选为15min。本发明中离心收集的沉淀即得细菌素，作为一种可实施的方式，所述细菌素于35-45℃干燥。

本发明上述鼠李糖乳酪杆菌GS066接种于液体培养基进行发酵前先进行活化，所述活化包括将鼠李糖乳酪杆菌GS066接种于改良MRS培养基，36-38℃静置培养18h后，再进行上述活化培养两次获得发酵种液。本发明中，所述鼠李糖乳酪杆菌GS066接种量为发酵体系质量的1%-5%，优选为3%。

本发明通过在鼠李糖乳酪杆菌GS066发酵过程中于发酵体系中添加NADP，能有效的提高细菌素的产量。

本发明还提供了上述提取细菌素的方法提取获得的细菌素，所述细菌素在使用时加入无菌水溶解，可有效的抑制幽门螺杆菌和大肠杆菌。

本发明还提供了一种制剂，所述制剂含有上述鼠李糖乳酪杆菌GS066和/或所述细菌素。本发明制剂可有效的抑制革兰氏阴性菌，对幽门螺杆菌和大肠杆菌具有优异的抑制效果。

本发明还提供了冻干粉的制备方法，包括如下步骤：所述鼠李糖乳酪杆菌GS066接种于液体培养基中，发酵至发酵液中葡萄糖含量≤0.1g/L，发酵液离心，收集菌体与冻干保护剂混合形成乳化液，将乳化液进行冷冻干燥。

本发明中，按质量百分比计，所述冻干保护剂包括：脱脂乳粉8-12%，海藻糖7-9%，甘露糖醇1-3%，吐温-80 0.08-0.12%，谷氨酸钠0.8-1.2%，维生素C 0.04-0.06%，余量为水。

本发明冻干粉的制备方法中，所述液体培养基为：葡萄糖25g/L、牛肉浸粉8g/L、酵母浸粉15g/L、牛骨蛋白胨10g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温-80 1g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH值为6.8；所述培养基使用前灭菌处理，所述灭菌条件为：121℃灭菌12-18min，优选为15min；液体培养基冷却至38-39℃时接种鼠李糖乳酪杆菌GS066。

本发明冻干粉的制备方法中，所述鼠李糖乳酪杆菌GS066接种量为发酵体系质量的1%-5%，优选为3%；所述发酵温度为35-40℃，优选为37℃；培养过程中控制pH为4.8-5.2，优选为5.0，进行补碱发酵；所述发酵液离心收集菌体的条件为：4℃，离心转速为6000-10000rmp，优选为8000rmp，离心时间为10-30min，优选为20min；作为一种可实施的方式，所述菌体与冻干保护剂混合形成的乳化液放入真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，所述冻干剂温度曲线为：-40℃保持4h，每隔2h温度提高5℃，到第24h时温度为0℃，之后每隔2h温度提高3℃，最终最高温度为30℃保持不变，直至物料干燥。

本发明还提供了上述冻干粉制备方法制备的冻干粉，所述冻干粉水分含量低于3%，水活度为0.10-0.20aw。所述冻干粉中鼠李糖乳酪杆菌GS066活菌数≥5.2×10¹¹cfu/g。

本发明鼠李糖乳酪杆菌GS066在冻干剂的保护下制备为冻干粉，活菌数含量高，能够在0-10℃条件中长期稳定保存。

本发明还提供了一种后生元的制备方法，包括如下步骤：所述鼠李糖乳酪杆菌GS066接种于液体培养基进行发酵，发酵12-18h时，于发酵体系中添加0.3-1.0g/L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸继续发酵，发酵结束后发酵液浓缩，干燥后即得后生元。

本发明后生元的制备方法中，所述液体培养基为：葡萄糖15-25g/L、蔗糖5-15g/L、脱脂乳8-12g/L、麦麸粉10-30g/L；作为一种可实施的方式，所述培养基采取巴氏灭菌，所述灭菌条件为：灭菌温度为75-85℃，灭菌时间为40-80min。所述鼠李糖乳酪杆菌GS066接种量为发酵体系质量的1%-5%，优选为3%；所述发酵温度为35-40℃，优选为37℃；优选于发酵进行14-16h时添加NADP，更优选于发酵进行15h时添加NADP；所述NADP的添加浓度优选为0.4-0.6g/L，更优选为0.5g/L；所述NADP的添加浓度为NADP的工作浓度；鼠李糖乳酪杆菌GS066发酵至发酵液pH不再下降即为发酵结束；所述浓缩为采取减压蒸发浓缩的方式，浓缩条件为：真空度0.07-0.1mpa，优选为0.09mpa，温度为40-50℃，优选为45℃；所述干燥为发酵液浓缩至原体积的十分之一时进行喷雾干燥，所述喷雾干燥条件为：进风温度为165-175℃，优选为170℃，进料速度为9.8-11.0mL/min，优选为10.4mL/min。

