CN113170842B - 一种防治家禽坏死性肠炎的复合微生态制剂及其应用 - Google Patents

一种防治家禽坏死性肠炎的复合微生态制剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种防治家禽坏死性肠炎的复合微生态制剂及其应用，以贝莱斯芽孢杆菌、植物乳杆菌和低聚木糖为活性成分复配而成。本发明中的贝莱斯芽孢杆菌和植物乳杆菌菌株对产气荚膜梭菌、沙门氏菌和大肠杆菌等肠道病原菌有较强抑制作用，结合低聚木糖的肠道益生功能，复合使用可调节家禽肠道健康，有效防治家禽坏死性肠炎，降低养殖过程中抗生素的使用。

Description

一种防治家禽坏死性肠炎的复合微生态制剂及其应用
技术领域
本发明涉及饲料技术领域，具体地，本发明涉及一种防治家禽肠炎的复合微生态制剂的制备及其应用方法。
背景技术
家禽坏死性肠炎是一种危害严重的肠道疾病，发病急，死亡率高，对家禽养殖造成的经济损失巨大，在家禽生产中坏死性肠炎的防治十分重要。
产气荚膜梭菌是引起家禽坏死性肠炎的主要致病因子，它是一种严格厌氧菌，革兰氏染色阳性，显微镜下为梭状粗短杆菌，两端钝圆，可形成芽孢，芽孢中生或近端生，呈卵圆形。产气荚膜梭菌属于家禽肠道内的常驻菌，是一种典型的条件致病菌，正常条件下不会引起家禽坏死性肠炎。而当感染疾病、出现应激、饲养环境变差等条件下，家禽肠道微生态平衡被破坏，产气荚膜梭菌可大量繁殖，并产生大量毒素，导致坏死性肠炎的发生。根据分泌毒素不同，产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E 5种血清型，但不是所有的产气荚膜梭菌菌株都能够诱导坏死性肠炎，A型产气荚膜梭菌产生α毒素，是引起家禽坏死性肠炎的主要菌株及毒力因子，少数是由C型产气荚膜梭菌引起。
药物性饲料添加剂在防治家禽坏死性肠炎中发挥了重要作用，但随着对抗生素耐药性和抗生素残留等问题的重视，养殖减抗、饲料无抗的发展需要，益生菌、疫苗、有机酸、植物提取物、酶制剂等绿色、安全、高效的生物防治替代方法是防治产气荚膜梭菌诱导的鸡坏死性肠炎的主要方向。益生菌在肠道疾病的预防和治疗中效果显著。一方面，益生菌可以通过竞争黏附位点或产生细菌素等具有抗菌活性的物质，抑制产气荚膜梭菌的增殖或直接将其杀死。另一方面，益生菌可以改善家禽肠道微生态平衡，维持肠道健康，增强宿主免疫力，从而降低产气荚膜梭菌感染的风险。枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、植物乳杆菌、唾液乳杆菌、双歧杆菌等已报道对产气荚膜梭菌具有抑菌活性，尚未有关于贝莱斯芽孢杆菌防治家禽坏死性肠炎的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种由贝莱斯芽孢杆菌、植物乳杆菌和低聚木糖组成的复合微生态制剂。贝莱斯芽孢杆菌和植物乳杆菌菌株对产气荚膜梭菌、沙门氏菌和大肠杆菌等肠道病原菌有较强抑制作用，结合低聚木糖的肠道益生功能，复合使用可调节家禽肠道健康，有效防治家禽坏死性肠炎，降低养殖过程中抗生素的使用。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种防治家禽坏死性肠炎的复合微生态制剂，由贝莱斯芽孢杆菌(保藏编号为CGMCC19350)，植物乳杆菌(保藏编号为CGMCC NO.14459)、低聚木糖和载体组成。
优选的，所述每克复合微生态制剂中贝莱斯芽孢杆菌活菌数为1.0×109-1.0×1010CFU/g。
优选的，所述每克复合微生态制剂中植物乳杆菌活菌数为1.0×109-1.0×1010CFU/g。
优选的，所述每克复合微生态制剂中低聚木糖质量百分比含量为5％-10％。
低聚木糖又称木寡糖，是由2-7个木糖分子以β-1,4糖苷键结合而成的功能性聚合糖。
优选地，所述载体为葡萄糖或沸石粉。
本发明的复合微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
贝莱斯芽孢杆菌的生产方法步骤如下：
(1)将贝莱斯芽孢杆菌菌种接种于斜面培养基上，于30-40℃下培养12-24小时；
(2)将斜面培养的贝莱斯芽孢杆菌接种于种子活化液体培养基中，500mL三角瓶装液量为50-100mL，在30-40℃、160-220rpm的条件下培养12-24小时；
(3)将贝莱斯芽孢杆菌种子液以0.5％-2％重量比接种于种子罐中，500L种子罐装液量为100-250L，在30-40℃、160-220rpm的条件下培养12-24小时；
(4)将种子罐培养液以0.5％-2％重量比接种于发酵罐中，罐压为0.01-0.05MPa，搅拌转速为160-220rpm，以体积比计，通风比为0.5-1:0.1-0.5，发酵时间为16-24小时；
(5)将贝莱斯芽孢杆菌发酵液通过干燥塔进行喷雾干燥，鼓风机进风温度140-170℃；出口温度60-80℃，干燥后通过60目振动筛。
步骤(1)中斜面培养基组成：胰蛋白胨5.0-15.0g，牛肉浸粉1.0-5.0g，氯化钠1.0-5.0g，葡萄糖1.0-5.0g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH为7.0-7.5；
步骤(2)中种子培养基为步骤(1)斜面培养基中去除琼脂粉；
步骤(3)中种子罐培养基和步骤(4)中发酵培养基组成：大豆蛋白胨0.5％-2.0％，豆饼粉0.5％-2.0％，葡萄糖1.0％-1.5％，玉米粉0.5％-2.0％，碳酸钙0.5％-2.0％，硫酸镁0.001％-0.01％和硫酸锰0.001％-0.01％，pH为7.0-7.5。
本发明植物乳杆菌的生产方法包括如下步骤：
(1)将植物乳杆菌接种于斜面培养基上，在30-40℃有氧或兼性条件下培养24-36小时；
(2)将斜面培养的植物乳杆菌接种于液体种子活化培养基中，在30-40℃有氧或兼性条件下培养24-36小时；
(3)将步骤(2)所获得的种子液接种于发酵罐培养基，在30-40℃有氧或兼性条件静置培养24-36小时；
(4)将植物乳杆菌发酵液离心浓缩后加入保护剂，冻干后粉碎后通过60目振动筛。
步骤(1)中斜面培养基组成：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，碳酸钙6.0g，琼脂粉16g，蒸馏水1000mL，121℃，灭菌30min；
步骤(2)中种子培养基为斜面培养基中去除琼脂粉；
步骤(3)中发酵培养基组成：胰蛋白胨0.5％-3.0％，牛肉浸粉0.1％-0.5％，酵母粉0.1％-0.5％，葡萄糖1.0％-5.0％，碳酸钙0.5％-2.0％，乙酸钠0.1％-1.0％g，柠檬酸二胺0.001％-0.10％，Tween80 0.001％-0.10％，磷酸氢二钾0.001％-0.10％，硫酸镁0.001％-0.10％，硫酸锰0.001％-0.10％，调节pH值5.0-7.0。
将贝莱斯芽孢杆菌、植物乳杆菌和低聚木糖混合，以沸石粉或葡萄糖为载体，混合后贝莱斯芽孢杆菌活菌数为1.0×109-1.0×1010CFU/g，植物乳杆菌活菌数为1.0×109-1.0×1010CFU/g，低聚木糖含量为5％-10％(w低聚木糖/w总)。
本发明还提供一种防治家禽坏死性肠炎的复合微生态制剂的应用方法，将复合微生态制剂按照0.05％-0.2％添加质量加入到家禽饲料或按照0.01％-0.1％添加质量加入饮水中，可以抑制或杀灭产气荚膜梭菌、沙门氏菌和大肠杆菌等肠道病原菌，调节家禽肠道健康，有效防治家禽坏死性肠炎，降低养殖过程中抗生素的使用。
本发明的贝莱斯芽孢杆菌CA03062(Bacillus velezensis)已于2020年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏编号为CGMCC NO.19350。植物乳杆菌CB09015(Lactobacillus plantarum)已于2017年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.14459。
附图说明
图1是不同菌株以产气荚膜梭菌为病原指示菌的抑菌作用比较；
图2是不同菌株以沙门氏菌为病原指示菌的抑菌作用比较；
图3是不同菌株以大肠杆菌为病原指示菌的抑菌作用比较。
具体实施方式
下面以附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1产气荚膜梭菌、沙门氏菌和大肠杆菌拮抗菌种的筛选及鉴定
1材料方法
1.1试验材料
1.1.1菌种
产气荚膜梭菌，肠沙门氏菌肠亚种和大肠杆菌购自中国工业微生物菌种保藏中心，益生菌菌株由北京科为博生物技术研究院分离保藏。
1.1.2培养基
(1)胰胨-亚硫酸盐培养基
胰蛋白胨15.0g，大豆蛋白胨5.0g，酵母粉5.0g，焦亚硫酸钠1.0g，柠檬酸铁铵1.0g，pH7.6±0.2，灭菌30min。
固体培养基：在液体培养基基础上添加1.6％琼脂粉。
(2)LB培养基
胰蛋白胨10.0g，酵母浸粉5.0g，氯化钠10.0g，加蒸馏水至1000mL，pH7.0±0.1，121℃，灭菌30min。
固体培养基：在液体培养基基础上添加1.6％琼脂粉。
1.2试验方法
1.2.1产气荚膜梭菌、沙门氏菌和大肠杆菌拮抗菌株的筛选
(1)病原指示菌菌种的活化
将产气荚膜梭菌菌种接种于胰胨-亚硫酸盐液体培养基中，42℃厌氧培养12h后，菌液呈黑色，备用。将沙门氏菌和大肠杆菌菌种分别接种到LB液体培养基中，在37℃、180rpm条件下振荡培养16h，备用。
(2)益生菌培养物上清的制备
将益生菌菌种分别接种到LB液体培养基中，在37℃、180rpm条件下振荡培养24h。然后将培养液在3500rpm条件下离心10min，放入4℃冰箱备用。
(3)病原指示菌平板的制备
移取约5mL胰胨-亚硫酸盐琼脂培养基或LB琼脂培养基，顺时针转动使培养基平铺平板底部，待凝固，用无菌镊子在平板底部依次对称摆放4个牛津杯。将产气荚膜梭菌菌悬液与已融化冷却至50℃的胰胨-亚硫酸盐琼脂培养基按1:100比例混匀，将沙门氏菌和大肠杆菌分别与已融化冷却至50℃的LB琼脂培养基按1:100比例混匀，分别移取约15mL含菌培养基至对应摆有牛津杯的培养皿内，待冷却凝固后，用无菌镊子将牛津杯剔除。