本发明还提供了所述后生元制备方法制备的后生元，所述后生元中细菌素含量≥10.52mg/g，后生元中具有高含量的细菌素，可有效的抑制幽门螺杆菌。

本发明还提供了所述鼠李糖乳酪杆菌GS066、所述细菌素、所述制剂、所述冻干粉或所述后生元在制备抑制革兰氏阴性菌产品中的应用，所述革兰氏阴性菌包括幽门螺杆菌和大肠杆菌。

本发明鼠李糖乳酪杆菌GS066以及从鼠李糖乳酪杆菌GS066发酵液中提取的细菌素能够有效的抑制幽门螺杆菌和大肠杆菌，提供的鼠李糖乳酪杆菌GS066冻干粉活菌含量高，制备的后生元中细菌素含量高，均可有效的用于抑制幽门螺杆菌和大肠杆菌。

本发明中所述产品包括药品、清洁剂和食品，所述药品可用于治疗和/或预防幽门螺杆菌感染；所述清洁剂可有效抑制环境中的幽门螺杆菌和大肠杆菌，减少细菌污染；所述食品有助于调节肠道菌群，维持肠道菌群的平衡。

本发明具体实施例中，MRS液体培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉5.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，醋酸钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸锰0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，吐温-80 1.0g/L。

改良MRS液体培养基：蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉5.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，醋酸钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸锰0.05g/L，硫酸镁0.2g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，吐温-80 1.0g/L。

营养肉汤固体培养基：蛋白胨10.0g/L、牛肉浸粉3.0g/L、氯化钠5.0g/L、葡萄糖1.0g/L、琼脂12.0g/L。

营养肉汤培养基：蛋白胨10.0g/L、牛肉浸粉3.0g/L、氯化钠5.0g/L、葡萄糖1.0g/L。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

鼠李糖乳酪杆菌GS066分离与鉴定

采集内蒙古克什克腾旗健壮的婴儿粪便样本，使用质量浓度为0.9%的无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在MRS固体培养基上，在37℃培养72h后，挑取单菌落，培养至菌株纯化。对挑选的厌氧菌株进行革兰氏染色成阳性，氧化氢酶实验、明胶液化实验、运动性实验、吲哚实验、硝酸盐还原实验，选择过氧化氢酶、明胶液化、氧化酶实验、吲哚和硝酸盐实验结果均为阴性的菌株。菌株于MRS液体培养基中增菌培养，30%甘油保藏，经生工生物工程(上海)有限公司16SrDNA鉴定，此菌株为鼠李糖乳酪杆菌。

将鼠李糖乳酪杆菌GS066接种于MRS培养基，于37℃培养24h，获得鼠李糖乳酪杆菌GS066菌液。

大肠杆菌ATCC 44102、金黄色葡萄球菌ATCC 25923、幽门螺杆菌ATCC 43504标准株来源于上海北诺生物科技有限公司。

哥伦比亚血平板制备方法：将BHI固体培养基和哥伦比亚琼脂按1:3的比例混合后加入1L水，分装于500mL三角瓶中，121℃灭菌20min，冷却至50-55℃时，加入5%的无菌脱纤维羊血，混合均匀后倒板。

抑制幽门螺杆菌的实验：将哥伦比亚和BHI的混合固体培养基冷却至55℃左右，按100mL培养基加入5mL无菌脱纤维羊血，混合均匀，再取10⁹CFU/mL的幽门螺杆菌ATCC 43504菌悬液1mL加入上述混合均匀的培养基中，摇晃均匀，避免产生气泡，然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，往孔中注入150μL鼠李糖乳酪杆菌GS066菌液（浓度是1×10⁸CFU/mL），37℃微氧条件下培养72h，测定抑菌圈大小，每个处理分别重复3次。