(4)上样
分别移取100μL益生菌培养物上清液于指示菌平板的牛津杯杯孔内，注意避免液体溢出或外溅。
(5)培养
将上完样的培养皿室温静置1-2h，然后将产气荚膜梭菌指示菌平板在42℃厌氧培养16-20h，沙门氏菌和大肠杆菌指示菌平板在37℃培养16-20h。
(6)观察、测量
拍照，用游标卡尺测量各抑菌圈的直径并记录。
1.2.2产气荚膜梭菌、沙门氏菌和大肠杆菌拮抗菌株的鉴定
16SrRNA基因和gyrB基因序列分析：细菌总DNA的提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取。16SrRNA基因扩增引物为：27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT，gyrB基因扩增引物为：gyrBF：5'–GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'；gyrBR：5'–AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'。反应体系(20μL)：1μLDNA模板、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、0.2μL Easy Taq、2μL dNTPs、2μL 10×Easy Taq Buffer、14μL ddH2O，以上成分于冰上添加，混匀后离心；PCR反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，32个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后送北京生工有限公司进行序列测定。得到的基因序列在GenBank数据库中进行BLAST同源性比对。
2结果
2.1产气荚膜梭菌、沙门氏菌和大肠杆菌拮抗菌株的筛选
筛选得到的菌株CA03062和CB09015对产气荚膜梭菌的抑制作用最强，抑菌直径分别为23.14mm、17.06mm，同时对沙门氏菌和大肠杆菌均具有较强抑制作用，如表1所示，抑菌效果图见附图1-3。
表1抑菌直径
Figure BDA0003039718110000061
2.2菌株的鉴定
CA03062菌gyrB基因序列(SEQ NO.1)：
ccaagtgggctcttgacgttacggttcatcgtgacgggaaaatccactatcaggcgtacgagcgcggtgtacctgtggctgatcttgaagtgatcggcgaaactgataagaccggaacgattacgcacttcgttccggacccggaaattttcaaagaaacaactgtatatgactatgatctgctttcaaacctgttccgggaattggccttcctgacaaaaggcgtaaacatcacgattgaagacaaacgtgaaggacaagaacggaaaaacgagtaccactacaaaggcggaatcaaaagctatgttgagtacttaaaccgttccaaagaagtcgttcatgaagagccgatttatatcgaaggcgagaaagacggcataacggttgaagttgcattgcaatacaacgacagctatacaagcaatatttattctttcacaaataatatcaacacatacgaaggcggcacgcacgaggccggatttaaaaccggtctgacccgtgtcataaacgactatgcaagaagaaaggggattttcaaagaaaatgatccgaatttaagcggggatgatgtgagagaagggctgactgccattatttcaattaagcaccctgatccgcaattcgaagggcagacgaaaacgaagctcggcaactccgaagcgagaacgatcactgatacgctgttttcttctgcgctggaaacattccttcttgaaaatccggactcagcccgcaaaatcgttgaaaaaggtttaatggccgcaagagcgcggatggcggcgaaaaaagcgcgggaattgacccggcgcaaaagtgcgcttgagatttccaatctgccgggcaaactggcggactgttcttctaaagatccgagcatttccgagctgtatatcgtagaggtgaatctctggcggggaa；
CA03062菌16SrRNA基因序列(SEQ NO.2)：
aggttacctcaccgacttcgggtgttaaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatctctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgaccgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccctaacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcactcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagacttaagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgtcgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccgcgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtctgaaccatgcggttcaaacaaccatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacccacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctccc；
CB09015菌16SrRNA基因序列(SEQ NO.3)：
tgcaagtcgaacgaactctggtattgattggtgcttgcatcatgatttacatttgagtgagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccagaagcgggggataacacctggaaacagatgctaataccgcataacaacttggaccgcatggtccgagtttgaaagatggcttcggctatcacttttggatggtcccgcggcgtattagctagatggtggggtaacggctcaccatggcaatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactctgttgttaaagaagaacatatctgagagtaactgttcaggtattgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccataccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacatggatacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaactcgcgagagtaagctaatctcttaaagccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttttaggaaccagccg。
通过16SrRNA和gyrB基因序列测定及序列分析，CA03062菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，CB09015菌株鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。菌株分别于2020年1月13日、2017年7月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为分别为CGMCC NO.19350和CGMCC NO.14459。
实施例2复合微生态制剂的制备
1.贝莱斯芽孢杆菌的生产方法步骤如下：
(1)将贝莱斯芽孢杆菌菌种接种于斜面培养基上，于30-40℃下培养12-24小时；
(2)将斜面培养的贝莱斯芽孢杆菌接种于种子活化液体培养基中，在30-40℃、160-220rpm的条件下培养12-24小时；
(3)将贝莱斯芽孢杆菌种子液以0.5％-2％重量比接种于种子罐中，在30-40℃、160-220rpm的条件下培养12-24小时；
(4)将种子罐培养液以0.5％-2％重量比接种于发酵罐中，罐压为0.01-0.05MPa，搅拌转速为160-220rpm，以体积比计，通风比为0.5-1:0.1-0.5，发酵时间为16-24小时；
(5)将贝莱斯芽孢杆菌发酵液通过干燥塔进行喷雾干燥，鼓风机进风温度140-170℃；出口温度60-80℃，干燥后过筛。
步骤(1)中斜面培养基组成：胰蛋白胨5.0-15.0g，牛肉浸粉1.0-5.0g，氯化钠1.0-5.0g，葡萄糖1.0-5.0g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH为7.0-7.5；
步骤(2)中种子培养基为步骤(1)斜面培养基中去除琼脂粉；
步骤(3)中种子罐培养基和步骤(4)中发酵培养基组成：大豆蛋白胨0.5％-2.0％，豆饼粉0.5％-2.0％，葡萄糖1.0％-1.5％，玉米粉0.5％-2.0％，碳酸钙0.5％-2.0％，硫酸镁0.001％-0.01％和硫酸锰0.001％-0.01％，pH为7.0-7.5。
2.本发明植物乳杆菌的生产方法包括如下步骤：
(1)将植物乳杆菌接种于斜面培养基上，在30-40℃有氧或兼性条件下培养24-36小时；
(2)将斜面培养的植物乳杆菌接种于液体种子活化培养基中，在30-40℃有氧或兼性条件下培养24-36小时；
(3)将步骤(2)所获得的种子液接种于发酵罐培养基，在30-40℃有氧或兼性条件静置培养24-36小时；
(4)将植物乳杆菌发酵液离心浓缩后加入保护剂，冻干后粉碎后过筛。
步骤(1)中斜面培养基组成：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，碳酸钙6.0g，琼脂粉16g，蒸馏水1000mL，121℃，灭菌30min；
步骤(2)中种子培养基为斜面培养基中去除琼脂粉；
步骤(3)中发酵培养基组成：胰蛋白胨0.5％-3.0％，牛肉浸粉0.1％-0.5％，酵母粉0.1％-0.5％，葡萄糖1.0％-5.0％，碳酸钙0.5％-2.0％，乙酸钠0.1％-1.0％g，柠檬酸二胺0.001％-0.10％，Tween80 0.001％-0.10％，磷酸氢二钾0.001％-0.10％，硫酸镁0.001％-0.10％，硫酸锰0.001％-0.10％，调节pH值5.0-7.0。
3.将贝莱斯芽孢杆菌、植物乳杆菌和低聚木糖混合，以沸石粉或葡萄糖为载体，混合后贝莱斯芽孢杆菌活菌数为1.0×109-1.0×1010CFU/g，植物乳杆菌活菌数为1.0×109-1.0×1010CFU/g，低聚木糖含量为5％-10％(w低聚木糖/w总)。
实施例3复合微生态制剂对肉鸡生长性能和肠道菌群的影响
1试验材料
贝莱斯芽孢杆菌、植物乳杆菌和复合微生态制剂产品由北京科为博生物科技有限公司生产提供，产气荚膜梭菌购自中国工业微生物菌种保藏中心。
2试验方法
2.1试验分组设计及饲养管理
选用1日龄健康快大型肉仔鸡720只，随机分为5个试验组，每个试验组8个重复，每个重复18只鸡，对照组和攻毒组饲喂玉米豆粕基础日粮，贝莱斯芽孢杆菌组在玉米豆粕基础日粮中添加0.1％贝莱斯芽孢杆菌产品，植物乳杆菌组在玉米豆粕基础日粮中添加0.1％植物乳杆菌产品，复合微生态制剂组在玉米豆粕基础日粮中添加0.1％复合微生态制剂产品，攻毒组、贝莱斯芽孢杆菌组、植物乳杆菌组和复合微生态制剂组在饲喂3周后连续3天经口灌服产气荚膜梭菌活化菌液(1.0×108CFU/天)。试验周期共计42d。在试验开始前一周，对鸡舍进行彻底的熏蒸消毒。肉鸡采用平养，常规饲养管理，自由采食和饮水。鸡只免疫按鸡场常规程序进行新城疫、传染性支气管炎和法氏囊疫苗接种。
2.2测定指标及方法
在试验开始时，以重复为单位准确称取1日龄每重复鸡只重量；在试验第42天以重复为单位称取试验鸡体重和耗料量，计算增重、耗料量和料重比。攻毒试验结束后1周，每组分别随机选取5只肉鸡，采集盲肠及内容物样品，置于无菌冷藏盒中保存，分别测定盲肠内容物中乳酸菌、产气荚膜梭菌和大肠菌群的含量。
3试验结果
(1)对肉鸡生长性能的影响
如表1所示，与对照组和攻毒组相比，贝莱斯芽孢杆菌组、植物乳杆菌组和复合微生态制剂组的耗料量和体增重均显著提高(P﹤0.05)，其中复合微生态制剂组体增重较对照组和攻毒组分别提高了2.34％、6.46％(P﹥0.05)；与攻毒组相比，其它各组料重比均显著降低(P﹤0.05)。结果表明，添加贝莱斯芽孢杆菌组、植物乳杆菌组和复合微生态制剂能够能够消除产气荚膜梭菌攻毒对肉鸡的影响，可显著提高肉鸡生长性能，其中以复合微生态制剂组效果最优，优于贝莱斯芽孢杆菌组和植物乳杆菌组的效果之和，复合微生态制剂中各组分存在协同增效的作用。
表1对肉鸡生长性能的影响
Figure BDA0003039718110000101
注：同行肩标不同小写字母表示差异显著(P﹤0.05)，有相同字母表示差异不显著(P﹥0.05)，下同。
(2)对肉鸡肠道菌群的影响
如表2所示，贝莱斯芽孢杆菌组、植物乳杆菌组和复合微生态制剂组盲肠内容物中乳酸菌含量显著高于攻毒组和对照组(P﹤0.05)，产气荚膜梭菌和大肠杆菌含量显著低于攻毒组(P﹤0.05)。由此可知，在基础日粮中添加复合微生态制剂能够有效抑制产气荚膜梭菌和大肠杆菌等肠道病原菌的增殖，有利于乳酸菌等有益菌的繁殖。
表2对肉鸡肠道菌群的影响
Figure BDA0003039718110000102
4结论
试验结果表明由贝莱斯芽孢杆菌、植物乳杆菌和低聚木糖组成的复合微生态制剂能够有效抑制产气荚膜梭菌和大肠杆菌等肠道病原菌的繁殖，改善肉鸡肠道菌群，保持肠道健康，能够显著提高肉鸡的生产性能。
本发明的工艺参数(如温度、时间等)区间上下限取值以及区间值都能实现本法，在此不一一列举实施例。
本发明未详细说明的内容均可采用本领域的常规技术知识。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。尽管参照实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解，对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，都不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 北京科为博生物科技有限公司
<120> 一种防治家禽坏死性肠炎的复合微生态制剂及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 921
<212> DNA
<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)