大肠杆菌ATCC 44102、金黄色葡萄球菌ATCC 25923分别接种到营养肉汤培养基中，37℃，180rmp摇床中培养24h进行活化。将营养肉汤固体培养基冷却至55℃左右，分别取10⁹CFU/mL的大肠杆菌ATCC 44102、金黄色葡萄球菌ATCC 25923菌悬液1mL加入上述混合均匀的培养基中，摇晃均匀，避免产生气泡，然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，往孔中注入150μL鼠李糖乳酪杆菌GS066菌液（浓度是1×10⁸CFU/mL），37℃微氧条件下培养72h，测定抑菌圈大小，每个处理分别重复3次，结果如表1所示。

表1 抑菌圈

由表1可知，鼠李糖乳酪杆菌GS066菌液对幽门螺杆菌ATCC 43504和大肠杆菌ATCC44102均有抑制性。

实施例2

鼠李糖乳酪杆菌GS066细菌素提取方法

将鼠李糖乳酪杆菌GS066冻存菌种按照发酵体系质量3%的接种量接种到新鲜灭菌的改良MRS培养基中，37℃静置培养18h；将上述发酵液按照发酵体系质量3%的接种量接种到新鲜灭菌的改良MRS培养基中，37℃静置培养18h；重复上一步骤，获得发酵种液。

按照发酵体系质量3%的接种量，将上述发酵种液接种至改良MRS培养基中，于37℃发酵24h，获得发酵液。

所述发酵液于4℃，离心转速8000rmp，离心20min，离心后上清液用于细菌素提取。向上清液中缓慢添加硫酸铵，使溶液中硫酸铵饱和度为70%，于25℃磁力搅拌1h，搅拌速度为200rmp，搅拌结束后，于4℃，离心转速8000rmp离心15min，弃去上清液，收集沉淀，40℃干燥获得细菌素。

实施例3

鼠李糖乳酪杆菌GS066细菌素提取方法

按照发酵体系质量3%的接种量，将上述发酵种液接种至改良MRS培养基中，于37℃发酵15h，添加工作浓度为0.5g/L的NADP，继续发酵10h，获得发酵液。

实施例4

不同菌株来源的细菌素抑制幽门螺杆菌的效果

对嗜酸乳杆菌LA-5（购自丹麦科汉森）、植物乳杆菌ST-Ⅲ（光明植物活力乳酸菌分离）、鼠李糖乳酪杆菌LGG（购自丹麦科汉森）、鼠李糖乳酪杆菌HN001（购自美国杜邦）、鼠李糖乳酪杆菌GS066，采取实施例2提供的方法提取细菌素。根据干燥获得的细菌素重量用无菌水制备成0.2mg/mL的细菌素溶液用于抑制幽门螺杆菌实验。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、幽门螺杆菌标准株同实施例1。

哥伦比亚血平板制备方法：同实施例1。

幽门螺杆菌菌种制备：将幽门螺杆菌甘油管划线接种至哥伦比亚血平板中，于37℃三气培养箱中培养3-5天，其中三气培养箱的成分比例为：N₂含量85％，CO₂含量10%，O₂含量5%，待单菌落出现后，挑单菌落再次密集划线至哥伦比亚血平板中，于37℃三气培养箱中培养3-5天，用3-5mL PBS收集平板菌体，调浓度为10⁹CFU/mL，并检测活菌数。

抑制幽门螺杆菌的实验：将哥伦比亚和BHI的混合固体培养基冷却至55℃左右，按100mL培养基加入5mL无菌脱纤维羊血，混合均匀，再取10⁹CFU/mL的幽门螺杆菌菌悬液1mL加入上述混合均匀的培养基中，摇晃均匀，避免产生气泡，然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，分别于每孔注入200μL嗜酸乳杆菌LA-5、植物乳杆菌ST-Ⅲ、鼠李糖乳酪杆菌LGG、鼠李糖乳酪杆菌HN001、鼠李糖乳酪杆菌GS066五菌株制备的0.2mg/mL的细菌素溶液，设MRS液体培养基为空白对照，将平皿轻盖后正置于37℃三气培养箱中培养3天，并用游标卡尺测量抑菌圈直径，每个菌做三个平行。