<400> 1
ccaagtgggc tcttgacgtt acggttcatc gtgacgggaa aatccactat caggcgtacg 60
agcgcggtgt acctgtggct gatcttgaag tgatcggcga aactgataag accggaacga 120
ttacgcactt cgttccggac ccggaaattt tcaaagaaac aactgtatat gactatgatc 180
tgctttcaaa cctgttccgg gaattggcct tcctgacaaa aggcgtaaac atcacgattg 240
aagacaaacg tgaaggacaa gaacggaaaa acgagtacca ctacaaaggc ggaatcaaaa 300
gctatgttga gtacttaaac cgttccaaag aagtcgttca tgaagagccg atttatatcg 360
aaggcgagaa agacggcata acggttgaag ttgcattgca atacaacgac agctatacaa 420
gcaatattta ttctttcaca aataatatca acacatacga aggcggcacg cacgaggccg 480
gatttaaaac cggtctgacc cgtgtcataa acgactatgc aagaagaaag gggattttca 540
aagaaaatga tccgaattta agcggggatg atgtgagaga agggctgact gccattattt 600
caattaagca ccctgatccg caattcgaag ggcagacgaa aacgaagctc ggcaactccg 660
aagcgagaac gatcactgat acgctgtttt cttctgcgct ggaaacattc cttcttgaaa 720
atccggactc agcccgcaaa atcgttgaaa aaggtttaat ggccgcaaga gcgcggatgg 780
cggcgaaaaa agcgcgggaa ttgacccggc gcaaaagtgc gcttgagatt tccaatctgc 840
cgggcaaact ggcggactgt tcttctaaag atccgagcat ttccgagctg tatatcgtag 900
aggtgaatct ctggcgggga a 921
<210> 2
<211> 1381
<212> DNA
<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)
<400> 2
aggttacctc accgacttcg ggtgttaaaa ctctcgtggt gtgacgggcg gtgtgtacaa 60
ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat tccagcttca 120
cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga tttgtgggat tggcttaacc 180
tcgcggtttc gctgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg tgtgtagccc aggtcataag 240
gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc agtcacctta 300
gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg cgctcgttgc gggacttaac 360
ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcactc tgcccccgaa 420
ggggacgtcc tatctctagg attgtcagag gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt 480
tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt 540
ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat gcgttagctg cagcactaag 600
gggcggaaac cccctaacac ttagcactca tcgtttacgg cgtggactac cagggtatct 660
aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag ttacagacca gagagtcgcc 720
ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc gctacacgtg gaattccact 780
ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc tccccggttg agccgggggc 840
tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac gcccaataat tccggacaac 900
gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc tttctggtta 960
ggtaccgtca aggtgccgcc ctatttgaac ggcacttgtt cttccctaac aacagagctt 1020
tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc gtcagacttt cgtccattgc 1080
ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt cccagtgtgg 1140
ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg tgagccgtta cctcaccaac 1200
tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga agccaccttt tatgtctgaa 1260
ccatgcggtt caaacaacca tccggtatta gccccggttt cccggagtta tcccagtctt 1320
acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct aacatcaggg agcaagctcc 1380
c 1381
<210> 3
<211> 1434
<212> DNA
<213> 植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
<400> 3
tgcaagtcga acgaactctg gtattgattg gtgcttgcat catgatttac atttgagtga 60
gtggcgaact ggtgagtaac acgtgggaaa cctgcccaga agcgggggat aacacctgga 120
aacagatgct aataccgcat aacaacttgg accgcatggt ccgagtttga aagatggctt 180
cggctatcac ttttggatgg tcccgcggcg tattagctag atggtggggt aacggctcac 240
catggcaatg atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc cacattggga ctgagacacg 300
gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacga aagtctgatg 360
gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa aactctgttg ttaaagaaga 420
acatatctga gagtaactgt tcaggtattg acggtattta accagaaagc cacggctaac 480
tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt 540
aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cttcggctca accgaagaag 600
tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg 660
tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact 720
gacgctgagg ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccatacc 780
gtaaacgatg aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gctaacgcat 840
taagcattcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagctac gcgaagaacc ttaccaggtc 960
ttgacatact atgcaaatct aagagattag acgttccctt cggggacatg gatacaggtg 1020
gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080
acccttatta tcagttgcca gcattaagtt gggcactctg gtgagactgc cggtgacaaa 1140
ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200
tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga actcgcgaga gtaagctaat ctcttaaagc 1260
cattctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat 1320
cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380
catgagagtt tgtaacaccc aaagtcggtg gggtaacctt ttaggaacca gccg 1434

Claims (8)

1.一种防治家禽坏死性肠炎的复合微生态制剂，其特征在于，所述复合微生态制剂由贝莱斯芽孢杆菌、植物乳杆菌、低聚木糖和载体组成；贝莱斯芽孢杆菌的保藏编号为CGMCCNO.19350，植物乳杆菌的保藏编号为CGMCC NO.14459；
复合微生态制剂中贝莱斯芽孢杆菌活菌数为1.0×109-1.0×1010CFU/g，植物乳杆菌活菌数为1.0×109-1.0×1010CFU/g，低聚木糖占总质量的5％-10％。
2.根据权利要求1所述的一种防治家禽坏死性肠炎的复合微生态制剂，其特征在于，所述载体为葡萄糖或沸石粉。
3.根据权利要求1所述的一种防治家禽坏死性肠炎的复合微生态制剂，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌的生产方法包括如下步骤：
(1)将贝莱斯芽孢杆菌菌种接种于斜面培养基上，于30-40℃下培养12-24小时；
(2)将斜面培养的贝莱斯芽孢杆菌接种于种子活化液体培养基中，在30-40℃、160-220rpm的条件下培养12-24小时；
(3)将贝莱斯芽孢杆菌种子液以0.5-2％重量比接种于种子罐中，在30-40℃、160-220rpm的条件下培养12-24小时；
(4)将种子罐培养液以0.5-2％重量比接种于发酵罐中，罐压为0.01-0.05MPa，搅拌转速为160-220rpm，以体积比计，通风比为0.5-1:0.1-0.5，发酵时间为16-24小时；
(5)将贝莱斯芽孢杆菌发酵液通过干燥塔进行喷雾干燥，鼓风机进风温度140-170℃；出口温度60-80℃，干燥后过筛。
4.根据权利要求3所述的一种防治家禽坏死性肠炎的复合微生态制剂，其特征在于，
步骤(1)中斜面培养基组成：胰蛋白胨5.0-15.0g，牛肉浸粉1.0-5.0g，氯化钠1.0-5.0g，葡萄糖1.0-5.0g，琼脂粉15-20g，蒸馏水1000mL，pH为7.0-7.5；
步骤(2)中种子培养基为步骤(1)斜面培养基中去除琼脂粉；
步骤(3)中种子罐培养基和步骤(4)中发酵培养基组成：大豆蛋白胨0.5％-2.0％，豆饼粉0.5％-2％，葡萄糖1.0％-1.5％，玉米粉0.5％-2％，碳酸钙0.5％-2％，硫酸镁0.001％-0.01％和硫酸锰0.001％-0.01％，pH为7.0-7.5。
5.根据权利要求1所述的一种防治家禽坏死性肠炎的复合微生态制剂，其特征在于，所述植物乳杆菌的生产方法包括如下步骤：
(1)将植物乳杆菌接种于斜面培养基上，在30-40℃有氧或兼性条件下培养24-36小时；
(2)将斜面培养的植物乳杆菌接种于液体种子活化培养基中，在30-40℃有氧或兼性条件下培养24-36小时；
(3)将步骤(2)所获得的种子液接种于发酵罐培养基，在30-40℃有氧或兼性条件静置培养24-36小时；
(4)将植物乳杆菌发酵液离心浓缩后加入保护剂，冻干后粉碎后过筛。
6.根据权利要求5所述的一种防治家禽坏死性肠炎的复合微生态制剂，其特征在于，
所述步骤(1)中斜面培养基组成：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，碳酸钙6.0g，琼脂粉16g，蒸馏水1000mL，121℃，灭菌30min；
步骤(2)中种子培养基为斜面培养基中去除琼脂粉；
步骤(3)中发酵培养基组成：胰蛋白胨0.5％-3.0％，牛肉浸粉0.1％-0.5％，酵母粉0.1％-0.5％，葡萄糖1.0％-5.0％，碳酸钙0.5％-2.0％，乙酸钠0.1％-1.0％g，柠檬酸二胺0.001％-0.10％，Tween80 0.001％-0.10％，磷酸氢二钾0.001％-0.10％，硫酸镁0.001％-0.10％，硫酸锰0.001％-0.10％，调节pH值5.0-7.0。
7.一种防治家禽坏死性肠炎的饲料，其特征在于，所述饲料包括权利要求1-6任一项所述的复合微生态制剂。
8.一种权利要求7所述饲料的制备方法，所述制备方法为：
将复合微生态制剂加入到饲料中，混合均匀，其添加量为饲料重量的0.05％-0.2％；或者，将复合微生态制剂加入到饮水中，混合均匀，其添加量为0.01％-0.1％。
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