大肠杆菌、金黄色葡萄球菌分别接种到营养肉汤培养基中，37℃，180rmp摇床中培养24h进行活化。将营养肉汤固体培养基冷却至55℃左右，分别取10⁹CFU/mL的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌悬液1mL加入上述混合均匀的培养基中，摇晃均匀，避免产生气泡，然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，分别于每孔注入200μL嗜酸乳杆菌LA-5、植物乳杆菌ST-Ⅲ、鼠李糖乳酪杆菌LGG、鼠李糖乳酪杆菌HN001、鼠李糖乳酪杆菌GS066五菌株制备的0.2mg/mL的细菌素溶液，设MRS液体培养基为空白对照，将平皿轻盖后正置于37℃三气培养箱中培养3天，并用游标卡尺测量抑菌圈直径，每个菌做三个平行，结果如表2所示。

表2 细菌素抑菌效果

由表2可知，五种菌株制备的相同浓度的细菌素溶液均对幽门螺杆菌产生抑制作用，其中鼠李糖乳酪杆菌GS066代谢产生的细菌素对幽门螺杆菌抑制性最好，其次是鼠李糖乳酪杆菌HN001，植物乳杆菌ST-Ⅲ效果最差；五菌株对大肠杆菌均有很好的抑制作用，其中鼠李糖乳酪杆菌GS066抑制性最好，植物乳杆菌ST-Ⅲ效果最差；五菌株对金黄色葡萄球菌抑制性未表现出效果。可见五种菌株细菌素对革兰氏阴性菌有显著抑制性，对革兰氏阳性菌抑制效果欠佳。

实施例5

鼠李糖乳酪杆菌GS066细菌素提取方法对细菌素产量的影响

采取实施3提取细菌素的方法，鼠李糖乳酪杆菌GS066发酵不同时期（不添加、0h、5h、10h、15h、20h）添加工作浓度为0.5g/L的NADP，添加NADP后继续发酵，至接种鼠李糖乳酪杆菌GS066后发酵25h时，对发酵液进行离心，对上清液提取细菌素，根据干燥获得的细菌素重量用无菌水制备成0.2mg/mL的细菌素溶液用于抑制幽门螺杆菌实验，结果如表3所示。

表3 抑制幽门螺杆菌结果

由表3可知，0.5g/L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸在0h、5h、10h、20h添加与不添加时产生的细菌素无差异性，本发明在发酵15h时添加能产生较多的细菌素，经重复实验分析，15h左右，鼠李糖乳酪杆菌GS066进入稳定期，菌体进入次级代谢，在此时添加一定浓度的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸能促进细菌素大量产生；0h、5h、10h为菌体生长期，20h为菌体衰亡期对细菌素产生无影响。

实施例6

鼠李糖乳酪杆菌GS066冻干粉制备

发酵培养基：葡萄糖25g/L、牛肉浸粉8g/L、酵母浸粉15g/L、牛骨蛋白胨10g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.58g/L、硫酸锰0.25g/L、吐温-801g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。

冻干保护剂成分为：水70%，脱脂乳粉10%，海藻糖8%，甘露糖醇2%，吐温-80 0.1%，谷氨酸钠1%，维生素C 0.05%。

培养基配置后调节pH值为6.8，121℃灭菌15min，冷却至38℃时，按发酵体系质量3%的接种量接种鼠李糖乳酪杆菌GS066，进行发酵罐接种培养，培养温度为37℃，pH值控制在5.0进行补碱发酵。待发酵液中葡萄糖残留为0.1g/L时，停止发酵。

采用低温离心机对发酵液进行离心，温度4℃、转速8000rmp、时间20min收集菌体，得到的菌体与冻干保护剂充分混匀形成乳化液。

充分混匀的乳化液放入真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，冻干机温度曲线为：-40℃保持4h，每隔2h温度提高5℃，到第24h时温度为0℃，之后每隔2h温度提高3℃，最终最高温度为30℃保持不变，直至物料干燥获得鼠李糖乳酪杆菌GS066冻干粉。冻干粉水分含量低于3%，水活度在0.10-0.20aw。

获得的冻干鼠李糖乳酪杆菌GS066菌粉经检测活菌数为5.2×10¹¹cfu/g。

实施例7

鼠李糖乳酪杆菌GS066后生元制备

液体培养基：葡萄糖20g/L、蔗糖10g/L、脱脂乳10g/L、麦麸粉（过800目筛）20g/L。

培养基配置后80℃巴氏灭菌60min，冷却至37℃时，按发酵体系质量3%的接种量接种鼠李糖乳酪杆菌GS066，进行发酵培养，培养温度为37℃，在15h时添加工作浓度为0.5g/LNADP继续发酵9h时，发酵液pH值不再下降，结束发酵。

发酵液采用减压浓缩，在真空度0.09mpa，温度45℃进行蒸发浓缩，浓缩至发酵液十分之一时进行喷雾干燥。喷雾干燥条件为进风温度为170℃，进料速度为10.4mL/min，得到鼠李糖乳酪杆菌GS066后生元。

取鼠李糖乳酪杆菌GS066后生元纯化水溶解，根据后生元液体发酵培养基固液比例为1:16.7，将后生元与纯化水按质量比1:16.7混合，提取细菌素。同时对上述浓缩前的发酵液提取细菌素，细菌素提取方法采取实施例3提供的方法，提取获得的细菌素进行抑制幽门螺杆菌检测，结果如表4所示。

表4 抑菌效果

由表4可知，鼠李糖乳酪杆菌GS066后生元在发酵完成后，发酵液中含有的细菌素为0.64mg/mL，与后生元制备完成后的含量相符合，且对幽门螺杆菌的抑制效果相同，可见鼠李糖乳酪杆菌GS066后生元有很好的抑制幽门螺杆菌的作用。

实施例8

鼠李糖乳酪杆菌GS066抑制幽门螺杆菌小鼠实验

实验动物选用SPF级C57BL/6（4周龄，雌性）小鼠95只，正常喂养一周后，先灌胃混合抗生素（每只小鼠10mg/mL氨苄青霉素，2mg/mL庆大霉素，25mg/mL阿奇霉素）3天后，分出10只作为对照组，其余小鼠进行造模。

造模：灌胃0.3mL菌液浓度为1×10⁹CFU/mL的幽门螺杆菌菌悬液，隔天灌胃，共5次，制备幽门螺杆菌感染模型。随机取5只小鼠，解剖取胃，用胃幽门螺杆菌pH指示剂法诊断试剂盒检测胃内均有Hp定殖，并取胃黏膜内侧物质进行培养并传代，均检测到有可稳定传代的Hp生长，说明造模成功。

造模成功后，小鼠分组为模型组、阳性对照组、冻干粉高剂量组、冻干粉中剂量组、冻干粉低剂量组、后生元高剂量组、后生元中剂量组、后生元低剂量组与未造模的对照组共9组，每组10只小鼠。

其中，本实施例中的冻干粉为实施例6的方法获得，后生元为实施例7提供的方法获得。

所有小鼠灌胃等剂量为0.3mL的药物，其灌胃药物及周期如表5所示。

表5 灌胃药物及周期

治疗40天后，断颈法处死小鼠取胃，肠道部位进行以下检测：

（1）取胃组织切片，按Hp染色试剂盒（由福州迈新生物技术开发有限公司）说明染色，观察胃Hp感染分级，Hp呈深红色，背景红色。Hp-：无Hp（＜2个红点）；Hp+：局部少量Hp（2-10个红点）；Hp++：10-50个红点；Hp+++：＞50个红点。

（2）取小鼠胃黏膜组织500mg，匀浆后离心取上清。采用小鼠ELISA试剂盒（联科生物科技有限公司）测定小鼠胃黏膜IL-1β、IL-8、IFN-γ以及IL-4、IL-10含量，具体步骤按说明书操作。

（3）采用DNA抽提试剂盒（天根生化细菌基因组DNA提取试剂盒（DP302））提取，操作参照试剂盒说明，再对得到的肠道部位总DNA进行纯度、浓度及完整性的检测。选取细菌16SrRNA基因高度可变的V3-V4区进行PCR扩增：上游引物338F（SEQ ID NO.1）：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG，下游引物806R（SEQ ID NO.2）：GGACTACHVGGGTWTCTAAT，扩增产物280 bp。每个样本3个PCR重复，将3个重复的PCR产物混合，并使用2%琼脂糖凝胶电泳检测产物。使用（天根生化DNA产物纯化试剂盒（DP205））试剂盒切胶回收，进行PCR产物纯化，2%琼脂糖电泳检测纯度。将PCR产物用QuantiFluor-ST蓝色荧光定量系统进行定量，之后按照每个样本的测序量要求进行相应比例的混合。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq试剂盒进行建库，利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序。

使用fastp0.20.0软件（https://github.com/OpenGene/fastp）原始测序序列进行质控，使用FLASH1.2.7软件（http://www.cbcb.umd.edu/software/flash）进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行分类单元（OTU）聚类分析和物种分类学分析。基于OTU聚类分析结果，通过α多样性指数分析可以得到群落中物种的多样性、丰度、覆盖度等信息，其中shannon指数可反映群落多样性，chao指数可反映群落丰度，cover-age指数可反映群落覆盖度。进一步对测序深度进行检测，基于分类学信息，在各个分类水平上进行群落结构分析，依次进行物种组成分析、LEfSe（http//huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/ root？tool_id=lefse_upload）多级物种差异判别分析、COG功能注释（http：//hutten hower.sph.harvard.edu/gal-axy/root？tool_id=PICRUSt_normalize）。

（1）各组小鼠胃组织Hp感染情况比较

表6 各组小鼠胃组织Hp感染情况比较

注：与空白组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05。

模型组小鼠胃组织Hp感染的动物数较对照组明显增加；与模型组比较，阳性对照组和采取本发明冻干粉和后生元进行实验的6组小鼠胃组织Hp感染的动物数显著降低，差异均有统计学意义。

（2）各组小鼠胃黏膜IL-1β、IL-8、IFN-γ以及IL-4、IL-10含量

表7 胃黏膜IL-1β、IL-8、IFN-γ以及IL-4、IL-10含量

注：与对照组相比，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

由表7可知，与对照组相比，模型组建立后IL-1β、IL-8、IFN-γ显著增高，差异性显著（P＜0.01），采取本发明冻干粉和后生元进行实验的6组IL-1β、IL-8、IFN-γ与模型组相比，差异性显著（P＜0.01）；与模型组相比，实验6组中IL-4、IL-10两个指标差异性显著（P＜0.01）。由此说明建模成功后，小鼠服用鼠李糖乳酪杆菌GS006活菌制剂和后生元均能降低幽门螺杆菌引起的炎症反应。

（3）各组小鼠肠道菌群分析

表8 各组小鼠肠道菌群α多样性分析结果

根据表8结果可知，与对照组比较，模型组shannon指数、chao指数均降低（P＜0.01），模型组coverage指数升高（P＜0.05）；与模型组比较，采取本发明冻干粉和后生元进行实验的6组shannon指数、chao指数均升高，差异性显著（P＜0.05或P＜0.01），实验组中的高、中剂量组coverage指数降低（P＜0.05）。由此可知，鼠李糖乳酪杆菌GS066在幽门螺杆菌模型中，对小鼠肠道菌群起到很好的调节作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）GS066，其特征在于，所述鼠李糖乳酪杆菌GS066，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 29393。

2.一种提取细菌素的方法，其特征在于，包括如下步骤：权利要求1所述鼠李糖乳酪杆菌GS066接种于液体培养基中，发酵22-30h后，发酵液离心，收集上清液，于上清液中加入硫酸铵进行沉淀，离心收集沉淀，得细菌素。

3.根据权利要求2所述的提取细菌素的方法，其特征在于，所述鼠李糖乳酪杆菌GS066发酵12-18h时，于发酵体系中添加0.3-1.0g/L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸继续发酵。

4.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述鼠李糖乳酪杆菌GS066和/或权利要求2或3所述方法提取的细菌素。

5.一种冻干粉的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：权利要求1所述鼠李糖乳酪杆菌GS066接种于液体培养基中，发酵至发酵液中葡萄糖含量≤0.1g/L，发酵液离心，收集菌体与冻干保护剂混合形成乳化液，将乳化液进行冷冻干燥。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，按质量百分比计，所述冻干粉的保护剂包括：脱脂乳粉8-12%，海藻糖7-9%，甘露糖醇1-3%，吐温-80 0.08-0.12%，谷氨酸钠0.8-1.2%，维生素C 0.04-0.06%，余量为水。

7.权利要求5或6所述制备方法制备的冻干粉。

8.一种后生元的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：权利要求1所述鼠李糖乳酪杆菌GS066接种于液体培养基中，发酵12-18h时，于发酵体系中添加0.3-1.0g/L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸继续发酵，发酵结束后发酵液浓缩，干燥后即得后生元。

9.权利要求8所述制备方法制备的后生元。

10.权利要求1所述鼠李糖乳酪杆菌GS066、权利要求2或3所述方法提取的细菌素、权利要求4所述制剂、权利要求7所述冻干粉或权利要求9所述后生元在制备抑制革兰氏阴性菌产品中的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性菌包括幽门螺杆菌和大肠杆菌。